趙曉娟 劉婧洋 魏詠新 張西萌 馬丹 魏海燕*

（1.中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心 北京 100026；2.首都醫(yī)科大學燕京醫(yī)學院）

0 引言

近年來，食品中致病菌的抗生素耐藥性問題引起全球廣泛關(guān)注。陳君石院士指出“食品中致病菌的高耐藥性和多重耐藥性必須引起足夠警惕，因為這可能是人體產(chǎn)生多重耐藥性的一種重要途徑”。2017 年，世界衛(wèi)生組織公布了首份亟需新型抗生素治療的重點病原體清單，其中大腸埃希菌排名第三位[1]。根據(jù)最新發(fā)布的全國耐藥監(jiān)測報告，大腸埃希氏菌在分離的革蘭氏陰性菌中占據(jù)首位。食物鏈是耐藥菌的重要傳播途經(jīng)，監(jiān)測食品中大腸埃希菌的耐藥性迫在眉睫。食品生產(chǎn)加工過程中的藥物使用情況，以及市售抗生素的監(jiān)管嚴格程度[2]，均會對大腸埃希菌的耐藥性產(chǎn)生影響。

常規(guī)藥敏試驗方法包括擴散法、稀釋法、E-test法，但這些均存在培養(yǎng)時間長、結(jié)果判斷易受影響等問題，本實驗采用Sensititre 快速藥敏檢測系統(tǒng)，基于微量肉湯稀釋法原理，利用熒光技術(shù)測定菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值進行研究。近年來，已有從家禽家畜中分離出大量產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-Lactamase，ESBLs）大腸埃希菌的報道[3]。產(chǎn)ESBLs 的菌株不僅對青霉素和頭孢菌素表現(xiàn)出耐藥性，而且對各種抗生素表現(xiàn)出多重耐藥性。現(xiàn)有對大腸埃希菌的耐藥報道主要源于臨床和國內(nèi)食品分離菌株，為了解進出口食品中大腸埃希氏菌的耐藥情況，現(xiàn)針對本實驗室近年從北京口岸進出口禽畜類動物食品中分離的111 株大腸埃希氏菌進行耐藥性分析，以期為監(jiān)管部門制定相關(guān)政策及評估干預(yù)措施的有效性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分離自家禽類、家畜類食品中的大腸埃希菌111 株，均為中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心食品安全研究所保存。其中，家禽來源51 株、家畜來源60 株；進口食品來源42 株，出口食品來源69 株。

Sensititre 肉湯培養(yǎng)基（美國賽默飛公司）；Sensititre去離子水（美國賽默飛公司）；0.5 McFarland 聚合物濁度標準品（美國賽默飛公司）；腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHI，北京陸橋科技股份有限公司）；食源性監(jiān)測定制藥敏板CHNM4F、CHN2FGNF、CHN1VGNF（美國賽默飛公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C-1 全溫振蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠）；430-A AIM 全自動加樣儀（96 孔板接種儀，美國賽默飛公司）；Nephelometer 麥氏比濁儀（美國賽默飛公司）；Sensititre OptiRead 微生物鑒定和藥敏分析儀（美國賽默飛公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

將儲存于-80℃冰箱的菌株以平板劃線法接種于BHI 平板，36℃培養(yǎng)24 h?；罨? 代。

1.3.2 肉湯菌懸液制備

挑取3～4 個單菌落于生理鹽水中，用Thermo scientific Nephelometer 麥氏比濁儀調(diào)至0.5 麥氏比濁度，取10 μL 菌懸液于肉湯培養(yǎng)基中混勻備用。

1.3.3 藥敏板制備

應(yīng)用Thermo scientific 430-A AIM 全自動加樣儀（96 孔板接種儀），將加入菌懸液的肉湯培養(yǎng)基置于藥敏板中，每孔50 μL，覆膜，35℃培養(yǎng)24 h。

1.3.4 藥敏結(jié)果讀取

應(yīng)用Thermo scientific OptiRead 藥敏分析系統(tǒng)以及Sensititre SWIN 藥敏分析軟件，對大腸埃希氏菌進行藥物敏感性分析，選取33 種藥物進行測試，具體用藥種類見圖1。

圖1 北京口岸分離的大腸埃希菌耐藥百分比Fig.1 Percentage of drug-resistant Escherichia coli isolated at Beijing port

質(zhì)控方法及結(jié)果判定：按照上述大腸埃希氏菌藥敏實驗操作方法，使用標準菌株大腸埃希菌ATC C25922 進行質(zhì)控試驗，再根據(jù)Thermo scientific OptiRead 藥敏鑒定技術(shù)以及Sensititre SWIN 藥敏分析軟件系統(tǒng)，判定質(zhì)控菌株的MIC 結(jié)果是否符合標準菌株的范圍，確定結(jié)果符合范圍后，方可認定所檢測的大腸埃希氏菌對抗生素的耐藥性準確有效。

1.3.5 ESBLs 確認實驗

采用紙片擴散法同時對頭孢噻肟30 μg、頭孢噻肟/克拉維酸30/10 μg、頭孢他啶30 μg、頭孢他啶/克拉維酸30/10 μg 進行藥物敏感性測試，在任一頭孢他啶、頭孢噻肟中添加克拉維酸后，將其抑菌圈直徑與未添加克拉維酸的抑菌圈相比，增大值≥5 mm時，即可判定為ESBLs。

質(zhì)控方法及結(jié)果判定：按照上述ESBLs 判定實驗操作方法，使用菌株大腸埃希菌ATCC25922 進行質(zhì)控試驗，所測試藥物聯(lián)合克拉維酸后的抑菌圈直徑與單藥抑菌圈相比，增大值≤2 mm。

1.3.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用卡方檢驗和fisher 精確法分析檢測結(jié)果的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥表型分析

采用微量肉湯稀釋法對111 株北京口岸分離的食源性大腸埃希菌進行耐藥表型分析，結(jié)果顯示，88株大腸埃希菌有耐藥性，耐藥率為79.3%；對頭孢氨芐耐藥率最高，耐藥率為62.2%；四環(huán)素、萘啶酸、復(fù)方新諾明耐藥率在25%～35%之間；未檢出厄他培南、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、替加環(huán)素、頭孢他啶/阿維巴坦、呋喃妥因耐藥（見圖1）。

2.2 家禽、家畜來源大腸埃希菌的耐藥率比較

家禽和家畜來源的大腸埃希菌對頭孢氨芐的耐藥率均為最高（59.4%、73%），家畜源性大腸埃希氏菌對四環(huán)素耐藥率高達67.6%，對復(fù)方新諾明、萘啶酸、氨芐西林等藥物的耐藥率均在40%以上，對氯霉素、氟苯尼考、慶大霉素的耐藥率在20%～35%之間，而家禽源性大腸埃希氏菌除頭孢氨芐外，其余藥物的耐藥率均在40%以下，對萘啶酸耐藥率約為37.5%，對四環(huán)素、氨芐西林、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星等藥物的耐藥率保持在28%左右，此外，兩類不同來源大腸埃希氏菌對頭孢菌素類、多黏菌素類均較為敏感（多數(shù)耐藥率在10%左右及以下），未檢測到厄他培南、美羅培南、亞胺培南耐藥。在所有藥物中，家畜源性大腸埃希氏菌對有11 種藥物的耐藥率高于家禽源，其中復(fù)方新諾明、氯霉素、多西環(huán)素統(tǒng)計學差異顯著（P＜0.05），四環(huán)素差異極顯著（P＜0.01）；而家禽源性大腸埃希氏菌對其余15 種藥物的抗藥性均大于家畜源，但尚未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異（見表2）。

表2 家禽、家畜來源大腸埃希菌耐藥率比較[株（%）]Table 2 Comparison of antibiotic resistance rates of Escherichia coli from poultry and livestock sources[strains（%）]

2.3 進口食品與出口食品中大腸埃希菌的耐藥率比較

在111 株食品分離的大腸埃希菌中，有69 株源自出口食品，42 株源自進口食品。69 株境內(nèi)食品中分離的大腸埃希菌對頭孢氨芐耐藥率最高，達66.7%，對四環(huán)素、萘啶酸、復(fù)方新諾明、氨芐西林耐藥率在40%左右，而對米諾環(huán)素、頭孢西丁、頭孢類藥物（除頭孢氨芐外）表現(xiàn)較為敏感，耐藥率在10%及以下，未檢出厄他培南、亞胺培南、替加環(huán)素、阿米卡星、頭孢他啶/阿維巴坦等藥物的耐藥。在42 株進口食品中分離的大腸埃希菌中，發(fā)現(xiàn)有抗藥性的大腸埃希菌菌株較少，在進口食品中分離的大腸埃希菌對頭孢氨芐的耐藥率為54.8%、四環(huán)素的耐藥率為16.67%、萘啶酸耐藥率為14.29%，其余均低于10%。除米諾環(huán)素外，國內(nèi)源大腸埃希菌對某一抗生素的耐藥率高于國外源大腸埃希菌，對氨芐西林、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星的耐藥率差異較大，且發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學意義（見表3）。

表3 進口、出口食品中大腸埃希菌耐藥率比較[株（%）]Table 3 Comparison of resistance rates of Escherichia coli in imported and exported foods [strains（%）]

2.4 多重耐藥結(jié)果

111 株北京口岸食品中分離的大腸埃希菌中有38 株表現(xiàn)為多重耐藥性（34.2%）（見圖2），其中耐3～5 種藥物的大腸埃希菌有12 株，耐6～8 種藥物的大腸埃希菌有7 株，耐10～13 種藥物的大腸埃希菌有6 株，耐16～24 種藥物的有5 株，耐9 種藥物的大腸埃希菌最多，共有8 株，占多重耐藥菌株的22.2%，未檢測到耐全部藥物的大腸埃希菌。有23 株大腸埃希菌對全部藥物敏感，有9 株來自國內(nèi)（13%，9/69），14 株來自國外（33.3%，14/42），12 株分離自家禽（23.5%，12/51），11 株分離自家畜（18.3%，11/60）。從禽畜來源角度分析，家禽源性大腸埃希菌中多重耐藥菌株占比25.5%，家畜類大腸埃希菌中多重耐藥菌株占比41.7%，多重耐藥在家禽家畜之間尚未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學意義。從進出口食品來源角度看，在42 株進口源大腸埃希菌中，僅發(fā)現(xiàn)4 株多重耐藥菌，占9.5%，而國內(nèi)源多重耐藥大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株為34 株，占49.2%，以耐9 種藥物的菌株較多，且進出口之間發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

圖2 北京口岸分離大腸埃希菌多重耐藥分布情況Fig.2 Distribution of multidrug-resistant Escherichia coli isolated at Beijing Port

2.5 食源性大腸埃希菌ESBLs 檢測結(jié)果及耐藥率比較

經(jīng)ESBLs 確證實驗發(fā)現(xiàn)，在111 株大腸埃希菌中ESBLs 檢出率為8.2%。9 株ESBLs 中的藥敏表型結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢噻肟等耐藥率為100%，對頭孢噻呋、西環(huán)素以及復(fù)方新諾明也保持著較高的耐藥率。除氯霉素外，產(chǎn)ESBLs 的大腸埃希菌對比其他26 種藥物的耐藥率均要高于非產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌（見表4）。頭孢西丁、頭孢氨芐、氟苯尼考、米諾環(huán)素、萘啶酸5 種藥物差異顯著（P＜0.05）外，其余20 種藥物差異極顯著（P＜0.01）。在9 株確認的大腸埃希菌中，有8 株來自于國內(nèi)，家禽家畜來源各4 株，1 株來自于進境食品，為家畜源。非產(chǎn)ESBLs 大腸埃希多以耐1 種藥物為主（40.6%），而產(chǎn)ESBLs 的大腸埃希菌均發(fā)生了多重耐藥，其中多以耐13 種抗生素為主（33.3%）（見圖3），產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌分離株對3 種以下抗生素的耐藥明顯低于非產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌（P＜0.01），但對3 種以上的抗生素耐藥顯著高于非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌（P＜0.01），由此可見產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌不僅有較高的耐藥率且多重耐藥情況嚴重。

表4 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌耐藥率的比較（株）Table 4 Comparison of antibiotic resistance rates between ESBLs producing and non ESBLs producing Escherichia coli（strains）

圖3 產(chǎn)/非產(chǎn)ESBLs 多重耐藥比較Fig.3 Comparison of multiple drug resistance between ESBLs produced and non produced

3 討論與結(jié)論

此次從北京口岸出口食品中分離的69 株大腸埃希菌，耐藥株約占87%，對四環(huán)素、萘啶酸、復(fù)方新諾明、氨芐西林等耐藥率較高，約為40%～45%。與國內(nèi)其他地區(qū)分離菌株相比[4-6]，此次從北京口岸出口食品中分離的大腸埃希氏菌耐藥率普遍偏低，耐藥譜基本一致，只是排名稍有差異，這可能與食品質(zhì)量把控的嚴格程度有關(guān)。而在進口的42 株食品中分離的大腸埃希菌中，發(fā)現(xiàn)28 株為耐藥株（66.7%），主要是對四環(huán)素、萘啶酸耐藥，但耐藥率相對偏低，約為15%。據(jù)文獻報道，在亞洲、北美洲、大洋洲、非洲等地區(qū)的食品中分離出的大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺酶類、四環(huán)素類、磺胺類等藥物的耐藥率也處于較高水平[7-9]，如從西澳州[14]零售雞蛋中分離的大腸埃希氏菌對四環(huán)素和氨芐西林的耐藥率高達49%；從韓國[10]2019 株禽類食品中分離出的大腸埃希菌對萘啶酸、氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率均高于60%。北京口岸進口食品分離的菌株耐藥率較低，推斷原因如下：我國肉類食品進口國主要為巴西、美國、俄羅斯等，其原料篩選、生產(chǎn)加工及運輸?shù)雀鳝h(huán)節(jié)都具備較完善的監(jiān)管體系；歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）發(fā)布的最新抗微生物藥物消費和耐藥性分析報告顯示，氨芐西林、喹諾酮類等藥物在可食用動物中的使用有所減少且低于人類[11]，所以進口食品來源的大腸埃希菌的耐藥率相較于國內(nèi)來源低。

食物鏈被認為是耐藥菌從動植物傳播到人體的重要途徑，所以監(jiān)測食品中的多重耐藥菌株也十分重要。在111 株食品源大腸埃希菌中，至少對一種藥物耐藥的菌株約占79.3%（88/111），對每一種藥物都敏感的菌株約占20.7%（23/111），多重耐藥率約為34.2%，出口食品分離的大腸埃希菌多重耐藥檢出率（49.2%）要遠高于進口食品來源的大腸埃希菌（9.5%）。國內(nèi)各地區(qū)之間多重耐藥率略有不同，這可能與地區(qū)經(jīng)濟衛(wèi)生條件等有關(guān)，據(jù)王麗麗等[12]研究，發(fā)現(xiàn)2014—2018 年間北京市大腸埃希菌的多重耐藥情況出現(xiàn)多重耐藥菌株以及耐藥譜種類逐年增多的趨勢，從2014 年的38.9%上升至62.7%，且家畜類大腸埃希菌多重耐藥率（42.1%）大于家禽類（33.3%），與本研究相一致。

ESBLs 是以滅活窄譜和廣譜頭孢菌素、單環(huán)類抗生素及抗革蘭氏陰性桿菌青霉素等抗生素為特征的β-內(nèi)酰胺酶。北京口岸進出口食品中發(fā)現(xiàn)ESBLs大腸埃希菌9 株，檢出率為8.2%。雖然本次實驗在進口菌株中僅發(fā)現(xiàn)1 株家畜類ESBLs 大腸埃希菌，但國外研究顯示ESBLs 大腸埃希菌分離率并不低，如GRUEL 等[13]在法國禽畜肉類中發(fā)現(xiàn)在22%的家畜和35.3%的家禽中檢測到ESBLs 大腸埃希菌菌株，除此以外，像越南[14]、南非[15]等國家ESBLs 大腸埃希菌檢出率更是高達60%以上。本研究結(jié)果顯示產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌較非產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌對某一種藥物有更高的耐藥率，且多重耐藥情況嚴重，其中多以耐13 種抗生素為主（33.3%）。隨著革蘭氏陰性菌耐藥性加劇導致第三代頭孢菌素類或碳青霉烯類抗菌藥物治療失敗增加，而絕大多數(shù)革蘭陰性菌仍對多黏菌素敏感，使得多黏菌素成為治療革蘭陰性菌感染的關(guān)鍵藥物[16]。依據(jù)2022 年最新發(fā)布的中國細菌耐藥監(jiān)測報告中大腸埃希菌對多粘菌素耐藥率約為2.1%[17]，在北京口岸分離的111 株大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)3 株多黏菌素耐藥菌株，耐藥率為2.7%。

多年來，食源性疾病一直備受關(guān)注，已成為國家重點監(jiān)測項目，其中大腸埃希菌的分離率逐年上升。食物鏈是耐藥菌的重要傳播途徑，本研究掌握的北京口岸大腸埃希菌的耐藥情況，可為制定疾病預(yù)防與宣傳方案，科學保障食物在加工與食用環(huán)節(jié)的衛(wèi)生，倡導畜牧業(yè)減少抗生素的大量使用，合理使用高效抑菌抗生素提供依據(jù)。