徐晶晶, 童世紅, 舒國斌, 周瑜, 戴曉燕, 王斌

寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院 1皮膚科, 2造口傷口護(hù)理門診, 3檢驗(yàn)科, 4門診輸液室, 5內(nèi)分泌科(浙江寧波 315800)

糖尿病創(chuàng)面難愈合(糖尿病足)是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一,具有發(fā)生機(jī)制復(fù)雜、治療成本高及療效差等特點(diǎn),容易引發(fā)截肢風(fēng)險(xiǎn)。炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子及修復(fù)細(xì)胞等多種因素都參與糖尿病創(chuàng)面的愈合過程[1-3]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是體內(nèi)部分過剩的葡萄糖與游離氨基結(jié)合形成的終末產(chǎn)物[4],主要來源于持續(xù)的高血糖。它可以與其受體(receptor for advanced glycation end product, RAGE)相互作用,觸發(fā)氧化應(yīng)激,繼而引發(fā)血管炎癥[5]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)因子,能改善組織缺血、缺氧。創(chuàng)面中HIF-1減少伴隨血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)下調(diào),會(huì)影響糖尿病足創(chuàng)面的發(fā)展[6-7]。多項(xiàng)研究證實(shí),AGEs/RAGE通路和HIF-1都與糖尿病足潰瘍的愈合和新血管的生成密切相關(guān)[8-10],但在糖尿病創(chuàng)面難愈合中AGEs/RAGE通路和HIF-1之間的關(guān)系尚不明確。因此,本研究通過觀察糖尿病足患者用藥后不同時(shí)間創(chuàng)面組織羥脯氨酸含量和AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)的變化,研究糖尿病難愈合創(chuàng)面中HIF-1α的表達(dá)是否與AGEs/RAGE通路相關(guān);通過AGE抑制劑吡哆胺干預(yù)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human dermal microvascular endothelial cells, HMVECs),初步探討糖尿病難愈合創(chuàng)面中AGEs/RAGE通路與HIF-1是否有關(guān),為臨床精準(zhǔn)治療糖尿病難愈合創(chuàng)面提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1—12月寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院收治的10例糖尿病足患者,年齡40～70歲,均符合《中國2型糖尿病防治指南(2017版)》[11]西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。入組前均在內(nèi)分泌科接受血糖控制,治療期間監(jiān)測(cè)血糖,達(dá)到血糖控制目標(biāo)(血糖控制目標(biāo),空腹≤7.0 mmol/L,餐后2 h≤10.0 mmol/L),糖尿病足分級(jí)按照Wagner分級(jí),其中1級(jí)2例,2級(jí)8例,8例患者均給予哌拉西林他唑巴坦鈉針 4.5 g 靜脈滴注 1次/d,抗炎治療,期間炎癥指標(biāo)控制達(dá)標(biāo),相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。本研究方案經(jīng)寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過[批件號(hào):2019科審第(22)號(hào)],患者及家屬知情同意;排除條件:近1個(gè)月內(nèi)服用研究相關(guān)藥物、創(chuàng)面死腔形成、免疫系統(tǒng)疾病、研究藥物過敏、肝腎功能障礙、臨床資料不全等。

表1 入選患者臨床數(shù)據(jù)

1.2 藥品與試劑 HMVECs(上海致備生物科技有限公司,ZB064)、吡哆胺(Merck,P9380)、人血清白蛋白(Sigma, SRP6182)、Hyp/Hydroxyproline ELISA Kit (LifeSpan BioSciences,LS-F13017)、BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio,pc0020)、AGE抗體(Abcam,ab176173)、RAGE抗體(Affinity,DF6405)、HIF-1α抗體(Affinity,DF6405)、β-actin抗體(Affinity,AF7018)。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(MD,CMaxPlus)、低溫高速離心機(jī)(美國Thermo,Micro17R)、正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康,E100)、化學(xué)發(fā)光儀(上海勤翔,610020-9Q)。

1.4 治療方法及創(chuàng)面難愈的判定 參考《糖尿病足介入綜合診治臨床指南(第五版)》[12]治療所有患者,積極處理創(chuàng)面,對(duì)肉眼可見的感染壞死組織及無活力組織進(jìn)行徹底清創(chuàng),直至暴露健康、滲血的軟組織,用碘伏消毒后,根據(jù)創(chuàng)面大小外用適量康復(fù)新液(國藥準(zhǔn)字z51021834;四川好醫(yī)生攀西制藥有限公司)濕敷并包扎,1次/d,連用4周。在用藥0、7、14、28 d觀察患者創(chuàng)面滲出物、肉芽組織及上皮生長(zhǎng)情況,對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估[13]并計(jì)算治療有效率。無效:創(chuàng)面縮小< 25%,且肉芽生長(zhǎng)很少,臨床癥狀無改善;好轉(zhuǎn):創(chuàng)面縮小≥25%,但<75%,肉芽組織較新鮮,臨床癥狀改善;顯效:創(chuàng)面縮小≥75%,肉芽組織新鮮,臨床癥狀緩解;痊愈:創(chuàng)面上皮完全覆蓋,質(zhì)地堅(jiān)實(shí),臨床癥狀、體征基本消失。有效率(%)=(n痊愈+n顯效+n好轉(zhuǎn)) /n總×100%。

1.5 ELISA檢測(cè)患者創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸的水平的變化 在外用藥0、7、14、28 d時(shí)先后用生理鹽水棉球和干棉球輕拭創(chuàng)面,再用眼科剪從創(chuàng)面中央?yún)^(qū)域取一塊肉芽(深度以創(chuàng)面出血為度,大小約0.3 cm×0.3 cm),存放在-80 ℃冰箱備用。如果創(chuàng)面已經(jīng)愈合,則不再取材進(jìn)行測(cè)試。取出樣本恢復(fù)至室溫,加PBS制成勻漿,以2 000～3 000 r/min的速度離心20 min,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書的方法步驟,檢測(cè)上清液中羥脯氨酸的含量。

1.6 高級(jí)糖酵化終產(chǎn)物人血清白蛋白的制備(AGE-HSA) 在無菌條件下,將人血清白蛋白(human serum albumin, HAS, 300 μmol/L)與葡萄糖(165 mmol/L)在含有200 μmol/L吡多胺或不含吡哆胺的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)孵育。加入疊氮化鈉(0.02%),以避免微生物污染。樣品在37℃下孵育28 d,用無菌的磷酸鹽緩沖液透析24 h,以去除溶液中游離的葡萄糖。制備的AGE-HAS和吡多胺+AGE-HSA儲(chǔ)存在-20℃處備用。

1.7 HMVECs培養(yǎng)及分組 HMVECs常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合后,無血清培養(yǎng)基饑餓2 h,然后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行給藥,即對(duì)照組、AGE-HSA組、吡多胺+AGE-HAS組。具體給藥如下:對(duì)照組:用含10%胎牛血清的DMEM正常培養(yǎng);AGE-HSA組:用220 nmol/L的AGE-HSA處理HMVECs細(xì)胞,其他培養(yǎng)條件同對(duì)照組;吡多胺+AGE-HSA組:用220 nmol/L的吡多胺+AGE-HSA處理HMVECs細(xì)胞,其他培養(yǎng)條件同對(duì)照組。

1.8 Western blot檢測(cè)患者創(chuàng)面和HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(dá)水平 用干凈的剪刀在冰上把創(chuàng)面組織剪碎,取100 mg與1 mL冷Lysis Buffer制成勻漿,冰上靜置裂解 15～30 min(提取細(xì)胞蛋白樣本時(shí),加入RIPA裂解液冰上裂解30 min),4 ℃條件以12 000 r/min的速度離心5 min,BCA法測(cè)上清液蛋白濃度。樣本蛋白經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,分別加入AGEs、RAGE、HIF-1α和β-actin抗體4 ℃孵育過夜,次日加入二抗室溫下孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影。利用Image J軟件對(duì)蛋白灰度值定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況的變化 患者在用藥后7、14、28 d,隨著用藥時(shí)間的增加,創(chuàng)面愈合情況逐漸改善,藥物治療有效率也呈逐漸升高趨勢(shì)。見表2。

表2 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)患者創(chuàng)面愈合情況 例

2.2 給藥后不同時(shí)間點(diǎn)肉芽組織中羥脯氨酸水平的變化 與0 d比較,7、14、28 d患者肉芽組織中羥脯氨酸水平均顯著升高(P<0.01),且肉芽組織中羥脯氨酸水平28 d>14 d>7 d>0 d。見表3。

表3 不同時(shí)間患者肉芽組織中羥脯氨酸水平的變化

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)水平的變化 與0 d比較,用藥后7、14、28 d的創(chuàng)面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。其中用藥后28 d的創(chuàng)面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(dá)水平最低(P<0.01)。見表4和圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)

表4 不同時(shí)間創(chuàng)面組織中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)水平的變化(n=10)

2.4 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)水平的變化 與對(duì)照組比較,AGE-HSA組的HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01);與AGE-HSA組比較,吡多胺+AGE-HSA組HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表5和圖2。

注:A:對(duì)照組;B:AGE-HAS組;C:吡多胺+AGE-HAS組圖2 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)

表5 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)水平的變化(n=10)

3 討論

糖尿病難愈合創(chuàng)面是糖尿病最具挑戰(zhàn)性的并發(fā)癥之一,致殘、致死率及治療費(fèi)用都比較高,是國家醫(yī)療健康的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)[14]。盡管已有大量學(xué)者開展糖尿病創(chuàng)面愈合機(jī)制的研究,主要方向有信號(hào)通路、血管生成、糖基化終末產(chǎn)物等[15-16],但其具體機(jī)制仍不明確。本研究通過觀察糖尿病患者外用康復(fù)新液0、7、14、28 d時(shí)創(chuàng)面的愈合情況,同時(shí)檢測(cè)不同用藥時(shí)間后其肉芽組織中羥脯氨酸的含量變化及AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)隨著用藥時(shí)間的增加,藥物有效率28 d>14 d>7 d>0 d,創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸的含量28 d>14 d>7 d>0 d,創(chuàng)面AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(dá)水平0 d>7 d>14 d>28 d;與0 d比較,7、14、28 d的肉芽組織羥脯氨酸含量均顯著升高(P<0.01),7、14、28 d組的AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。這表明創(chuàng)面中AGEs、RAGE、HIF-1α的表達(dá)水平和糖尿病難愈合創(chuàng)面的預(yù)后密切相關(guān)。

HIF-1α是HIF-1的一個(gè)亞基,對(duì)氧濃度敏感[17]。當(dāng)脂肪組織形成低氧環(huán)境后,機(jī)體更容易分泌炎癥因子,引起HIF-1α升高,繼而促進(jìn)VEGF 的表達(dá),誘導(dǎo)血管生成[18]。動(dòng)物研究結(jié)果顯示,上調(diào)HIF-1α表達(dá),促進(jìn)血管生成,能夠加快糖尿病大鼠模型的傷口愈合[19-20]。為了進(jìn)一步探究AGEs/RAGE信號(hào)通路和HIF-1在糖尿病難愈合創(chuàng)面中的關(guān)系,本研究采用體外培養(yǎng)HMVECs,通過AGE抑制劑吡多胺預(yù)處理HMVECs。吡哆胺是AGEs的強(qiáng)抑制劑[21],可以通過俘獲低分子量的活性羰基前體,抑制糖基化中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變形成AGEs[22]。研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,AGE能顯著上調(diào)HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表達(dá)(P<0.01),而吡多胺能顯著抑制這種上調(diào)作用(P<0.01)。這表明HMVECs中HIF-1α的表達(dá)可能與AGEs/RAGE信號(hào)通路的活化密切相關(guān)。

綜上所述,糖尿病難愈合創(chuàng)面的預(yù)后與其AGEs、RAGE、HIF-1α的表達(dá)水平密切相關(guān),其中HIF-1α的表達(dá)可能與AGEs/RAGE信號(hào)通路的活化有關(guān),這為臨床治療糖尿病難愈合創(chuàng)面提供新的思路和方向。但是現(xiàn)階段的研究尚不夠深入,樣本量較少,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中未驗(yàn)證康復(fù)新液的作用,未開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,AGEs/RAGE信號(hào)通路與HIF-1之間具體的調(diào)控機(jī)制仍不明確,我們將在今后的研究中進(jìn)一步探討。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:徐晶晶負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、開展、論文撰寫;童世紅、舒國斌參與實(shí)驗(yàn)的開展;周瑜、戴曉燕負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、分析;王斌負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、論文修改。全體作者都閱讀并同意最終的論文。