職永璽, 何海榮, 周 琳, 高 飛, 何磊鳴, 趙 特, 杜鵬強*,

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，鄭州 450046)

近年來，由齊整小核菌Sclerotium rolfsiiSacc.引起的花生白絹病危害嚴重，嚴重制約花生的生產(chǎn)，對花生產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-2]。在我國，花生種植區(qū)域均有白絹病的發(fā)生，一般發(fā)病率在10%～30%，減產(chǎn)50%左右，溫暖地區(qū)發(fā)病更為嚴重，甚至可導(dǎo)致絕收[3]。

當(dāng)前防治花生白絹病主要依靠化學(xué)防治，但化學(xué)防治存在病菌抗藥性、農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境等問題[4-5]。生物防治因具有安全、生態(tài)環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的特點成為了研究防治白絹病的重要方向[6-7]。根際微生物因受到根際分泌物的影響，與非根際微生物相比，其群落結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，物種數(shù)量更加豐富，且在防治病害發(fā)生和增加植物抗病方面具有重要作用[8-9]。鏈霉菌是根際微生物的重要類群，通過分泌抗生素、細胞壁降解酶、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等途徑來防控植物病害[10-12]。例如，羅文建等從Streptomycessp.Strain LC-7 中發(fā)現(xiàn)一種氨基糖苷類抗生素，其對引起煙草青枯病的青枯雷爾氏菌有抑制活性[13]；Palaniyandi 等研究證明，菌株StreptomycesphaeopurpureusExPro138產(chǎn)生的蛋白酶制劑具有抗真菌活性[14]。

藥用植物能夠產(chǎn)生多種活性化合物，根際微生物可以通過多種方式參與藥用植物的生長發(fā)育、代謝過程以及活性成分的積累，對于藥用植物的養(yǎng)分吸收和利用、土傳病害防治、非生物脅迫應(yīng)激等方面具有至關(guān)重要的作用[15]。因此，藥用植物根際可作為分離篩選拮抗微生物的來源。懷牛膝Achyranthes bidentata屬于莧科多年生草本植物，又稱作山莧菜、對節(jié)菜，廣泛種植于河南武陟、博愛、修武、沁陽等地，是中國“四大懷藥”之一[16]。懷牛膝以根部入藥，具有多種藥用活性成分，包括皂苷類、多糖類和甾酮類等[17]。

目前，盡管關(guān)于花生白絹病的生物防治有一定的研究報道[18-21]。但是，關(guān)于從藥用植物，特別是從懷牛膝的根際土壤中分離的拮抗放線菌對花生白絹病的防治效果研究還未見報道。鑒于此，本研究從河南中醫(yī)藥大學(xué)采集了懷牛膝的根際土壤，從中分離篩選出對花生白絹病病原菌有顯著抑制作用的放線菌，通過16S rRNA 基因序列、形態(tài)學(xué)和生理生化特征確定其分類學(xué)地位，并研究其發(fā)酵液對白絹病菌菌絲和菌核的抑制作用，最后通過盆栽試驗研究其對花生白絹病的防治效果及其對花生的促進生長效果，以期獲得可用于花生白絹病生物防治的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病原菌 齊整小核菌Sclerotium rolfsiiSacc.、禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、假禾谷鐮孢菌Fusarium pseudograminearum、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、辣椒疫霉Phytophthora capsici、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和禾谷角擔(dān)菌Ceratobasidium graminearum，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院新型農(nóng)藥創(chuàng)制和應(yīng)用重點實驗室提供。

1.1.2 植物材料 懷牛膝Achyranthes bidentata，采自河南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園 (34°32' N, 113°46'E)?；ㄉ贩N為豫花22，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.3 主要儀器和試劑 細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技 (北京) 有限公司；PCR 擴增引物，生工生物工程 (上海) 股份有限公司；SW-CJ-2FD型無菌凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DYY-6C 型PCR 擴增儀，迪圖 (上海) 生物科技有限公司；GXZ 型智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；QYC-200 型全溫培養(yǎng)搖床，寧波江南儀器廠；5424R型冷凍離心機，北京宏達恒業(yè)科技有限公司。

99%萘啶酮酸(nalidixic acid)，上海源葉生物科技有限公司提供，用1 mol/L 氫氧化鈉溶液將其配制為質(zhì)量濃度為20 mg/L 的溶液供試；94%放線菌酮(cycloheximide)，北京索萊寶科技有限公司提供，用無水乙醇配制其質(zhì)量濃度為50 mg/L的溶液供試；100 mg/mL 的溶菌酶(lysozyme)，北京索萊寶科技有限公司；20 mg/mL溶菌酶緩沖液(lysozyme buffer)，生工生物工程(上海)股份有限公司; 10%井岡霉素(jingangmycin)水劑，浙江桐廬匯豐生物科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基的配制 高氏一號、馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基 (PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、腐殖酸培養(yǎng)基 (HV)、ISP 2、燕麥培養(yǎng)基(ISP 3)、ISP 4、ISP 5、發(fā)酵、馬丁和查氏培養(yǎng)基參考文獻方法[22-23]配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌的分離純化 采用稀釋涂布法分離放線菌株。稱取1 g 懷牛膝根際土壤，與9 mL 無菌水混合，獲得濃度為10-1的土壤溶液，用無菌水稀釋至10-5、10-6和10-7倍。分別吸取土壤稀釋液200 μL，涂布于含有萘啶酮酸 (20 mg/L) 和放線菌酮 (50 mg/L) 的高氏一號和HV 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～14 d。挑取單菌落在ISP 3 培養(yǎng)基上純化。純化后的放線菌用高氏一號液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后，與40%甘油按照體積比1 : 1 混合于試管中，置于 -20 ℃保存。

1.2.2 拮抗放線菌篩選 將齊整小核菌接種于PDA 平板并活化。使用滅菌牙簽刮取放線菌，接種在距PDA 平板中央2 cm 處，28 ℃培養(yǎng)至菌落長出后，接種5 mm 齊整小核菌菌餅，以未接種放線菌的平板為對照，設(shè)置3 個重復(fù)，28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，觀察病原菌菌絲生長情況，測量并按(1) 式計算抑制率 (I1)。

其中：DC為對照組菌落直徑，cm；DT為處理組菌落直徑，cm。

1.2.3 拮抗放線菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察和培養(yǎng)特征：將拮抗菌株劃線接種于ISP 3 培養(yǎng)基上，將蓋玻片傾斜插入培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7～10 d。待菌株長至蓋玻片上，取出蓋玻片，顯微觀察孢子鏈形態(tài)特征[24]，并將拮抗放線菌分別接種至高氏一號和ISP 系列培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～10 d，觀察記錄菌株生長情況、氣生菌絲產(chǎn)生情況、氣生菌絲與基內(nèi)菌絲的顏色特征。

生理生化試驗：碳氮源利用、過氧化氫酶測定、甲基紅 (MR) 測定、乙酰甲基甲醇 (V-P) 測定、淀粉水解、明膠液化、硝酸鹽還原、纖維素分解及牛奶凝固與胨化參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]進行。

分子鑒定：使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA，使用16S rRNA 通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 擴增目的片段。參考黃家銳等[26]的方法設(shè)置PCR 擴增體系和程序。將PCR 產(chǎn)物純化后連接到pMD-19T 載體上，送到上海生工生物工程有限公司進行一代測序，將測序結(jié)果在EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify)網(wǎng)站上進行相似性比對，選取其相似性較高的典型菌株利用MEGA 11軟件通過Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹。

1.2.4 拮抗放線菌對齊整小核菌的拮抗作用

1.2.4.1 拮抗放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 向長滿孢子的放線菌斜面加入無菌水，將孢子刮入滅菌試管中，振蕩，制備孢子懸液。取3 mL 孢子懸液分別加入到100 mL 高氏一號 (液體)、查氏、PDB、發(fā)酵和馬丁培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 下培養(yǎng)7 d，得到發(fā)酵液。于12 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，用0.22 μm 滅菌微孔過濾膜過濾，得到無菌發(fā)酵濾液。以V(無菌發(fā)酵濾液) :V(PDA) =1 : 4 混合倒板，以等量無菌水為對照，在平板中央接種齊整小核菌菌餅，28 ℃培養(yǎng)3 d 后測量抑菌直徑，各處理重復(fù)3 次。選取抑菌活性最佳的培養(yǎng)基進行后續(xù)試驗。

1.2.4.2 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌絲生長與菌核萌發(fā)的抑制

對菌絲生長的抑制作用：采用菌絲生長速率法[27]測定。將發(fā)酵后的無菌發(fā)酵濾液原液、2 倍及4 倍稀釋液，以V(無菌發(fā)酵濾液) :V(PDA) =1:4 混合倒板，于平板中央接種5 mm 齊整小核菌菌餅。每個發(fā)酵濾液濃度重復(fù)3 次，以等體積無菌水代替無菌發(fā)酵濾液為對照。于28 ℃黑暗培養(yǎng)72 h 后觀察無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌的抑菌作用，十字交叉法測量菌落直徑，并按 (2) 式計算抑制率 (I2)。

其中：D0為對照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm。

對菌核形成的抑制作用：將上述測量過菌落直徑的平板，放置于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)30 d 后，記錄不同處理產(chǎn)菌核個數(shù)，菌核烘干后稱其干重[27-28]，分別按照 (3)、 (4) 式計算無菌發(fā)酵濾液對菌核數(shù)量和干重的抑制率。

其中：R1為菌核數(shù)量抑制率；N0為對照菌核數(shù)量；Nt為處理菌核數(shù)量。

其中：R2為菌核干重抑制率；m0為對照菌核干重，mg；mt為處理菌核干重，mg。

1.2.4.3 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核萌發(fā)的影響 參照1.2.4.1 節(jié)制備抑菌活性最佳的無菌發(fā)酵濾液。以V(無菌發(fā)酵濾液) :V(PDA)=1 : 4 混合倒板，將菌核接種到平板上，以等體積無菌水為對照。每皿接種20 粒菌核，于28℃黑暗培養(yǎng)3 d，每24 h 觀察一次菌核萌發(fā)情況，觀察拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液對菌核萌發(fā)的影響[28]。

1.2.5 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液抗菌譜研究 參照1.2.4.1 節(jié)制備抑菌活性最佳的無菌發(fā)酵濾液。以V(無菌發(fā)酵濾液) :V(PDA)=1:4 混合倒板，將活化好的病原菌禾谷鐮孢菌、假禾谷鐮孢菌、尖孢鐮刀菌、辣椒疫霉菌、葡萄座腔菌和禾谷角擔(dān)菌制成5 mm 菌餅，接種于平板中央。以無菌水代替無菌發(fā)酵濾液為對照，每處理3 個重復(fù)。于28℃黑暗培養(yǎng)，待對照長滿平板時，采用十字交叉法測量菌絲直徑，按 (1) 式計算無菌發(fā)酵濾液對不同病原菌的抑制率。

1.2.6 拮抗放線菌發(fā)酵液對花生白絹病的防治效果及對花生生長的促進作用

1.2.6.1 防治效果測定 采用盆栽試驗法。選取飽滿度一致的花生種子，用75% 酒精消毒2 min，無菌水沖洗3～5 次，播種于裝有基質(zhì)土的小盆中，每盆兩粒種子，待花生出芽生長2 d 后，選取長勢一致的花生植株，做后續(xù)處理。按照1.2.4.1節(jié)方法制備拮抗菌株抑菌活性最佳的發(fā)酵液。將3 mL 菌株Soil-1-5 的孢子懸液加入到100 mL PDB 中，同時將3 mL 菌株Soil-3-28 的孢子懸液加入到100 mL 高氏一號液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min 下培養(yǎng)7 d。通過稀釋涂布平板計數(shù)法，計算出菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 發(fā)酵液的原始濃度分別為1013和1011cfu/mL，再使用無菌發(fā)酵培養(yǎng)基將兩株拮抗菌發(fā)酵液濃度調(diào)約為108cfu/mL。試驗共設(shè)置4 個處理，處理1 (CK)：接種病原菌 +灌根無菌水，每株10 mL；處理2：接種病原菌 +灌根10%井岡霉素水劑 (200 mg/L)，每株10 mL；處理3：接種病原菌 + 灌根濃度為108cfu/mL 的Soil-1-5 發(fā)酵液，每株10 mL；處理4：接種病原菌 + 灌根濃度為108cfu/mL 的Soil-3-28 發(fā)酵液，每株10 mL。每株花生植株莖基部接種齊整小核菌菌餅，定殖侵染2 d 后，澆灌無菌水、井岡霉素和拮抗菌株發(fā)酵液。每處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 株花生。7 d 后觀察花生發(fā)病情況，記錄發(fā)病等級，分別按公式 (5) 和公式 (6) 計算病情指數(shù)和防治效果。

參考董煒博等[29]的病害分級標準并稍加更改：0 級，植株無癥狀；1 級，僅在莖基部產(chǎn)生病斑；3 級，莖基部產(chǎn)生縊縮癥狀，最后1/3 以下的植株表現(xiàn)系統(tǒng)癥狀 (枯萎、死亡、萎蔫等)；5 級，最終2/3 以下的植株表現(xiàn)系統(tǒng)癥狀 (枯萎、死亡、萎蔫等)；7 級，最終2/3 以上的植株表現(xiàn)系統(tǒng)癥狀 (枯萎、死亡、萎蔫等)；9 級，最終整株枯死。

其中：M為病情指數(shù) (M0為對照，Mt為處理)；N為調(diào)查總株數(shù)；n為各級病株數(shù)；L為最高級代表值；l為各級代表值；E為防治效果。

1.2.6.2 對花生生長的促進作用測定 按照

1.2.6.1 節(jié)的方法種植花生，并澆灌濃度為108cfu/mL 的拮抗菌發(fā)酵液，每株10 mL。以等體積無菌水為對照。培養(yǎng)7 d 后，測定花生的生長指標，包括株高、根長、地上部鮮重、地下鮮重以及地上部干重和地下部干重 (75 ℃烘干至恒重)[30]。

1.2.7 拮抗放線菌促生功能測定 參照甘霖[31]方法配制Salkowski 比色液，采用Salkowski 比色法測定拮抗放線菌分泌吲哚乙酸 (IAA) 的能力；參照白娟孌的方法[32]進行拮抗放線菌解磷能力和產(chǎn)氨能力測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得結(jié)果采用SPSS 20.0 軟件進行差異顯著性檢驗，計算方法是最小顯著性差異法 (Least Significant Difference, LSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離及篩選

從懷牛膝根際土壤中分離純化得到116 株放線菌，通過與齊整小核菌的平板對峙試驗，得到兩株抑菌活性較好且穩(wěn)定的菌株Soil-1-5 和Soil-3-28，抑制率分別為80.43%和92.34% (圖1)，且兩株放線菌對其他供試病原菌也有較好拮抗作用 (圖2)。

圖1 菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 對齊整小核菌的抑制效果(PDA 培養(yǎng)基)Fig.1 Inhibitory effect of Soil-1-5 and Soil-3-28 strains on Sclerotium rolfsii Sacc.(PDA medium)

圖2 菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 對其他植物病原菌的抑制效果 (PDA 培養(yǎng)基)Fig.2 Inhibitory effect of strain Soil-1-5 and Soil-3-28 on other plant pathogens (PDA medium)

2.2 形態(tài)學(xué)觀察和培養(yǎng)特征

菌株Soil-1-5 在ISP 3 培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好，菌落表面褶皺干燥，氣生菌絲灰白，基內(nèi)菌絲呈棕色，孢子絲呈半螺旋狀態(tài)；菌株Soil-3-28 在高氏一號培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好，氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲為磚紅色，孢子絲呈螺旋和半螺旋狀態(tài) (圖3)。兩株放線菌在其他培養(yǎng)基培養(yǎng)特征見表1。

表1 拮抗放線菌的培養(yǎng)特征觀察Table 1 Observation of culture characteristics of antagonistic actinomycetes

圖3 菌株Soil-1-5 and Soil-3-28 的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain Soil-1-5 and Soil-3-28

2.3 生理生化試驗特征

菌株Soil-3-28 利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、肌醇、甘露醇、半乳糖、乳糖、麥芽糖，不能利用纖維素和山梨醇作為唯一的碳源；能夠利用蛋白胨、肌酸、硝酸鉀和精氨酸作為唯一的氮源。菌株Soil-1-5 利用葡萄糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露醇、乳糖、半乳糖、肌醇和纖維素，不能利用阿拉伯糖和果糖為唯一碳源；利用蛋白胨、硝酸鉀和精氨酸，不能利用肌酸作為唯一氮源。菌株Soil-1-5和Soil-3-28 其他生理生化指標特征結(jié)果見表2。

表2 菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain Soil-1-5 and Soil-3-28

2.4 基于16S rRNA 基因的進化發(fā)育分析

對拮抗放線菌Soil-1-5 和Soil-3-28 進行16S rRNA 基因測序，其在NCBI 上的GenBank 序列編號分別為OP679872 和OP679795。將拮抗放線菌Soil-3-28 和Soil-1-5 的16S rRNA 基因序列分別在EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify)上進行比對，發(fā)現(xiàn)Soil-3-28 的最高相似性菌株為Streptomyces luteogriseusNBRC 13402 (99.65%)；Soil-1-5 的最高相似性菌株為Streptomyces scabieiNRRL B-16523 (99.30%)。分別對菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 進行系統(tǒng)發(fā)育分析 (圖4，圖5)，發(fā)現(xiàn)Soil-1-5 與相似性最高的Streptomyces scabieiNRRL B-16523 在同一個分支上；菌株Soil-3-28 與其相似性最高的菌株S.luteogriseusNBRC 13402 以及相似性較高菌株Streptomyces tibetensisXZ 46 (98.87%)在同一個分支上，且與S.luteogriseusNBRC 13402 距離最近。結(jié)合形態(tài)特征，生理生化特征以及分子特征，初步將菌株Soil-1-5 鑒定為瘡痂鏈霉菌Streptomyces scabiei，菌株Soil-3-28 鑒定為藤黃灰鏈霉菌Streptomyces luteogriseus。

圖4 基于菌株Soil-3-28 的16S rRNA 序列用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbour-joining tree showing the phylogenetic position of strain Soil-3-28 and related taxa based on 16S rRNA gene sequences

圖5 基于菌株Soil-1-5 的16S rRNA 序列用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbour-joining tree showing the phylogenetic position of strain Soil-1-5 and related taxa based on 16S rRNA gene sequences

2.5 拮抗放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

將花生白絹病病菌接種到不同發(fā)酵培養(yǎng)基的平板上，兩株拮抗放線菌在5 種培養(yǎng)基中均可產(chǎn)生抑制花生白絹病病原菌生長的活性代謝產(chǎn)物，不同發(fā)酵培養(yǎng)基對齊整小核菌的抑制效果的統(tǒng)計結(jié)果見圖6。菌株Soil-1-5 在PDB 培養(yǎng)基中無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性最佳，抑菌直徑為5.98 cm；菌株Soil-3-28 在高氏一號液體培養(yǎng)基中無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性最佳，抑菌直徑為4.60 cm。

圖6 不同培養(yǎng)基的無菌發(fā)酵濾液抑菌活性Fig.6 Inhibition of aseptic fermentation filtrate in different mediums

2.6 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌絲生長的抑制

把無菌發(fā)酵濾液原液及2、4 倍稀釋液與PDA按體積比1 : 4 混合倒板后，得到最終稀釋為5、10、20 倍發(fā)酵液平板，將白絹病菌接種在平板上觀察不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對白絹病的抑制效果。結(jié)果(表3) 顯示：菌株Soil-1-5 無菌發(fā)酵濾液在稀釋5、10、20 倍時，對齊整小核菌菌絲生長的抑制率分別為73.67%、51.80%、38.00%；菌株Soil-3-28 無菌發(fā)酵濾液的抑制率分別為57.11%、42.25%和30.79%。兩株拮抗菌發(fā)酵液均呈現(xiàn)隨稀釋倍數(shù)增加抑菌率降低的趨勢。圖7 為拮抗菌株稀釋5 倍發(fā)酵液平板對花生白絹病菌菌絲生長的影響。

表3 無菌發(fā)酵濾液不同稀釋液對齊整小核菌菌絲生長的抑制率Table 3 Inhibition rate of aseptic fermentation filtrate to mycelial growth of Sclerotium rolfsii Sacc.

2.7 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核產(chǎn)生的抑制

將觀察過無菌發(fā)酵濾液對菌絲生長抑制的齊整小核菌繼續(xù)培養(yǎng)30 d，記錄拮抗菌不同濃度的無菌發(fā)酵濾液對菌核形成的影響。結(jié)果表明：拮抗菌各濃度發(fā)酵濾液均對菌核形成產(chǎn)生了抑制作用，抑制菌核形成的能力隨著稀釋倍數(shù)的升高而降低 (圖8 A)。在稀釋5 倍時，菌株Soil-1-5 和菌株Soil-3-28 對菌核數(shù)量的抑制率最大，分別為78.08%和50.68% (圖8 B)，對菌核干重的抑制率為41.86%和34.68% (圖8 C)。

圖8 無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核形成的抑制Fig.8 Inhibition of the filtrate of aseptic fermentation on the formation of S. rolfsii

2.8 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核萌發(fā)的影響

由表4 和圖9 可知，兩株拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核萌發(fā)均有抑制作用。在菌核培養(yǎng)48 h 時，菌株Soil-1-5 對菌核萌發(fā)的抑制率為41.67%，Soil-3-28 的抑制率為51.67%；隨著培養(yǎng)時間的延長，兩株拮抗放線菌對菌核萌發(fā)抑制率均先升高后降低。

表4 無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核萌發(fā)的抑制Table 4 Inhibition of the filtrate of aseptic fermentation on the germination of sclerotium of S. rolfsii

圖9 無菌發(fā)酵濾液對齊整小核菌菌核萌發(fā)的影響(48 h)Fig.9 Effect of aseptic fermentation filtrate on the germination of sclerotium of Sclerotium rolfsii（48 h）

2.9 拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液抑菌廣譜性研究

以V(無菌發(fā)酵濾液) :V(PDA) = 1 : 4 混合倒板，將6 種植物病原菌分別接種到平板上。經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，兩株拮抗菌株對6 株病原菌均具有抑制作用 (表5)，說明兩株拮抗放線菌有抗菌廣譜性，具有開發(fā)應(yīng)用為生防菌的價值，其中菌株Soil-1-5 對禾谷鐮孢菌、假禾谷鐮孢菌、禾谷角擔(dān)菌和葡萄座腔菌4 株病原菌的抑菌率在50% 以上，其中對禾谷角擔(dān)菌的抑制率最佳，達84.24%。

表5 兩株拮抗菌無菌發(fā)酵濾液對植物病原菌的抑制作用Table 5 Inhibition of sterile filtrate of two strains of antagonistic bacteria on plant pathogens after fermentation

2.10 拮抗放線菌發(fā)酵液對花生白絹病盆栽防控效果

盆栽試驗結(jié)果 (圖10 和表6) 顯示：對照組花生發(fā)病嚴重，病情指數(shù)高達77.04。施用10 mL/株有效成分含量為10%的井岡霉素和10 mL/株濃度為108cfu/mL 的拮抗放線菌發(fā)酵液均對花生白絹病有防治效果。其中井岡霉素的防治效果為59.62%；菌株Soil-1-5 的防治效果為51.92%，菌株Soil-3-28 的防治效果為31.74%。

表6 拮抗放線菌防控花生白絹病盆栽試驗效果Table 6 Pot experiment effect of antagonistic actinomycetes on control of peanut southern blight

2.11 拮抗放線菌發(fā)酵液對花生的促生效果

經(jīng)放線菌發(fā)酵液灌根處理后，測量花生的根長、莖長、根鮮重、莖鮮重、根干重與莖干重，結(jié)果如表7 所示。菌株Soil-3-28 對花生促生效果較顯著，所有測量指標均有所增長，而菌株Soil-1-5 發(fā)酵液處理無明顯的促生效果。

表7 拮抗放線菌發(fā)酵液對花生植株的促生效果Table 7 Growth promotion effect of actinomycetes fermentation broth on peanut plants

注：A 為對照，B 為菌株Soil-1-5，C 為菌株Soil-3-28。Note: A was the control, B was strain Soil-1-5, and C was strain Soil-3-28.

2.12 拮抗放線菌的促生功能

在產(chǎn)氨定性試驗中，向Soil-3-28 培養(yǎng)物中加入Nesseler 試劑后，出現(xiàn)了陽性特征，處理組溶液變?yōu)樽攸S色，表明菌株Soil-3-28 具有產(chǎn)氨能力(圖11 A)。

圖11 菌株Soil-3-28 促生潛在活性檢測Fig.11 Detection of growth promoting potential activity of strain Soil-3-28

解磷定性試驗中，菌株Soil-3-28 培養(yǎng)基中出現(xiàn)透明圈，說明其具有解磷活性，結(jié)果如圖11 B所示。

試驗發(fā)現(xiàn)，菌株Soil-3-28 具有產(chǎn)IAA 能力(圖11C)，故對其進行IAA 定量測定。根據(jù)IAA標準曲線圖11D) 計算IAA 產(chǎn)量，其中x為OD530值，y為IAA 標準品質(zhì)量濃度 (μg/mL)，計算得菌株Soil-3-28 產(chǎn)IAA 量為 (18.29 ± 0.31) μg/mL。

3 結(jié)論與討論

生防菌的應(yīng)用是防治白絹病的重要途徑之一[33]。植物根際微生物在促進植物生長、幫助植物獲取養(yǎng)分、抵御植物病蟲害以及增產(chǎn)等方面有十分重要的作用[34]。其中，根際放線菌能夠產(chǎn)生抗菌抗蟲等豐富的次級代謝產(chǎn)物，是生防菌的重要來源[35]。從罌粟、菊花、蕁麻和珊瑚草等的根際土壤中也分離到多株能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的放線菌[36]；其中菌株JT-2F、DT-3F 和JJ-3F 對引起珊瑚草葉片發(fā)病的炭疽菌具有較強的生物活性，且菌株JT-2F 被鑒定為Streptomyces tsukiyonensis，JT-2F 具有廣譜的抗植物病原菌活性，其中抑制率最高可達86.75%[37]。因此，分離植物根際微生物，特別是根際放線菌對挖掘生防菌資源至關(guān)重要。

中藥材是我國的特色藥材，在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，近年來，越來越多研究者將目光轉(zhuǎn)移到中藥材根際微生物的研究中。本研究從藥用植物懷牛膝根際土壤中分離獲得兩株對花生白絹病菌有較強抑制活性的菌株Soil-1-5 和Soil-3-28，表現(xiàn)出較好的生防潛力?；ㄉ捉伈【谔镩g主要靠菌核進行遠距離傳播和越冬，且菌核在土壤中存活時間長，但現(xiàn)有的研究多數(shù)為利用拮抗細菌抑制菌絲生長從而減少花生發(fā)病，少有測定拮抗細菌對菌核萌發(fā)和產(chǎn)生的抑制測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩株拮抗鏈霉菌無菌發(fā)酵濾液對花生白絹病菌絲生長有明顯影響，能顯著降低菌絲生長速率而且能夠顯著抑制菌核的形成。通過菌核萌發(fā)試驗，也證明了兩株拮抗菌株能夠延緩菌核萌發(fā)。采用溫室盆栽試驗探究了兩株拮抗菌株對花生白絹病的防治效果。結(jié)果表明，菌株Soil-1-5 發(fā)酵液的防治效果 (51.92%) 與井岡霉素的防治效果(59.62%) 接近，說明其具有極大的開發(fā)為生防菌的應(yīng)用潛力。此外，根際微生物能夠通過產(chǎn)生植物生長素、固氮作用、溶磷作用等方式促進植物的生長[38]。本研究通過盆栽促生試驗，發(fā)現(xiàn)菌株Soil-3-28 能夠顯著促進花生植株的生長。通過對其促生因子進行探索，發(fā)現(xiàn)菌株Soil-3-28 具有解磷、產(chǎn)氨、產(chǎn)IAA 等促生潛在活性。因此，菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 可作為防治花生白絹病和促進花生生長等方面的候選菌株。

近年來，根際鏈霉菌因能夠產(chǎn)生抗生素，鐵載體或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性而受到研究學(xué)者的關(guān)注[39]。本研究中對兩株拮抗菌株進行了生理生化試驗、形態(tài)學(xué)特征觀察和16S rRNA 序列分析，初步鑒定兩株菌為鏈霉菌，其中菌株Soil-1-5 為瘡痂鏈霉菌S.scabiei，菌株Soil-3-28 為藤黃灰鏈霉菌S.luteogriseus。據(jù)報道，根際鏈霉菌具有抑菌廣譜性，可同時對多種植物病原菌產(chǎn)生拮抗作用。如張建峰等從水稻根際土中分離出的StreptomycesTL-007 可抑制人參銹腐病菌、大豆灰霉病菌等6 種植物病原菌的生長[40]；賴寶春等從辣椒根際土中分離出的菌株StreptomycesFX81，對草莓根腐病菌、黃瓜枯萎病菌等14 種植物病原菌也具有拮抗活性[41]。本研究中菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 對禾谷鐮孢菌、辣椒疫霉病菌等6 株供試菌株也有較好抑菌活性。證明兩株鏈霉菌有較強的生防潛力，具有廣譜的抑菌活性。

綜上，本研究中所分離得到的放線菌菌株Soil-1-5 和Soil-3-28 對花生白絹病等多種植物病原菌具有較強拮抗作用，具有極大的開發(fā)潛力。但是，菌株對不同病原菌的田間防治效果、發(fā)酵條件的優(yōu)化、次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性以及抑菌機理等問題還待進一步研究。