秦?zé)ㄈ?，吳祥鍇，江哲宇，張 赟，林麗云，王黎洲，周 石

在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）進(jìn)展過程中有多種基因改變，其中微小核糖核酸（miRNA）參與細(xì)胞分化、代謝和發(fā)育等各種生物過程，在腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［1-5］。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者miR-155 水平升高有利于抗腫瘤免疫特征且與更好的預(yù)后相關(guān)［6］；而宮頸癌患者miR-155 水平升高與不良預(yù)后相關(guān)［7］。miR-155 在肝癌中表達(dá)上調(diào)，通過PI3K-AKT 通路抑制磷酸酶和緊張素同源物（PTEN）進(jìn)而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展［8］。然而miR-155 是否存在其他下游靶點(diǎn)影響肝癌的進(jìn)展仍不清楚。本研究通過構(gòu)建miR-155 沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)株以探討miR-155 對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%FBS，1%青、 鏈霉素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Huh7 人肝癌細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，3 次傳代后待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行檢測。

1.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

取對數(shù)增長期的Huh7 肝癌細(xì)胞1×105個(gè)接種于6 孔板，待細(xì)胞生長至30%～40%，根據(jù)慢病毒說明書中推薦的復(fù)感染指數(shù)=5，換算最佳接種病毒滴度進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分別轉(zhuǎn)染shNC、sh-miR-155慢病毒，轉(zhuǎn)染16 h 后進(jìn)行細(xì)胞換液。待細(xì)胞長至85%左右將細(xì)胞傳代至T25 培養(yǎng)瓶，3～4 d 基因表達(dá)穩(wěn)定后，將細(xì)胞用胰酶消化離心傳代，細(xì)胞貼壁后用含2 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選，反復(fù)藥篩。待無細(xì)胞死亡時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測病毒轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染成功后傳代凍存10 管穩(wěn)轉(zhuǎn)株，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用，在此過程中用含1 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持。陰性對照組為轉(zhuǎn)染空載病毒細(xì)胞（shNC），轉(zhuǎn)染抑制基因病毒（sh-miR-155）為沉默組。

1.3 RT-qPCR

將Blank、shNC、sh-miR-155 三組細(xì)胞分別取2×104個(gè)接種于6 孔板，待細(xì)胞長至90%左右，采用RNA 快速提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）分別提取各組RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR 得到各組Ct 值。U6 作為內(nèi)參，根據(jù)公式：①ΔCt=各組Ct1（miR-155）-Ct2（U6）；②ΔΔCt=各組ΔCt 值-Blank 組的ΔCt 均值；③miR-155 表達(dá)=2-ΔΔCt；④miR-155 相對表達(dá)=各組2-ΔΔCt/Blank 組2-ΔΔCt。

1.4 MTT 實(shí)驗(yàn)

將Blank、shNC、sh- miR- 155、sh- miR- 155+Recilisib、shNC+Recilisib 等5 組細(xì)胞分別用胰酶消化后用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×104個(gè)/mL。以每孔100 μL 接種于96 孔板，每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁生長后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT）10 μL ，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入結(jié)晶紫溶液，放入酶標(biāo)儀A490 nm 和A630 nm 處測量各孔的吸光度值。按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖率=［A experimental group（630 nm-490 nm）/A blank group（630 nm-490 nm）］ × 100%。

1.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)

①遷移： 取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞消化、離心后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每室鋪2×104個(gè)細(xì)胞，向小室下室加入含20%FBS 的高糖培養(yǎng)基，再輕輕向小室上室加入細(xì)胞懸液，避免出現(xiàn)氣泡，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱48 h 后收樣，上室細(xì)胞用棉簽擦拭，接著使用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用水清洗后晾干，使用倒置顯微鏡于200 倍視野下拍5 個(gè)視野。②侵襲：提前將槍頭和小室放入-20°冰箱預(yù)冷，向小室上室加入基質(zhì)膠使其均勻地鋪在小室，第2 天提前半小時(shí)將小室置于無血清的培養(yǎng)基中水化，取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，按每室鋪5×104個(gè)細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞懸液量，接著向小室下室加入含20%FBS 培養(yǎng)基。然后將小室置于24 孔板內(nèi)，每孔加入無血清細(xì)胞懸液到小室上室中，細(xì)胞生長48 h 后，棄去培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭干凈上室中的基質(zhì)膠，下室加入1 mL 多聚甲醛固定約30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫浸泡20 min，PBS 涮洗3 遍，晾干后將24 孔板置于200 倍顯微鏡下選取5 個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

將各組細(xì)胞消化、離心后，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞為2×105個(gè)/mL，培養(yǎng)體系為2 mL 接種于6 孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，離心收取細(xì)胞沉淀，按照試劑盒說明書依次加入Annexin V-APC/PI 結(jié)合液，Annexin V-APC 和PI 染液混勻，輕輕吹打重懸細(xì)胞，室溫孵育10～15 min，加入預(yù)冷PBS 混勻，上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

為了檢測PTPN21 與miR-155 結(jié)合，取對數(shù)生長期293T 細(xì)胞，將其隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染miR-155模擬物組（mimicNC 組）和轉(zhuǎn)染miR-155 抑制劑組（miR-155-3p mimic 組），細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL 所需細(xì)胞懸液量，分別接種至48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)濃度梯度3 個(gè)復(fù)孔。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞檢測各組熒光素酶活性，取樣品20 μL，加入100 μL 熒光素酶檢測試劑測得相對光單位1（RLU1），完成后，加入100 μL 海腎熒光素酶檢測試劑測得相對光單位2（RLU2）。目的基因的激活程度=RLU1/RLU2。

1.8 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

胰酶消化細(xì)胞獲得細(xì)胞沉淀，向Western 及IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Western 及IP 裂解液∶酶抑制劑=100∶1）。在冰上充分裂解30 min，每5 min 震蕩1 次，超聲破碎后通過高速離心機(jī)（12 000 r，15 min）獲得蛋白上清液，并使用BCA 試劑盒（索萊寶）配合酶標(biāo)儀在562 nm 波長條件下測量細(xì)胞的蛋白濃度。在60 V（30 min）和110 V （1 h）下，采用一步法聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒（10%）（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）凝膠電泳分離蛋白。電泳后，在4℃冷室中用濕電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德國Amersham 公司）上。然后，將PVDF 膜用5%脫脂牛奶密封，室溫孵育2 h，一抗在4℃孵育過夜。次日用含0.1%Tween-20 的Tris 緩沖鹽溶液（TBST）洗滌3 次，加入羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育2 h，再次用TBST 洗滌3 次，將膜用ECL 曝光液浸泡在暗盒里孵育30 s左右放入凝膠成像系統(tǒng)中，最后再將條帶導(dǎo)入Image J 軟件進(jìn)行各組蛋白表達(dá)水平灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。折線圖及柱狀圖通過GraphPad 8.0 軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 shNC 和sh-miR-155 轉(zhuǎn)染Huh7 人肝癌細(xì)胞

RT-qPCR 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果，sh-miR-155 組中miR-155 的表達(dá)水平顯著低于Blank 組及shNC 組（P＜0.000 1），miR-155 在Blank 組及shNC 組表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染shNC、sh-miR-155 后熒光圖及其轉(zhuǎn)染效率

2.2 miR-155 靶向調(diào)控PTPN21 的表達(dá)

根據(jù)microRNA 靶基因預(yù)測在線數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/vert_70/）（http：//mirwalk.umm.uniheidelberg.de/）和（http：//mirdb.org/miRDB/）預(yù)測PTPN21 基因3' 非翻譯區(qū)（PTPN21-3'-UTR）上存在與miR-155 的潛在靶向結(jié)合點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-155-3p 與PTPN21 有2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，2 個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PTPN21- 3'UTR 突變序列（PTPN21-3'UTR MUT-1）和（PTPN21-3'UTR MUT-2）。miR-155-3p 可以和PTPN21-3'UTR 野生型（PTPN21-3'UTR WT）結(jié)合使雙熒光素酶活性增強(qiáng)，MUT-1 位點(diǎn)突變后雙熒光素酶的活性也增強(qiáng)，說明該位點(diǎn)不是結(jié)合位點(diǎn)； 而MUT-2 位點(diǎn)突變后雙熒光素酶活性沒有變化，說明該位點(diǎn)是結(jié)合位點(diǎn)。通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)得出：miR-155-3p 可與PTPN21 結(jié)合，且結(jié)合位點(diǎn)是MUT-2 對應(yīng)的序列，見圖2。

圖2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miR-155 與PTPN21 的關(guān)系

2.3 沉默miR-155 抑制肝癌細(xì)胞的增殖

MTT 結(jié)果顯示，sh-miR-155 組中Huh7 細(xì)胞在2、3、4、5 d 時(shí)A 值均低于Blank 組及shNC 組（P＜0.000 1），而Blank 組與shNC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；sh-miR-155 組在2、3、4、5 d 時(shí)A 值低于sh-miR-155+Recilisib 組及shNC+Recilisib 組（P=0.005 2，P＜0.000 1），而sh-miR-155+Recilisib 在2、3、4、5 d 時(shí)A 值低于shNC+Recilisib 組（P＜0.000 1），見圖3。

圖3 MTT 檢測各組細(xì)胞增殖能力（**** 與Blank 組相比，P＜0.000 1）

2.4 沉默miR-155 抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲

Blank 組與shNC 組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在激活PI3K-AKT 信號通路后，與Blank 組相比，shNC+Recilisib 組肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著增加（P＜0.000 1）。相反，沉默miR-155 后Huh7 細(xì)胞的遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于Blank 組及shNC 組（P＜0.000 1），而PI3K 激動劑逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，與sh-miR-155 組相比，sh-miR-155+Recilisib 組肝癌細(xì)胞的遷移、 侵襲能力增強(qiáng)（P=0.000 2），見圖4。

圖4 Transwell 檢測各組細(xì)胞侵襲及遷移能力

2.5 敲低miR-155 促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Blank 組、shNC 和shNC+Recilisib 組之間細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Blank 組相比，sh-miR-155 組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.000 1），并且sh-miR-155 組細(xì)胞凋亡率高于sh-miR-155+Recilisib 組（P＜0.000 1），見圖5。

圖5 各組肝癌細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)圖及凋亡分析柱狀圖（與Blank 組相比，ns：P＞0.05；****：P＜0.000 1）

2.6 miR-155 對PTPN21、PI3K-AKT 信號通路及凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank 組相比，沉默miR-155 后促凋亡蛋白Caspase-3 和BAX 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.000 1），而抗凋亡蛋白BCL2 的表達(dá)量明顯降低（P＜0.000 1）； 此外，sh-miR-155 組與Blank 組相比PTPN21 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.000 1），而在PI3K-AKT 信號通路激活時(shí)PTPN21 表達(dá)較shmiR-155 組高（P＜0.000 1），但sh-miR-155+Recilisib組PTPN21 表達(dá)仍低于Blank 組（P=0.000 2）；與Blank組相比，在沉默miR-155 后P-AKT 和P-PI3K 的表達(dá)顯著下降（P＜0.000 1），且sh-miR-155+Recilisib 組P-AKT 和P-PI3K 表達(dá)也較Blank 組低（P=0.017 7，P=0.031 3），而sh-miR-155+Recilisib 組P-AKT和P-PI3K 表達(dá)較sh-miR-155 組高（P＜0.000 1，P=0.001 4），PI3K 與AKT 在各組肝癌細(xì)胞之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 蛋白質(zhì)印跡檢測PTPN21、PI3K-AKT 信號通路及凋亡相關(guān)蛋白

3 討論

研究表明，miRNA 與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，致癌相關(guān)miRNA 的過表達(dá)通過沉默腫瘤抑制因子或參與細(xì)胞分化中的某一過程，最終影響腫瘤組織血管生成、增殖及侵襲水平導(dǎo)致腫瘤形成［9-11］。miR-155 作為一類癌癥相關(guān)miRNA，在各種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量增加，如胃癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和其他實(shí)性惡性腫瘤，并發(fā)揮不同的作用［12］。此外，miR-155 在肝癌中高表達(dá)，并與HCC 患者不良的臨床病理特征和較低生存率相關(guān)［13］。本研究通過構(gòu)建miR-155 沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)株，探討下調(diào)miR-155 后對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移影響的機(jī)制。

PTPN21 在肺癌［14］、膀胱腫瘤［15］及非霍奇金淋巴瘤［16］中高表達(dá)，同時(shí)參與腫瘤細(xì)胞的生長過程，但其在肝癌中的作用機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，PTPN21 基因3'-UTR 上存在與miR-155 相結(jié)合的潛在靶點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-155-3p與PTPN21 有2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，2 個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)突變序列MUT-1 和MUT-2，MUT-1 位點(diǎn)突變后雙熒光素酶的活性增強(qiáng)，而MUT-2 位點(diǎn)突變后雙熒光素酶活性沒有變化，說明MUT-2 是結(jié)合位點(diǎn)，并且miR-155 沉默可以抑制PTPN21 的表達(dá)，提示PTPN21 是miR-155 的下游靶點(diǎn)。

PI3K-AKT 通路是調(diào)控細(xì)胞生長、代謝、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵調(diào)控中心［17］。研究表明，miRNA 在調(diào)控PI3K-AKT 通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其通過靶向PI3K-AKT 信號軸，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和代謝方面具有重要意義［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-155 后，各組PI3K、AKT 總蛋白變化不明顯，而磷酸化蛋白P-PI3K、P-AKT 表達(dá)量明顯下降，提示miR-155 的表達(dá)與PI3K-AKT 通路呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-155 對肝癌細(xì)胞生長影響是通過PI3K-AKT 通路實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)在shNC組及沉默miR-155 的同時(shí)應(yīng)用PI3K-AKT 通路激動劑，觀察PI3K-AKT 通路相關(guān)蛋白的變化情況，結(jié)果顯示，與shNC+Recilisib 組相比，miR-155 可抑制P-PI3K 及P-AKT 的表達(dá)，提示miR-155 可通過調(diào)控PI3K-AKT 通路影響HCC 生長。MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默miR-155 可抑制肝癌細(xì)胞的增殖。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Blank 組及shNC 組相比，shmiR-155 組細(xì)胞凋亡率顯著增加，Blank 組和shNC組細(xì)胞凋亡量無顯著變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞凋亡常與多個(gè)信號傳導(dǎo)通路密切相關(guān)，其中BCL-2及Caspase 家族蛋白扮演著重要角色，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑時(shí)，抑凋亡蛋白BCL-2 表達(dá)水平下調(diào)，而促凋亡蛋白BAX 表達(dá)上調(diào)，其下游Caspase 家族蛋白接受凋亡信號，進(jìn)而激活Caspase-3 活化，執(zhí)行凋亡程序［20］。本研究結(jié)果顯示，sh-miR-155 組與Blank組及shNC 組相比，抑凋亡蛋白BCL-2 表達(dá)水平顯著降低，促凋亡蛋白Caspase-3 及BAX 表達(dá)水平顯著提高，加速了肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

有研究表明，沉默PTPN21 通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展［21］。本研究中，Transwell結(jié)果顯示，沉默miR-155 明顯抑制肝癌細(xì)胞侵襲及遷移。以上實(shí)驗(yàn)表明，miR-155 通過靶向PTPN21 調(diào)控PI3K-AKT 信號通路，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞生長，提示miR-155 在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌基因的作用。

綜上所述，沉默Huh7 細(xì)胞中miR-155 通過靶向PTPN21 調(diào)控PI3K-AKT 信號通路抑制肝癌細(xì)胞生長。因此，miR-155 可能是未來HCC 患者的輔助診斷指標(biāo)之一，也為臨床治療HCC 患者提供了新的治療靶點(diǎn)。