項蓉，楊金山，婁婷婷，吳子健，張宏宇 ，趙彥巧，王丹蕓，張得光，馬興

（1.天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院 天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；3.天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300461）

蔗糖磷酸化酶是一種碳水化合物活性酶，屬于糖苷水解酶GH13 家族[1-2]，能夠催化蔗糖和磷酸鹽可逆轉化，生成α-D-吡喃葡萄糖磷酸和D-果糖。在反應過程中遵循雙重置換機制，并能夠與絕大多數(shù)糖基受體發(fā)生磷酸化、轉糖基化和水解三種類型的反應[3-4]。作為一種高效的轉糖基化酶，蔗糖磷酸化酶因其廣泛的底物專一性，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領域極具應用潛力[5-7]。其主要有3 個方面的應用，分別為1）功能低聚糖的制備：蔗糖磷酸化酶可以以某些單糖或糖醇類作為受體，催化合成相應的多一個葡萄糖基團的低聚糖，例如將葡萄糖和蔗糖為底物轉化生成益生元曲二糖[8]；2）糖苷類化合物的制備：蔗糖磷酸化酶還可以作用于含醇羥基、酚羥基及羧基的化合物，如催化對苯二酚合成具有美白功效的α-熊果苷[9]，催化甘油合成保濕劑α-D-葡萄糖甘油[10]，以及催化抗壞血酸合成穩(wěn)定性高且水溶性好的抗氧化劑2-O-α-D-吡喃葡糖基-L-抗壞血酸（2-Oα-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid，AA-2G）[11]等；3）植物多酚類化合物制備：蔗糖磷酸化酶可以作用于某些植物多酚提高其穩(wěn)定性和水溶性，例如蔗糖磷酸化酶可催化白藜蘆醇生成白藜蘆醇3-α-葡萄糖苷[12-13]，以及催化兒茶素生成兒茶素-3-O-D-葡萄糖苷[14-15]等。

蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，SPase）主要來源于微生物，但其在野生型菌株中的合成途徑復雜，酶產量較低，難以滿足工業(yè)需求[9]。近年來，已通過異源表達實現(xiàn)了不同來源的蔗糖磷酸化酶的高效表達。例如來源于青春雙歧桿菌[16]（Bifidobacteriumadolescentis）、短雙歧桿菌[11]（Bifidobacteriumbreve）、長雙歧桿菌[17]（Bifidobacteriumlongum）、腸膜明串珠菌[18]（Leuconostocmesenteroides）、羅伊氏乳桿菌[19]（Lactobacillusreuteri）、嗜熱桿菌[20]（Thermobacillussp.）和變異鏈球菌[21]（Streptococcusmutans）等的蔗糖磷酸化酶已在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效的異源表達。其中，Kwon 等[22]成功構建了來源于長雙歧桿菌的蔗糖磷酸化酶（Bifidobacteriumlongumsucrose phosphorylase, BloSPase）的重組菌株并表達了蔗糖磷酸化酶，首次利用蔗糖磷酸化酶合成了AA-2G。Gudiminchi 等[17]也利用異源表達的BloSPase 成功合成了AA-2G，并且發(fā)現(xiàn)該酶表現(xiàn)出特殊的pH 依賴性優(yōu)勢，在pH 值為5.2 時，具有較高的效率和較好的位點選擇性，且雜質AA-6G 的產量較少。Zhou 等[11]比較了8 個不同來源的蔗糖磷酸化酶合成AA-2G 時的轉糖基化活力，其中BloSPase 表現(xiàn)出了較高的轉糖基化活力。因此，BloSPase 在合成AA-2G 方面極具應用潛力。

本研究選擇pET-28a 和大腸桿菌BL21（DE3）作為表達載體和表達宿主，對BloSPase 進行異源表達，為提高其可溶性表達的產量，考察誘導時間、誘導溫度和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）濃度對BloSPase 表達的影響，確定BloSPase 的最佳表達條件；采用鎳離子柱親和層析純化BloSPase，并對BloSPase 的轉糖基化活力及其酶學參數(shù)進行表征，以期為BloSPase 的進一步應用及分子改造提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）由天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院實驗室保存。LB 培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基添加2% 瓊脂粉）、瓊脂粉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：北京索萊寶科技有限公司；蛋白分子量Marker：上海百賽生物技術股份有限公司；蛋白上樣緩沖液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）緩沖液、Ni-NTA 親和層析填料：金斯瑞生物科技股份有限公司；質粒小提試劑盒、卡那霉素、咪唑、磷酸鹽緩沖液、高效感受態(tài)細胞制備試劑盒、改良型二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、IPTG、DNA Marker（300~2 500 bp）：生工生物工程（上海）股份有限公司；超濾管（截留10 kDa）：美國Millipore 公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PCR 儀（Mastercycler nexus gradient）、高速冷凍離心機（Centrifuge 5430）：德國Eppendorf 公司；超微量分光光度計（NanoPhotometer?N60）：德國Implen GmbH公司；超聲波細胞粉碎機（SCIENTZ-IID 型）：寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（SPX-100B-D）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；恒溫搖床（ZQTY-70）：上海知楚儀器有限公司；蛋白電泳儀（PowerPac Universal）：美國BIO - RAD 公司；高效液相色譜儀（ECLassical 3100）：大連依利特分析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 重組質粒pET-28a/BloSPase 的構建

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找到BloSPase 的基因序列（GenBank 編號：AAO84039），按照大腸桿菌的密碼子偏好性進行優(yōu)化，并將NdeI 和BamH I 兩個酶切位點分別加到序列的5'端和3'端，選擇pET-28a 為載體，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成得到含BloSPase 基因的重組質粒pET-28a/BloSPase。將合成得到的重組質粒轉化進入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，并涂布于LB 固體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素），挑取單菌落轉接到LB 液體培養(yǎng)基（50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、200 r/min 恒溫搖床培養(yǎng)，設計擴增BloSPase 基因的引物（上游引物F：5'-GGCAGCCATATGAAAAACAAAGTTCAG-3'，下游引物R：5'-CGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAAT-3'），通過菌液聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證陽性后提取質粒進行測序驗證。

1.3.2 重組菌的誘導表達

將重組菌的單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素）中，于37 ℃、200 r/min 恒溫搖床培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)物按1% 接種量轉接至50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素）中，于37 ℃、200 r/min恒溫搖床培養(yǎng)，直至OD600值約0.6 時，加入IPTG 誘導蛋白表達，于恒溫搖床孵育。將菌液離心收集細胞（10 000×g，4 ℃，10 min），再重懸浮于50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，于冰上超聲破碎細胞（95 W，超聲2.5 s，間歇3 s，總共10 min）。將裂解液離心（10 000×g，4 ℃，10 min），保留上清液，即為粗酶液。

1.3.3 重組BloSPase 誘導表達條件的優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

通過單因素試驗優(yōu)化BloSPase 的表達條件，以IPTG 濃度、誘導時間、誘導溫度為變量，以粗酶液水解蔗糖的酶活力為指標評價BloSPase 表達量。加入濃度分別為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L 的IPTG，24 ℃誘導8 h，考察IPTG 濃度對BloSPase 表達量的影響；加入濃度為0.50 mmol/L 的IPTG，分別于16、20、24、28、32 ℃，誘導8 h，考察誘導溫度對BloSPase 表達量的影響；加入濃度為0.50 mmol/L 的IPTG，于24 ℃下，分別誘導6、8、10、12、18、24 h，考察誘導時間對BloSPase表達量的影響。每個試驗重復3 次取平均值。

1.3.3.2 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，使用Design Expert 8.0.6.1 軟件，設計以誘導溫度、誘導時間、IPTG 濃度為變量，以BloSPase 的水解酶活力為響應值的三因素三水平響應面試驗，確定重組BloSPase 表達的最佳條件。試驗設計編碼見表1。

表1 響應面試驗因素與水平編碼Table 1 Factors and levels for response surface experiment

1.3.4 重組BloSPase 的純化

使用0.22 μm 的微孔濾膜過濾粗酶液后將其與結合緩沖液（300 mmol/L 氯化鈉，50 mmol/L 磷酸二氫鈉，20 mmol/L 咪唑，pH7.4）按體積比1∶1 混合均勻。用結合緩沖液以1 mL/min 的流速平衡鎳柱后，再將混合液上樣到鎳柱中，以0.5 mL/min 流速流穿。待樣品與鎳柱結合孵育1 h 后，用洗滌緩沖液（300 mmol/L 氯化鈉，50 mmol/L 磷酸二氫鈉，100 mmol/L 咪唑，pH7.4）洗去雜蛋白，再用洗脫緩沖液（300 mmol/L 氯化鈉，50 mmol/L 磷酸二氫鈉，250 mmol/L 咪唑，pH7.4）洗脫并收集目的蛋白。收集到的蛋白洗脫液于去離子水中進行透析后，再用超濾管進行離心（4 500×g，4 ℃，30 min）濃縮得到純蛋白，并通過SDS-PAGE 分析檢測。

1.3.5 重組BloSPase 的蛋白含量及水解酶活力測定

BloSPase 的蛋白濃度測定采用二喹啉甲酸法，使用改良型BCA 蛋白濃度測定試劑盒，在波長562 nm下測定吸光值計算蛋白濃度。以牛血清蛋白為標準蛋白，并且以其蛋白濃度為橫坐標（x），紫外吸光系數(shù)為縱坐標（y），在562 nm 波長下測得標準曲線為y=0.000 4x- 0.006 8（R2=0.999 7）。

BloSPase 水解酶活力的測定采用DNS 還原糖測定法[23-24]。反應體系包括5% 蔗糖溶液250 μL，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）225 μL，稀釋適當倍數(shù)的酶液25 μL，37 ℃水浴10 min 后，立即加入375 μL DNS 試劑沸水浴10 min，冷卻至室溫后測定540 nm 下的吸光值。配制不同濃度的果糖溶液，同樣條件下與DNS 試劑反應，繪制標準曲線為y= 0.793 3x- 0.059 9（R2=0.999 9）。蔗糖磷酸化酶的一個酶活力單位（U）定義為每分鐘水解蔗糖生成1 mmol 的果糖所需的酶量。

1.3.6 重組BloSPase 的轉糖基化活力的測定

BloSPase 的轉糖基化活力測定參考文獻[11]的方法并稍作修改，反應體系設為500 μL，其中含有1.2 mol/L 的L-抗壞血酸、0.8 mol/L 蔗糖、100 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液和250 μg/mL 純化酶，于40 ℃孵育72 h，反應結束后將反應混合物取出加入0.05 mol/L 的鹽酸溶液終止反應。采用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀和COSMOSIL PBr 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），以1% 甲醇（磷酸調至pH2.5）為流動相，并設置流動相流速為0.8 mL/min，在檢測波長238 nm 下，對L-抗壞血酸及AA-2G 進行檢測。

一個單位（U）的轉糖基化活力是指在給定條件下每分鐘形成1 μmol 的AA-2G 的酶的量。

1.3.6.1 pH 值對重組BloSPase 轉糖基活力和穩(wěn)定性的影響

按照1.3.6 的方法，在不同pH 值（4.0~7.0）的100 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液中，測定BloSPase 轉糖基化活力的最適pH 值。將純化酶置于不同pH 值的100 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液（4.0~7.0）中于4 ℃保存12 h 后，測定其殘余酶活力，考察BloSPase 的pH 值穩(wěn)定性。以最高的轉糖基化活力為100%，計算相對酶活力。上述每個試驗重復3 次。

1.3.6.2 溫度對重組BloSPase 轉糖基活力和穩(wěn)定性的影響

在最適pH 值下，將純化酶置于不同溫度（30~65 ℃）下反應，測定BloSPase 的轉糖基化活力的最適溫度。將純化酶分別在40、50、60 ℃下孵育0、12、24、36、48、60、72 h 后，測定其殘余酶活力，考察BloSPase的熱穩(wěn)定性。以最高的轉糖基化活力為100%，計算相對酶活力。上述每個試驗重復3 次。

1.3.6.3 重組BloSPase 的酶促反應動力學測定

在40 ℃和最適pH 值條件下，測定以不同濃度（50~500 mmol/L）的L-抗壞血酸為底物時的酶活力。根據(jù)AA-2G 產物的量評估最初1 h 的反應速度。使用Origin 2021 軟件通過米氏方程對不同L-抗壞血酸濃度下的初始速率進行非線性擬合，計算動力學參數(shù)（Km和Vmax）。上述每個試驗重復3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3 次求平均值，使用Microsoft Excel 2019 軟件、Origin 2021 軟件對單因素試驗結果進行分析和制圖，并使用Design Expert 8.0.6.1 軟件設計響應面試驗和分析試驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET-28a/BloSPase 的表達

將重組質粒pET-28a/BloSPase 轉化進入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，以重組菌的單克隆菌液為模板，進行菌液PCR 擴增驗證，擴增產物見圖1。

圖1 重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-28a/BloSPase 菌液PCR 鑒定結果Fig. 1 Results of PCR identification of recombinant Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a/BloSPase

由圖1 可知，擴增產物大小約為1 500 bp，與目的基因大小一致。并且質粒測序結果顯示序列正確，表明重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-28a/BloSPase 構建成功。對重組菌誘導表達后，通過超聲破碎后離心取上清液，通過SDS-PAGE 電泳分析BloSPase 表達情況，結果見圖2。

圖2 重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-28a/BloSPase 表達的SDSPAGE 分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a/BloSPase expression

由圖2 可知，重組菌菌液加入IPTG 誘導后，在約56 kDa 出現(xiàn)了明顯的目的條帶，與目的蛋白質分子量大小一致，表明了BloSPase 能夠在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達。而重組菌未誘導表達時，在約56 kDa 處有淺顯的目的條帶，可能是因為在T7 強啟動子下重組菌也會表達微量目的蛋白。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 IPTG 濃度對重組BloSPase 表達的影響

按1.3.2 方法接種得到菌液，在OD 值約0.6 時，分別添加濃度為0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L 的IPTG，在24 ℃下，誘導8 h 后，將菌液超聲破碎后離心取上清液，對其水解酶活力進行測定，結果見圖3。

圖3 IPTG 濃度對重組BloSPase 表達的影響Fig.3 Effect of IPTG concentration on the expression of recombinant BloSPase

由圖3 可知，當IPTG 濃度在0.10~0.50 mmol/L 時水解酶活力逐漸增加，在IPTG 濃度為0.50 mmol/L 時水解酶活力達到最大，當IPTG 濃度大于0.50 mmol/L后水解酶活力開始下降。這主要是因為IPTG 濃度會影響蛋白的表達速率、溶解度及活性，而過高濃度不利于蛋白的表達和細胞活性，會導致蛋白質在表達過程中形成包涵體并抑制大腸桿菌的生長。但加入適量的IPTG，則能降低大腸桿菌細胞的代謝負荷，提高表達水平[25-27]。因此，IPTG 濃度選擇0.50 mmol/L 左右進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。

2.2.2 誘導溫度對重組BloSPase 表達的影響

為探究不同誘導溫度對重組BloSPase 表達的影響，將菌液分別于16、20、24、28、32 ℃下誘導，制備粗酶液，對其水解酶活力進行測定，結果見圖4。

圖4 誘導溫度對重組BloSPase 表達的影響Fig.4 Effect of induction temperature on the expression of recombinant BloSPase

由圖4 可知，當誘導溫度為24 ℃時，BloSPase 的水解酶活力最高；當溫度小于或大于24 ℃時，水解酶活力均較低。因為誘導溫度不僅影響細菌的生長，還影響重組蛋白的表達和蛋白的溶解性[28]。一般來說，細菌細胞在低溫下生長緩慢，低溫使細胞內代謝酶的活性降低，導致重組蛋白質的合成速度降低。在更高的溫度下，蛋白質的合成可以加速，但過高的溫度可能會阻止酶蛋白質的正確折疊，從而使蛋白質沒有達到足夠的溶解度，導致形成不活躍的包涵體[29]。因此，誘導溫度選擇24 ℃左右進行后續(xù)的響應面優(yōu)化試驗。

2.2.3 誘導時間對重組BloSPase 表達的影響

為探究誘導時間對重組BloSPase 表達的影響，將菌液分別誘導6、8、10、12、18、24 h，制備粗酶液，對其水解酶活力進行測定，結果見圖5。

圖5 誘導時間對重組BloSPase 表達的影響Fig.5 Effect of induction time on the expression of recombinant BloSPase

由圖5 可知，當誘導時間在6~8 h 內，水解酶活力呈升高趨勢，在8 h 時水解酶活力達到峰值。隨著誘導時間的延長，水解酶活力逐漸降低，可能是由于環(huán)境發(fā)生變化以及培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的限制，目的蛋白在表達的同時被大量降解，同時誘導時間過長也會對細胞活性產生消極影響，出現(xiàn)菌體老化從而使表達量降低[30-31]。因此，誘導時間選擇8 h 左右進行后續(xù)的響應面優(yōu)化試驗。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果

單因素試驗顯示重組BloSPase 的最佳誘導條件為誘導時間8 h、IPTG 濃度0.5 mmol/L、誘導溫度24 ℃，在此基礎上確定響應面試驗的因素水平進行優(yōu)化。以誘導溫度（A）、誘導時間（B）、IPTG 濃度（C）為自變量，BloSPase 的水解酶活力為響應值，響應面試驗設計見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of the response surface experiment

2.3.2 響應面回歸模型的構建與方差分析

使用Design Expert 8.0.6.1 軟件對表2 結果進行分析，建立二次多項回歸方程：Y= 692.62+20.34A+98.79B+20.54C-54.95AB+7.21AC-37.37BC-82.00A2-61.43B2-62.98C2，并對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

由表3 可知，該模型的失擬項P=0.316 8>0.05，模型P<0.000 1，表明該模型與實際試驗的擬合程度好；回歸模型的決定系數(shù)R2=0.978 8，校正決定系數(shù)R2Adj=0.951 6，說明模型擬合程度好，誤差小，可用于預測BloSPase 酶活力。B、AB對結果影響極顯著（P<0.01），A、C、BC對結果影響顯著（P<0.05），二次項A2、B2和C2對結果影響極顯著（P<0.01）。通過F值大小判斷3 個因素對BloSPase 酶活力的影響的大小為B（誘導時間）>C（IPTG 濃度）>A（誘導溫度）。

通過Design Expert 8.0.6.1 繪制出各因素之間交互作用的響應曲面和等高線見圖6。

圖6 各因素相互作用的響應曲面及等高線Fig.6 Response surfaces and contour lines of the interaction of various factors

由圖6 可知，誘導溫度與誘導時間的相互作用的等高線呈橢圓形，且響應面曲面坡度陡峭，說明誘導溫度和誘導時間交互作用對BloSPase 水解酶活力的影響極顯著（P<0.01）；誘導溫度和IPTG 濃度相互作用等高線呈圓形，且響應面曲面坡度不陡峭，則兩者之間的相互作用不顯著（P>0.05）；誘導時間和IPTG 濃度相互作用的等高線呈橢圓形，且響應面曲面坡度相對陡峭，表明誘導時間和IPTG 濃度之間的交互作用顯著（P<0.05）。這與方差分析結果一致。

2.3.3 驗證試驗結果

通過Design Expert 8.0.6.1 軟件建立的回歸模型，預測的最佳誘導條件是誘導時間為9.86 h、IPTG 濃度為0.47 mmol/L、誘導溫度為23.23 ℃，此條件下BloSPase的水解酶活力可以達到735.213 U/mL。結合實際情況，誘導條件設為IPTG 濃度0.47 mmol/L、誘導溫度23 ℃、誘導時間10 h。在此條件下進行驗證，水解酶活力達到（730.35 ±0.58）U/mL，與模型預測值較接近，擬合性較好，驗證了該模型的有效性。Zhang 等[30]也對來源于長雙歧桿菌JCM1217 的蔗糖磷酸化酶的表達條件進行優(yōu)化，但所得到的最佳表達條件與該試驗優(yōu)化的最佳表達條件不同，可能因為蔗糖磷酸化酶基因來源于不同菌株，且表達載體不同，從而導致其所需的表達條件不同。并且將粗酶液用鎳柱純化后比酶活達到（95.22±2.45）U/mg。

2.4 重組BloSPase 的轉糖基化酶學性質分析

pH 值和溫度對酶的轉糖基化活力和穩(wěn)定性的影響見圖7。

圖7 pH 值和溫度對重組BloSPase 轉糖基化活力及穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of pH and temperature on transglycosylation activity and stability of recombinant BloSPase

由圖7A 可知，BloSPase 的最適pH 值為5.2，與Gudiminchi 等[17]所報道的一致，BloSPase 的糖基化活力具有嚴格的pH 依賴性，只在很窄的pH 范圍內起作用；當pH 值為4 時，BloSPase 的糖基化活力幾乎檢測不到；此外，當pH>5.2 時，轉糖基化活力迅速下降。如圖7B 所示，BloSPase 在pH4.5~7.0 的檸檬酸鈉緩沖液中4 ℃保存24 h 后，殘余酶活力在80% 以上，說明在此范圍內BloSPase 的酸堿穩(wěn)定性較好。如圖7C 所示，轉糖基化反應的最適溫度為50 ℃，但當孵育溫度高于50 ℃時，其活性迅速下降；在30~60 ℃范圍內反應，能保持約50% 以上的酶活力；當溫度上升至65 ℃時，只殘余約8% 的酶活力。如圖7D 所示，BloSPase在40 ℃和50 ℃下孵育72 h 后，其殘余酶活力仍保持在80% 以上，證明BloSPase 的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)優(yōu)異。

2.5 重組BloSPase 的Km 和Vmax

測定重組BloSPase 以不同濃度L-抗壞血酸為底物的轉糖基化活力，得到BloSPase 動力學參數(shù)Km為（266.80±23.76）mmol/L，Vmax為（0.235 0±0.009 9）mmol/（L·min）。與來源于短雙歧桿菌[11]的蔗糖磷酸酶的Km（388.0±24.2）mmol/L 相比，本研究中的BloSPase 的Km值相對更低，表明該酶與底物L-抗壞血酸的親和力更大。

3 結論

本研究成功構建了BloSPase 的重組表達菌，實現(xiàn)了BloSPase 在大腸桿菌中的異源表達。通過單因素及響應面法優(yōu)化了重組BloSPase 的表達條件，在最優(yōu)的誘導條件（IPTG 濃度0.47 mmol/L、誘導溫度23 ℃、誘導時間10 h）下，重組BloSPase 的水解酶活力達到（730.35±0.58）U/mL，通過鎳離子親和層析柱純化后，BloSPase 的水解比酶活達到（95.22±2.45） U/mg。BloSPase 的轉糖基化活力研究表明，最適反應溫度為50 ℃，且在40 ℃和50 ℃下，該酶的相對酶活力仍保持80% 以上，該酶具有良好的熱穩(wěn)定性；最適pH 值為5.2，并且在pH 值為4.5~7.0 時，相對酶活力仍保持80% 以上，酶具有較好的pH 值穩(wěn)定性。以抗壞血酸作為反應底物時，BloSPase 的動力學反應參數(shù)Km值為（266.80±23.76）mmol/L，Vmax值為（0.235 0±0.009 9）mmol/（L·min）。本研究通過對來源于長雙歧桿菌的BloSPase 的異源表達條件的優(yōu)化及其轉糖基化相關的酶學性質的測定，為其后續(xù)的轉糖基化應用以及基于蛋白質工程的改造提供了重要的參考價值。