侯澤樺，李羨鈺，孫雯可，謝艾伶，劉全瑞，劉鼎闊，于曉雪 ，李留安

（1.天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津市農業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2.鼎正新興生物技術（天津）有限公司 天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點實驗室，天津 300383）

水飛薊賓（silybin，SLB）是菊科植物水飛薊果實提取物的主要生物活性物質，是天然的黃酮木質素類化合物[1]，其已有上千年的藥用歷史。研究表明，水飛薊賓具有保肝、抗腫瘤、抗炎、抗代謝功能失調等多種生物活性功能[2-3]，廣泛應用于醫(yī)藥領域。雞肉具有低脂肪、高蛋白的特點，是國民膳食中肉類的重要組成部分。功能性食品是指具有特定營養(yǎng)保健功能的食品，即具有調節(jié)機體功能、不以治療為目的的食品。功能性食品形式多種多樣，如飲料、沖劑、烘焙制品等[4]，雞肉也可作為功能性食品的一種。檢測功能性食品中活性物質含量對于保證營養(yǎng)供給和品質檢測是非常必要的。目前國內外關于水飛薊賓含量的測定研究多集中在植物提取、醫(yī)藥等方面。石萬銀等[5]利用高效液相色譜法測定得到水飛薊提取物中水飛薊賓的含量不低于20%。周旖璇等[6]通過建立高效液相色譜法測定大鼠血漿中水飛薊賓的含量，測得水飛薊賓在大鼠體內的消除半衰期為（9.9±0.9）h。但目前國內外關于動物產品中水飛薊賓含量檢測方法未見報道。本研究通過在雞基礎飼糧中添加水飛薊賓，獲得富含水飛薊賓的雞肉，并建立高效液相色譜法檢測試驗雞肉中水飛薊賓含量的方法，以期為后續(xù)開發(fā)含水飛薊賓的功能性雞肉及其有效含量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗雞肉樣品：天津農學院實訓基地。將135 只雞隨機分為3 組，每組45 只。第1 組為對照組，飼喂基礎飼料；第2 組在基礎日糧中添加0.5%（質量分數(shù)）的水飛薊賓；第3 組在基礎日糧中添加1%（質量分數(shù)）的水飛薊賓。30 d 后每組隨機抽取10 只雞進行屠宰采集雞肉，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

水飛薊素（純度≥98%）：陜西云奇生物科技有限公司；水飛薊賓標準品（純度95.7%）：中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）：德國Merck 公司；乙酸乙酯（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（1260）：安捷倫科技有限公司；超聲波清洗機（SB-100D）：寧波新芝生物科技股份有限公司；旋轉蒸發(fā)儀（IKA RV 10）：上海予申儀器有限公司；多用途渦旋混合器（VORTEX-6）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子分析天平（FB223）：上海舜寧恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

參照《中華人民共和國藥典》2020 版一部[7]中水飛薊賓含量測定方法的高效液相色譜條件進行優(yōu)化。色譜柱：Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為水∶甲醇= 43∶57、47∶53、53∶47（體積比）；流速：0.65、0.70 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：288 nm；進樣量：20 μL。

1.3.2 標準溶液配制

標準儲備液：準確稱取水飛薊賓標準品20 mg 于50 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到400 μg/mL 水飛薊賓溶液，取400 μg/mL 水飛薊賓溶液250 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻放置備用，所得水飛薊賓標準儲備液濃度為10 μg/mL。

標準工作液：依次吸取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 水飛薊賓標準儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到系列濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的水飛薊賓標準工作液。

1.3.3 標準曲線繪制

將配制好的0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL 的標準工作溶液參照1.3.1 的液相色譜條件進行分析，以水飛薊賓的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到水飛薊賓的標準曲線線性回歸方程。

1.3.4 精密度測定

用1 μg/mL 的標準工作液，重復測定6 次，計算精密度。

1.3.5 樣品前處理

稱10 g 雞肉樣品剪碎置于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻，超聲30 min，以10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)濾紙過濾置于圓底燒瓶中，90 ℃旋轉蒸發(fā)，2 mL 甲醇復溶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，待高效液相色譜儀檢測。

1.3.6 回收率測定

精密稱取10 g 空白雞肉樣品9 份，將濃度為0.5、1.0、2.5 μg/mL 的標準工作液分別加入樣品中，每個濃度3 份，每份加1 mL，按1.3.5 方法進行處理，測得峰面積，代入標準曲線方程，算出實際濃度，計算回收率。

1.3.7 雞肉樣品測定

按照1.3.5 方法對試驗雞肉樣品進行處理，按照1.3.1 色譜條件進行測定。樣品中的水飛薊賓含量根據(jù)標準曲線方程進行換算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用單因子方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA），并采用Duncan法進行多重比較，進行組間顯著性分析，P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

色譜基本條件的優(yōu)化見表1。

由表1 可知，有機相比例越大，保留時間越短，在水飛薊賓A、B 兩峰分離完全的前提下，當水與甲醇體積比為47∶53 時，保留時間最短。當流速提高到0.70 mL/min，由于柱壓過大，檢測程序終止。為使兩峰完全分離，準確定量檢測水飛薊賓，最終選用色譜條件為水∶甲醇=47∶53（體積比），流速0.65 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長288 nm，進樣量20 μL。

2.2 標準曲線

水飛薊賓標準曲線見圖1。

圖1 水飛薊賓標準曲線Fig.1 Standard curve of silybin

由圖1 可知，水飛薊賓標準曲線方程為y=95.16x-0.875 3，相關系數(shù)R2=0.999 6，表明水飛薊賓標準品濃度在0.1~5.0 μg/mL 時與峰面積線性關系良好。

2.3 檢出限和定量限

以峰高為3 倍平均信噪比時的濃度為檢出限（limit of detection，LOD），以峰高為10 倍平均信噪比時的濃度為定量限（limit of quantitation，LOQ），計算得本方法的LOD 和LOQ 分別為0.022 μg/g 和0.073 μg/g。

2.4 精密度測定

精密度試驗結果見表2。

表2 精密度試驗結果Table 2 Precision test results

由表2 可知，此方法相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.89%，表明精密度良好。

2.5 回收率測定

樣品加標回收率如表3 所示。

表3 樣品加標回收率Table 3 Recovery rate of samples with added standard substance

由表3 可知，水飛薊賓的平均回收率在88.45%~104.34% 之間，相對標準偏差最大為2.94%。該結果表明，本檢測方法具有良好的回收率。

2.6 標準品和雞肉樣品色譜圖

水飛薊賓標準品和試驗樣品色譜圖見圖2。

圖2 標準品和樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard substance and sample

由圖2 可知，試驗雞肉中水飛薊賓色譜峰的分離情況和峰形良好，對照雞肉樣品中無目的峰。水飛薊賓由水飛薊賓a 和水飛薊賓b 兩個非對映異構體等比例組成，為雙峰。

2.7 試驗雞肉樣品水飛薊賓含量測定結果

按照1.3.5 和1.3.1 的方法對試驗雞肉進行前處理和測定，試驗雞肉樣品水飛薊賓含量測定結果如圖3所示。

圖3 高效液相色譜法檢測試驗雞肉中水飛薊賓含量Fig.3 Determination of silybin in experimental chicken by HPLC

由圖3 可知，對照組雞肉中未檢測出水飛薊賓，0.5% 試驗組雞肉中水飛薊賓平均含量為（0.167±0.010）μg/g，1.0% 試驗組雞肉中水飛薊賓平均含量為（0.302±0.033）μg/g，結果表明，在日糧中添加的水飛薊賓能夠在雞肉中富集，且富集效果與添加比例有關，1.0% 試驗組含量顯著高于0.5% 試驗組（P<0.05）。

3 討論與結論

水飛薊素的護肝、抗氧化、免疫調節(jié)等多種生物活性功能，使其在保健品、醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應用。自我國養(yǎng)殖業(yè)全面禁抗后，水飛薊素在畜牧業(yè)中展現(xiàn)出較好的應用前景。有研究表明，在飼糧中添加水飛薊素可有效促進畜禽生長，維護機體健康，有利于抵抗各種不良應激反應[8-9]。Bendowski 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞的飲用水中添加水飛薊提取物可促進機體健康，提高生產性能，血清抗氧化能力更強，試驗組傳染性法氏囊炎發(fā)生率顯著低于對照組。上述研究均為開發(fā)水飛薊賓作為畜禽飼料添加劑提供了理論基礎。此前有在雞肉中成功富集硒元素的試驗，朱梅芳等[11]在靈山土雞日糧中使用自主配制的紅棗富硒飼料，獲得了富硒雞肉和雞蛋，且改善了雞肉和雞蛋的風味。也有關于水飛薊賓在動物內臟中分布的研究，李秋紅等[12]通過給大鼠靜脈注射水飛薊賓葡甲胺鹽注射液后，以叔丁基甲醚為提取劑從大鼠心、肝、脾、肺、腎組織勻漿中均檢測到了水飛薊賓，且在體內分布的濃度大小順序依次為肺、肝、心、腎、脾。但由于水飛薊賓具有高度疏水性和非電離性的化學結構，導致水飛薊賓水溶性差，口服生物利用率低[13]，推測其導致水飛薊賓在機體內富集效率較低。通過將水飛薊賓制成納米晶體，有效改善了藥物在體內的吸收，提高了生物利用度[14]。

本試驗通過在雞基礎飼糧中添加0.5%、1.0% 的水飛薊賓來獲得試驗雞肉樣品，結合水飛薊賓易溶于有機溶劑的特性，以乙酸乙酯作為提取試劑對試驗雞肉進行預處理，建立了一種高效液相色譜測定試驗雞肉中水飛薊賓含量的方法，在色譜條件為流動相（水∶甲醇=47∶53，體積比）、流速0.65 mL/min、柱溫30 ℃時，可在飼糧添加水飛薊賓后獲得的試驗雞肉中檢測出水飛薊賓，此方法操作簡便、定量準確、所出色譜峰峰型良好，精密度和回收率較高，為水飛薊賓在雞肉中的含量測定提供了方法參考。