孫景昱,趙 薇,孫績(jī)巖,石 奔,李可維,黃 鑫

沙門氏菌 (Salmonella)是一種革蘭氏陰性桿菌,是我國(guó)最常見的人獸共患病原菌。其血清型眾多,在我國(guó)分布有300多種,部分血清型可通過細(xì)菌代謝產(chǎn)生的內(nèi)毒素引起食物中毒[1]。常見的沙門氏菌有鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌[2]。 沙門氏菌主要通過肉類、雞蛋、奶制品與水源傳播。根據(jù) WHO發(fā)布的全球食源性疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告顯示,由沙門菌導(dǎo)致的胃腸炎疾病負(fù)擔(dān)約為400萬,占食源性微生物導(dǎo)致的胃腸炎疾病負(fù)擔(dān)的22.2%[3]。目前, 對(duì)沙門菌的預(yù)防和抗感染治療主要是依賴抗生素, 抗生素可以通過影響細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)的生成、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的形成、改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性以及抑制核酸的復(fù)制轉(zhuǎn)錄等方式來干擾細(xì)菌的正常生長(zhǎng), 從而達(dá)到抑菌作用[4]。但抗生素的大量使用促使了細(xì)菌快速產(chǎn)生耐藥性,并出現(xiàn)多重耐藥菌株,給臨床治療帶來巨大困難。因此,本研究通過對(duì)2022年吉林省食品中61株沙門氏菌的調(diào)查研究,針對(duì)血清型分布、耐藥表型、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)以及耐藥基因進(jìn)行分析比對(duì),深入了解吉林省食品中沙門氏菌耐藥性分布特點(diǎn),為防控診斷以及進(jìn)一步的治療提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 樣本來源 收集2022年對(duì)吉林省9個(gè)市州的食品樣品進(jìn)行了沙門氏菌污染狀況監(jiān)測(cè),包括肉及肉制品、乳與乳制品、調(diào)味品、餐飲食品,共5個(gè)食品類別。分離得到的61株沙門氏菌,均經(jīng)吉林省疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室復(fù)核。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基及儀器 緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯(北京陸橋股份有限公司);沙門氏菌顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉公司);API 20E生化試劑盒(法國(guó)生物梅里埃公司);VITEK2 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)GN鑒定卡(法國(guó) BioMrieux公司);沙門氏菌屬診斷血清(丹麥 Statens serum institut 公司);以上均在有效期內(nèi)使用。SLI-700生化培養(yǎng)箱(上海愛朗儀器有限公司);Nu-425生物安全柜(美國(guó)紐埃爾公司);Legend Micro 17高速離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)

1.2 方 法

1.2.1 檢驗(yàn)方法 按照 GB/T 4789.4《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》以及《國(guó)家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》中食源性致病菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行檢驗(yàn)[5-6]。

1.2.2 藥物敏感性試驗(yàn) 對(duì)2022年的61株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),共檢測(cè)25種抗生素。藥敏結(jié)果根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)出版的藥物敏感試驗(yàn)指南 M100 32nd Edition進(jìn)行判定[7],質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC 25922。

1.2.3 基因組提取、全基因組測(cè)序以及數(shù)據(jù)處理 挑取單個(gè)菌落接種至5 mL BHI肉湯中,37 ℃培養(yǎng)過夜,按QIAamp DNA Mini Kit 試劑盒說明書提取基因組DNA,將核酸提取液送至北京博鰲鷹飛生物有限公司,進(jìn)行文庫構(gòu)建和全基因組測(cè)序(Whole Genome Sequencing,WGS)。流程如下:對(duì)61個(gè)DNA樣品構(gòu)建文庫,利用Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端高通量測(cè)序,測(cè)序深度為100×。下機(jī)后,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制,將過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行denovo組裝,得到基因組contigs序列。

依托全民健康保障信息化工程食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估業(yè)務(wù)應(yīng)用平臺(tái)(https://sppt.cfsa.net.cn/goto/blogin,以下簡(jiǎn)稱平臺(tái)),對(duì)61個(gè)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行MLST分析,確定其ST型別,通過平臺(tái)中CARD、ResFinder數(shù)據(jù)庫篩選沙門氏菌耐藥基因。

2 結(jié) 果

2.1 血清型分布情況 61株沙門菌分屬5個(gè)群,19個(gè)血清型,其中以D群占比最高68.85%(42/61);C群占比次之16.39(10/61);B群居中為8.20%(5/61);E群、G群占比較低,分別為4.92%(3/61)、1.64%(1/61)。19個(gè)血清型中腸炎沙門菌占比最高,達(dá)52.46%(32/61),為吉林省優(yōu)勢(shì)血清型,其次為蓋勒特匹沙門氏菌占比13.11%(8/61),詳見表1。

表1 沙門氏菌血清分布表

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)將藥物敏感類型分為耐藥型(R)、敏感型(S)、中介型(I)3類,61株沙門氏菌對(duì)25種不同抗菌藥物表現(xiàn)出了不同的耐藥性。藥敏結(jié)果顯示沙門氏菌對(duì)氨芐西林耐藥率最高為60.66%(37/61),其次為四環(huán)素占39.34%(24/61),氨芐西林/舒巴坦為24.59%(15/61)、多粘菌素E與頭孢唑林耐藥率均為22.95%(14/61),多粘菌素B為21.31%(13/61),其余抗生素耐藥率均低于20%。頭孢西丁、頭孢他啶、厄他培南、亞胺培南、替加環(huán)素均無耐藥菌株檢出,詳見表2。

表2 25種抗生素對(duì)沙門菌耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析 61株沙門氏菌基因組長(zhǎng)度為4 642 406～5 043 210 bp,GC含量在51.73%～52.21%之間。contig數(shù)量范圍在19～90個(gè)之間,均為29個(gè),其中數(shù)量小于40的菌株數(shù)占85.25%(52/61),Q30對(duì)應(yīng)堿基準(zhǔn)確率均大于85%。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好,進(jìn)行后續(xù)分析。

2.4 沙門菌的多重耐藥(MDR)模式及耐藥譜 61株耐藥沙門菌中包含耐藥菌株49株,占所有菌株的78.69%(49/61),單耐藥菌菌株占40.82%(20/49),雙重耐藥菌株占28.57%(14/49),同時(shí)耐3類以上抗生素的菌株即MDR菌株,占30.61%(15/49)。

25種抗生素共產(chǎn)生31種耐藥譜,無明顯優(yōu)勢(shì)耐藥譜,其中耐藥菌株數(shù)最多的有8株,為單耐藥譜AMP;其次為 AMP-TET與CT-PB,均有5株。多重耐藥譜中菌株數(shù)最多的譜型為CHL-TET-FFC,有3株,詳見表3。

表3 61株沙門菌耐藥譜

2.5 多位點(diǎn)序列分型(MLST) 根據(jù)平臺(tái)分析結(jié)果61株沙門氏菌共包含ST型13種,其中ST11型占比最高為68.85%(42/61),是吉林省優(yōu)勢(shì)ST型;其次為ST1541型占8.20%(5/61)。腸炎菌、蓋勒特匹、布利丹Ⅱ 3種血清型分型結(jié)果全部為ST11,查理沙門氏菌、山夫登堡沙門氏菌、里森沙門氏菌3種血清型分別為ST1541、ST14、ST469型,詳見圖1。

2.6 耐藥基因 根據(jù)平臺(tái)中CARD、Resfinder數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果,61株沙門氏菌均攜帶耐藥基因,共預(yù)測(cè)耐藥基因97種,主要包含以下7類:氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、鏈霉素類、四環(huán)素類,氟喹諾酮類、磺胺類、苯丙醇類,其攜帶率分別為100%(61/61)、62.30%(61/61)、55.74%(34/61)、40.98%(25/61)、19.67%(12/61)、19.67%(12/61)、19.67%(12/61)。共檢測(cè)到6種β內(nèi)酰胺類耐藥基因,分別為blaCTXM14、blaCTX-M-55、blaTEM1、blaTEM141、blaOXA1,blaNDM1,其中blaTEM1攜帶率最高,占54.10%(33/61),其余基因檢出率均低于10%。檢測(cè)到16 種氨基糖苷類耐藥基因,其中aac(6′)Iy基因攜帶率最高,達(dá)88.52%(54/61),檢測(cè)到4種氟喹諾酮類耐藥基因,aac(6′)Ib-cr、QnrB6、QnrD、QnrS1,其中QnrS1攜帶率最高為14.75%(9/61),其余基因攜帶率均低于10%;檢測(cè)到兩種氯霉素類耐藥基因分別為floR、cmlA1,floR攜帶率較高為16.39%(10/61);檢測(cè)到3種磺胺類耐藥基因,分別為sul1、sul2、sul3,其中sul2攜帶率最高(52.46%,32/61),其余基因均低于10%;檢測(cè)到4種甲氧芐啶類耐藥基因,分別為dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27,耐藥率均低于10%;檢測(cè)到2種四環(huán)素類耐藥基因,分別為tetA、tetC,2種耐藥基因同時(shí)出現(xiàn),攜帶率均為40.98%(25/61)。此外還檢測(cè)到磷霉素、利福霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類耐藥基因,攜帶率分別為9.84%(6/61)、8.20%(5/61)和11.48%(7/61)、6.56%(4/61),未檢出多肽類耐藥基因mcr,詳見圖1。

2.7 耐藥表型與耐藥基因 在大環(huán)內(nèi)酯類、β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類以及磺胺類表型耐藥的菌株中,均檢出相應(yīng)的耐藥基因,同種類抗生素中耐藥基因攜帶率最高的分別為mphA(100%,5/5)、blaTEM1(86.49%,32/37)、aac(6′)Iy(83.33%,5/6)、QnrS1(66.67%,4/6)、sul3(57.14%,4/7)。四環(huán)素類及苯丙醇類表型耐藥的菌株中,相應(yīng)耐藥基因檢出率分別為95.83%(23/24)、90.91%(10/11),四環(huán)素類抗生素tetA、tetC基因攜帶率均為95.83% (23/24)。苯丙醇類抗生素中floR基因攜帶率最高,為90.91%(10/11)。

3 討 論

每年發(fā)展中國(guó)家約有2 000萬人感染沙門氏菌,造成近20萬人的感染和死亡。如今沙門菌所引發(fā)的食源性疾病已成為全球性的公共衛(wèi)生問題,美國(guó)每年沙門菌腸道感染病例大約有140萬[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì), 我國(guó)70%～80%細(xì)菌性食物中毒由沙門菌引起, 其中90%以上由禽肉類等動(dòng)物源性食品引起[9-10]。

本次監(jiān)測(cè)結(jié)果中,吉林省1 000份市售食品樣品中共檢出沙門氏菌61株,總檢出率為6.1%,說明市售食品均有不同程度的沙門菌污染,與吳憲等人的研究結(jié)果相符[11]。生肉及生肉制品的沙門菌檢出率最高,與2011-2018年間本省食品中沙門菌檢測(cè)結(jié)果基本一致[12]。吉林省位于北方地區(qū),檢測(cè)率總體表現(xiàn)為夏秋季高,冬春季少。夏秋季溫度相對(duì)較高且氣候濕熱,更易于細(xì)菌等微生物的繁殖生長(zhǎng)。

吉林省沙門氏菌的優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門氏菌,這與云南、廣西等省市研究結(jié)論基本一致[13-15]。不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型也存在一定差異。據(jù)報(bào)道,上海市和渭南市的優(yōu)勢(shì)血清型均為鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌[8,16]。內(nèi)蒙古自治區(qū)的血清型以腸炎沙門菌和德爾卑沙門菌為主[17]。由于抗生素在食品、農(nóng)業(yè)以及臨床方面的廣發(fā)使用,造成沙門氏菌的耐藥率居高不下,而攜帶耐藥基因的菌株可以通過質(zhì)粒進(jìn)行耐藥基因的轉(zhuǎn)移傳播,產(chǎn)生多重耐藥菌株,加劇了我國(guó)食品安全問題[1,18-19]。此次藥敏結(jié)果顯示61株分離株對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林以及多粘菌素類的耐藥性較高,對(duì)頭孢西丁、替加環(huán)素、頭孢他啶/阿維巴坦敏感性較高,這與我國(guó)其他地區(qū)藥敏結(jié)果基本一致[20]。

61株沙門菌均攜帶耐藥基因以及外排泵,其中氨基糖類、氟喹諾酮類、四環(huán)素、β-內(nèi)酰胺類攜帶率較高,提示在食品來源的沙門菌中,相關(guān)藥物的耐藥可能已經(jīng)廣泛存在并傳播。多位點(diǎn)序列分型結(jié)果中,腸炎沙門菌對(duì)應(yīng)ST11型,結(jié)果與北京市研究結(jié)果一致[21],提示血清型與ST型之間可能緊密相關(guān)。同時(shí),不同血清型的菌株中攜帶的耐藥基因種類存在差異。推測(cè)在沙門氏菌中,耐藥基因的種類與ST型、血清型存在著一定程度的關(guān)聯(lián),ST型別及血清型的差異可能會(huì)影響耐藥基因的傳遞水平。

本研究中第一代頭孢類抗生素耐藥率遠(yuǎn)高于其他頭孢類抗生素,說明高代數(shù)頭孢雖已開始在養(yǎng)殖業(yè)中使用,但范圍尚不廣泛。從攜帶基因方面來看,61株沙門菌中β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥表型和耐藥基因攜帶情況一致率較高,說明此類耐藥表型與耐藥基因的存在有密切的關(guān)系,基本遵循一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。此次篩選到一株印地安納沙門氏菌,碳青霉烯類表型耐藥株的同時(shí)攜帶blaNDM金屬酶基因,經(jīng)一代測(cè)序比對(duì)后確認(rèn)為blaNDM-1。此菌株對(duì)亞胺培南在內(nèi)的9種β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)為耐藥,且同時(shí)攜帶19種耐藥基因、外排泵(mdtK、emrA、emrB、sdiA、marA、robA、H-NS等)、多重耐藥外排蛋白(mdtG、acrB-tolC)以及位移酶mdfA。隨著臨床上耐碳青霉烯類藥物的使用,其耐藥率逐年攀升,特別是大腸桿菌及肺炎克雷伯菌已是屢見不鮮,然而此次在食品來源的沙門菌中檢出,此情況在我國(guó)尚不常見。

多肽類抗生素對(duì)于禽類感染致病性腸桿菌的治療具有顯著效果[22],我國(guó)農(nóng)業(yè)部門已于2016年7月發(fā)布第2428號(hào)公告[23],正式停止在動(dòng)物中使用多粘菌素作為飼料添加劑,但本研究中,多粘菌素耐藥情況不容樂觀,作為治療革蘭氏陰性菌的最后一道防線已是岌岌可危[24]。多粘菌素耐藥機(jī)制主要包括兩種途徑:染色體介導(dǎo)和mcr基因的質(zhì)粒介導(dǎo),本研究中未檢測(cè)到mcr基因以及PmrAB和PhoPQ調(diào)控系統(tǒng),但包含大量PmrC、PmrE、PmrF基因,說明沙門菌中多粘菌素耐藥機(jī)制除了與PmrAB和PhoPQ調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)外,可能存在其他調(diào)控系統(tǒng)及相關(guān)機(jī)制。

多重耐藥菌的劃分標(biāo)準(zhǔn)目前仍不統(tǒng)一[25]。有學(xué)者將其定義為:同時(shí)對(duì)多種作用機(jī)制不同或結(jié)構(gòu)完全各異的抗菌藥物具有耐藥性,即對(duì)3類及以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的病原菌為多重耐藥菌[26]。本文將頭孢菌素、青霉素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類按藥物作用機(jī)制歸類于β-內(nèi)酰胺類中以便分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),耐β-內(nèi)酰胺類的菌株絕大多數(shù)都伴隨耐其他類別抗生素的情況發(fā)生,這與其他學(xué)者研究結(jié)果相符[27]。

隨著耐藥菌株也在不斷涌現(xiàn),沙門菌耐藥譜型也隨之變化,使得菌株多重耐藥率不斷攀升。因此,針對(duì)吉林省食源性沙門菌的多重耐藥情況,應(yīng)盡快建立快速有效的防控機(jī)制,并結(jié)合當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)血清型、耐藥譜型及耐藥基因,優(yōu)化治療方案,合理使用抗生素。

利益沖突：無

引用本文格式：孫景昱,趙薇,孫績(jī)巖,等.2022年吉林省食品中沙門氏菌耐藥性及分子特征分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2024,40(2):104-110. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.016