張 婷，劉喜瑩，陳 濤*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）全稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，廣泛存在于麩皮、米糠、咖啡、甜菜粕、谷殼等食品原料及副產(chǎn)物中，是一種天然的植物酚酸類物質(zhì)[1-2]。阿魏酸具有抗氧化[3-5]、抑菌消炎[6-7]、降血脂[8]、抗腫瘤抗癌[9-10]等良好的生理保健功能，是公認(rèn)的天然抗氧化劑。在國際上，一些國家已批準(zhǔn)將其作為食品添加劑應(yīng)用于食品[11-12]。但阿魏酸在植物細(xì)胞壁中通常以酯鍵或醚鍵形式與細(xì)胞壁多糖、木質(zhì)素交聯(lián)，多為結(jié)合態(tài)，無法發(fā)揮出最佳生理活性[13]。制備游離態(tài)阿魏酸的方法主要有直接從植物中提取、化學(xué)合成法以及生物合成法三類，相比堿水解法、化學(xué)法，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)成本更低且綠色環(huán)保。

阿魏酸酯酶（feruloyl esterase，F(xiàn)AE）（E.C.3.1.1.73）屬羧酸酯水解酶亞類，能高效降解植物細(xì)胞壁，水解斷裂羥基化肉桂酸與多糖之間交聯(lián)酯鍵，釋放生物活性成分—游離態(tài)阿魏酸及其衍生物[14]。自然界中，包括細(xì)菌、真菌和酵母在內(nèi)的超過30種微生物均能分泌阿魏酸酯酶，大多數(shù)為絲狀真菌[15]，如黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、宇佐美曲霉（Aspergillus usamil）等。真菌中以黑曲霉研究居多[16-17]，主要通過微生物固態(tài)發(fā)酵分泌表達(dá)FAE。趙浩源等[18]以麥麩和甘蔗渣質(zhì)量比2∶1混合作為基質(zhì)，采用黑曲霉在30 ℃發(fā)酵7 d，阿魏酸酯酶活力最高為8.2 U/g；李松等[19]篩選出一株土曲霉（Aspergillus terreus），通過優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件，阿魏酸酯酶酶活達(dá)205 U/L；SHIN H Y等[20]研究發(fā)現(xiàn)，利用泡盛曲霉或米曲霉固態(tài)發(fā)酵黑米糠，可以提高黑米糠醇提物的抗氧化活性，其中原兒茶酸和阿魏酸含量顯著增加；方園等[21]將泡盛曲霉接種在以麩皮和蔗渣為固態(tài)發(fā)酵底物的培養(yǎng)基中，通過培養(yǎng)基成分優(yōu)化，得到最高FAE酶活達(dá)0.067 9 U/g。隨著阿魏酸酯酶不斷擴(kuò)大應(yīng)用范圍，更多學(xué)者致力于尋求能產(chǎn)阿魏酸酯酶的優(yōu)良菌株，但目前優(yōu)化泡盛曲霉發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶工藝的研究較少。

本研究以泡盛曲霉（Aspergillusawamori）CGMCC3.2576為研究對(duì)象，以FAE酶活性為響應(yīng)值，利用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)該菌種發(fā)酵產(chǎn)FAE的條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳產(chǎn)酶條件，以期進(jìn)一步提高阿魏酸酯酶活性，為阿魏酸酯酶有效釋放產(chǎn)品中阿魏酸提供參考和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種泡盛曲霉（Aspergillus awamori）CGMCC3.2576：中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘油、酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、無水乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；淀粉酶（10 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。本研究所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[22]：麩皮與水按1∶1（g∶mL）混合，250 mL錐形瓶中裝量10 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

查氏培養(yǎng)基[23]：蔗糖30 g，NaNO33 g，KCl 0.5 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPL-250生化培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；Heal Force臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；高壓滅菌器GI54DWS：武漢遞熱愛生物科技有限公司；VD-1320型潔凈工作臺(tái)：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡盛曲霉CGMCC3.2576的固態(tài)發(fā)酵

取已經(jīng)培養(yǎng)好的斜面試管一支，加入5 mL無菌水，將表面的泡盛曲霉CGMCC3.2576孢子刮下，放入預(yù)先裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩0.5 h，將孢子懸液打散，過濾得孢子懸液，調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為107～108個(gè)/mL。將泡盛曲霉CGMCC3.2576孢子懸液按2%的接種量接種至初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d。

1.3.2 阿魏酸酯酶酶活性的測(cè)定

酶解底物的制備[24]：取100 g新鮮麥麩于燒杯中，加入1 000 mL 60～70 ℃熱水，pH 5.5～7.7之間，攪拌均勻，加入0.3%淀粉酶，55 ℃水浴加熱30 min，pH值調(diào)至中性，加入0.3%的中性蛋白酶，40 ℃水浴加熱45 min，沸水浴滅酶，干燥粉碎。

粗酶液的制備[25]：向發(fā)酵后的麩皮培養(yǎng)基中加入90 mL去離子水，28 ℃浸提1 h后過濾，濾液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集發(fā)酵上清液即為粗酶液，4 ℃儲(chǔ)存。

酶活性的測(cè)定[26]：取0.5 mL粗酶液，加入pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液至反應(yīng)體系為10 mL，加入0.2 g酶解底物，40 ℃恒溫反應(yīng)15 min，沸水浴滅酶，離心收集上清液。按上清液與無水乙醇體積比1∶4加入無水乙醇，混勻后離心，測(cè)定上清液在波長(zhǎng)320 nm處吸光度值。以不接種微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基提取液替代粗酶液為空白對(duì)照，計(jì)算酶活。

阿魏酸酯酶酶活性定義：在溫度50 ℃、pH6.0條件下，每分鐘水解阿魏酸乙酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量，定義為一個(gè)酶活力單位（mU/mL）。

1.3.3 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶條

件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

采用單因素輪換法，在初始發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，依次考察發(fā)酵時(shí)間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、碳源種類（葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘油，10 g/L）及最佳碳源添加量（5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L、30.0 g/L）、氮源種類（酵母浸粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、尿素，2 g/L）及最佳氮源添加量（2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L、12.0 g/L）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）對(duì)泡盛曲霉產(chǎn)阿魏酸酯酶的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時(shí)間（A）、葡萄糖添加量（B）、酵母浸粉添加量（C）、接種量（D）四個(gè)因素為自變量，以阿魏酸酯酶酶活性（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 13.0.1.0軟件設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for optimization of solid-state fermentation conditions for feruloyl esterase production by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行顯著性分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用Origin 2019繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)阿魏酸酯酶活性的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)AE活性呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)，F(xiàn)AE酶活性最高，為（1 496.60±56.64）mU/mL。分析原因可能是酶在發(fā)酵開始時(shí)產(chǎn)生緩慢，直到達(dá)到酶活力最高值，微生物代謝產(chǎn)物增加，阻礙發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行，酶活性隨之降低[27]。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為4 d。

2.1.2 碳源及葡萄糖添加量對(duì)阿魏酸酯酶活性的影響

不同碳源及葡萄糖添加量對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響見圖2。

圖2 碳源種類（A）及葡萄糖添加量（B）對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.2 Effects of carbon source types (A) and glucose addition (B)on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

細(xì)胞合成和分泌酶受到多種因素調(diào)控，其中發(fā)酵底物是提高菌種產(chǎn)酶量的關(guān)鍵[28]。由圖2A可知，在葡萄糖作為唯一添加碳源時(shí)，F(xiàn)AE酶活性最高，達(dá)到（2 554.80±111.13）mU/mL，其次是蔗糖，F(xiàn)AE酶活為（2 261.53±30.23）mU/mL。因此，確定最佳碳源為葡萄糖。

由圖2B可知，隨著葡萄糖添加量的升高，F(xiàn)AE酶活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，可能是葡萄糖添加量較低時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)含量低，微生物生長(zhǎng)受到限制；而當(dāng)葡萄糖添加量過多，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)濃度過高，微生物菌體生長(zhǎng)被抑制[29]。當(dāng)葡萄糖添加量為15 g/L時(shí)，F(xiàn)AE酶活性最高為（2 666.67±71.99）mU/mL。因此，選擇葡萄糖的最佳添加量為15 g/L。

2.1.3 氮源及酵母浸粉添加量對(duì)阿魏酸酯酶活性的影響

不同氮源及酵母浸粉添加量對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響見圖3。

圖3 氮源種類（A）及酵母浸粉添加量（B）對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.3 Effects of nitrogen source types (A) and yeast extract powder addition (B) on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

阿魏酸酯酶等微生物分泌的酶系，其本質(zhì)上是蛋白質(zhì)，而菌體分泌蛋白質(zhì)的關(guān)鍵營養(yǎng)因素是氮源[30]。由圖3A可知，采用酵母浸粉為唯一氮源時(shí)，F(xiàn)AE酶活性最高，達(dá)（3 368.10±37.89）mU/mL，其次為蛋白胨，F(xiàn)AE酶活為（2 923.66±21.80）mU/mL。分析原因可能是酵母浸粉作為蛋白質(zhì)類原料的水解產(chǎn)物，含有多種易被微生物所利用的含氮有機(jī)化合物及核苷酸等微量元素，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶[31]。因此，確定最佳氮源為酵母浸粉。

由圖3B可知，隨著酵母浸粉添加量逐漸增加，F(xiàn)AE活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酵母浸粉添加量為4 g/L時(shí)，F(xiàn)AE活性最高，為（3 383.22±23.99）mU/mL。因此，選擇酵母浸粉的最佳添加量為4 g/L。

2.1.4 泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量對(duì)阿魏酸酯酶活性的影響

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶活性不僅與產(chǎn)酶菌種優(yōu)良的生長(zhǎng)條件及營養(yǎng)條件有關(guān)，控制發(fā)酵條件也十分必要。泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量對(duì)阿魏酸酯酶活性的影響見圖4。

圖4 泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量對(duì)產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性的影響Fig.4 Effect of Aspergillus awamori CGMCC3.2576 inoculum on feruloyl esterase activities

由圖4可知，隨著接種量的升高，阿魏酸酯酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是，接種量影響微生物在培養(yǎng)基中發(fā)酵速度和產(chǎn)酶效率，接種量過低時(shí)，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)充足，菌株可以快速生長(zhǎng)增殖并發(fā)酵分泌更多所需酶；但接種量過高，營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，菌株生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致酶的分泌量減少。當(dāng)泡盛曲霉CGMCC3.2576接種量為10%時(shí)，F(xiàn)AE活性最高，為（3 879.06±34.07）mU/mL。因此，選擇最佳接種量為10%。

2.2 泡盛曲霉CGMCC3.2576固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶條件優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時(shí)間（A）、葡萄糖添加量（B）、酵母浸粉添加量（C）、接種量（D）4個(gè)因素為自變量，以阿魏酸酯酶活性（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 13.0.1.0軟件設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過Design-Expert 13.0.1.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析，得到二次多項(xiàng)式方程為：Y=3 820.41-61.22A-154.95B-86.92C-112.62D-52.15AB-174.60AC-43.08AD-201.81BC-138.32BD-43.08CD-502.42A2-423.05B2-400.38C2-293.80D2。

由表3可知，模型F值=39.20，P值＜0.01，極顯著，失擬項(xiàng)P值=0.230 5＞0.05，不顯著，表明模型具有良好的擬合度，能與數(shù)據(jù)較好擬合。在回歸模型中，決定系數(shù)R2=0.975 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.950 3，說明該模型可以解釋95.03%的FAE酶活性變化，表明該模型建立成功，并可以利用該模型對(duì)泡盛曲霉產(chǎn)酶進(jìn)行理論分析及預(yù)測(cè)。由表3亦可知，各因素對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)FAE活性的影響大小依次為：葡萄糖添加量＞微生物接種量＞酵母浸粉添加量＞發(fā)酵時(shí)間。一次項(xiàng)B、C、D，交互項(xiàng)AC、BC、BD及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

通過Design-Expert 13.0.1.0軟件繪制AC、BC、BD間交互作用對(duì)FAE酶活性影響的響應(yīng)曲面及等高線，結(jié)果見圖5。

圖5 各因素間交互作用對(duì)泡盛曲霉CGMCC3.2576產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活性影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the activities of feruloyl esterase produced by Aspergillus awamori CGMCC3.2576

由圖5可知，響應(yīng)面均呈凸面，存在最大值，且等高下均呈橢圓形，說明各因素間交互作用對(duì)泡盛曲霉固態(tài)發(fā)酵麩皮產(chǎn)FAE酶活力影響較大，與方差分析結(jié)果一致。

利用Design-Expert 13.0.1.0軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時(shí)間3.96 d，葡萄糖添加量14.28 g/L，酵母浸粉3.88 g/L，接種量9.69%。該方程模擬預(yù)測(cè)的阿魏酸酯酶活性為3 843.57 mU/mL。為便于實(shí)際操作，將最優(yōu)產(chǎn)酶條件修正為發(fā)酵時(shí)間4d，葡萄糖添加量14.28g/L，酵母浸粉3.88g/L，接種量9.70%。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到阿魏酸酯酶活性實(shí)際值為（3 912.32±34.34）mU/mL，與預(yù)測(cè)值相差1.75%，說明該模型適用于泡盛曲霉CGMCC 3.2576固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FAE酶活性工藝條件優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)，確定泡盛曲霉CGMCC3.2576發(fā)酵產(chǎn)FAE的最優(yōu)條件為：發(fā)酵時(shí)間4 d，葡萄糖添加量14.28 g/L，酵母浸粉3.88 g/L，接種量9.70%。在此條件下，阿魏酸酯酶活性為3 912.32 mU/mL，為優(yōu)化前的1.89倍。