吳雋松，滕飛翔，楊留才*

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江蘇 鹽城 224005）

柘樹(shù)又名黃金木，?？浦参?，是素有“南檀北柘”之稱(chēng)的名貴樹(shù)種，其樹(shù)根和樹(shù)皮可入藥[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，柘樹(shù)的樹(shù)根有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[4]和降血壓[5]的作用。柘樹(shù)的樹(shù)莖被當(dāng)作原料制作糖漿和顆粒制劑，治療消化道腫瘤。柘樹(shù)的樹(shù)莖中含有一種黃色的著色劑，是古代皇家龍袍的染料[6]。在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里，柘樹(shù)的樹(shù)葉一直被制成功能性茶飲，同時(shí)也是養(yǎng)蠶行業(yè)完美的食物來(lái)源[7]。柘果是柘樹(shù)的果實(shí)，糖類(lèi)成分含量為1.801～2.402 g/L[11]，含有黃酮[12]、氧化蒽酮[13]、生物堿[14]和有機(jī)酸[15]等具有藥用價(jià)值的化合物[8-14]。在韓國(guó)，柘果的開(kāi)發(fā)利用起步較早，柘果被制成果汁、果醬、果酒和其他保健食品[15]。柘木在我國(guó)栽培時(shí)間較早但對(duì)柘果的開(kāi)發(fā)起步較晚，由于柘果不耐儲(chǔ)存，冷藏條件下可以保鮮一周左右，冷藏溫度較低或者時(shí)間較長(zhǎng)都會(huì)直接影響柘果的品質(zhì)和口感。因此對(duì)柘果的開(kāi)發(fā)利用是一項(xiàng)值得研究的課題。

白蘭地起源于法國(guó)，狹義上講，是以葡萄為原料發(fā)酵后經(jīng)蒸餾得到的高度酒，再經(jīng)橡木桶貯存而成。未經(jīng)蒸餾的白蘭酒精度較低，經(jīng)二次蒸餾后成品酒的酒精含量約為40%vol。白蘭地大多是以葡萄為原料，也有一些以其他水果為原料釀造的，這種白蘭地會(huì)添加水果的名稱(chēng)，如藍(lán)莓白蘭地、山楂白蘭地等[16]。本試驗(yàn)以柘果為原料釀造白蘭地，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為柘果在中國(guó)的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柘果：山東省平陰縣東阿鎮(zhèn)鑫合種植農(nóng)民專(zhuān)業(yè)合作社；檸檬酸（食品級(jí)）：北京盒子生工科技有限公司；液體果膠酶（酶活力8萬(wàn)U/mL）：河北潤(rùn)步生物科技有限公司；白砂糖：市售；葡萄酒活性干酵母SY：安琪酵母股份有限公司；焦亞硫酸鈉（食品級(jí)）：陜西源優(yōu)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2 水浴鍋：常州天瑞儀器有限公司；PHSJ-5T pH 計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；ZWYRD2403 恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；UV3000分光光度計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；WAY-32 糖度折光儀：上海光學(xué)儀器五廠有限公司；L18-Y915S破壁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；CJM-549酒精計(jì)（0%vol～100%vol）：衡水創(chuàng)紀(jì)儀器儀表有限公司；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymassspectrometry，GC-MS）：島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柘果白蘭地發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

柘果→帶皮破碎→檸檬酸調(diào)酸→加果膠酶解→調(diào)節(jié)糖度→加焦亞硫酸鈉→滅菌→加酵母菌粉→發(fā)酵→一次蒸餾→二次蒸餾→加入中度烘焙橡木片→過(guò)濾→柘果白蘭地

原料處理：挑選表皮無(wú)破損、無(wú)腐爛的完整柘果，自來(lái)水流動(dòng)沖洗后晾干。

破碎：使用破壁機(jī)破碎20 s，粒度為60目。

調(diào)節(jié)酸度：使用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至3.5。

酶解：將柘果汁與純凈水按1∶1.5（V/V）的比例混合，加入0.1%果膠酶，在50 ℃條件下酶解2 h。

調(diào)節(jié)糖度：加入白砂糖將初始糖度調(diào)整為24°Bx。

滅菌：加入0.01%焦亞硫酸鈉，滅菌2 h。

酵母菌接種：按照1 L果汁加2 g果酒釀造專(zhuān)用酵母菌粉的比例接種酵母，使用前用30 ℃無(wú)菌水將酵母粉活化30 min。

發(fā)酵：發(fā)酵容器上安裝s型單向排氣閥，排氣閥中加入少量無(wú)菌水（發(fā)酵過(guò)程中注意及時(shí)添加無(wú)菌水，使容器一直處于密閉狀態(tài)），既能使發(fā)酵容器密閉，又能達(dá)到將發(fā)酵過(guò)程中的氣體排出的目的。將發(fā)酵容器置于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵9 d，期間定時(shí)攪拌。

蒸餾：采用蒸餾裝置進(jìn)行一次蒸餾和二次蒸餾。一次蒸餾時(shí)溫度80 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol時(shí)停止接酒；二次蒸餾時(shí)溫度65 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol時(shí)停止接酒，并去掉酒頭和酒尾。

添加橡木片：按照1 L白蘭地添加5 g中度烘焙橡木片的比例添加橡木片，浸泡4周。

過(guò)濾：用三層紗布進(jìn)行過(guò)濾，即得柘果白蘭地。

1.3.2 柘果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

初始糖度：在發(fā)酵時(shí)間為7 d、發(fā)酵溫度為28 ℃、酵母菌添加量為0.2%的條件下，分別考察不同初始糖度（16°Bx、20°Bx、24°Bx、28°Bx、32°Bx）對(duì)柘果白蘭地感官評(píng)分的影響。

發(fā)酵時(shí)間：在發(fā)酵溫度為28 ℃、酵母菌添加量為0.2%、初始糖度為24°Bx的條件下，分別考察不同發(fā)酵時(shí)間（7 d、8 d、9 d、10 d、11 d）對(duì)柘果白蘭地感官評(píng)分的影響。

酵母菌添加量：在發(fā)酵時(shí)間為7 d、發(fā)酵溫度為28 ℃、初始糖度為24°Bx 的條件下，分別考察不同酵母菌添加量（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）對(duì)柘果白蘭地感官評(píng)分的影響。

1.3.3 柘果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以初始糖度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和酵母菌添加量（C）為考察因素，使用Design-Expert 8.0.6.1軟件，以柘果白蘭地感官評(píng)分（R）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化柘果果酒發(fā)酵條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 柘果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine

表2 柘果白蘭地感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Cudrania tricuspidata brandy

1.3.4 測(cè)定方法

感官評(píng)定：由15名釀造專(zhuān)業(yè)的評(píng)審員組成評(píng)價(jià)小組，以GB/T 11856—2008《白蘭地》的感官要求為感官評(píng)價(jià)參考標(biāo)準(zhǔn)，從外觀、香氣、口感和風(fēng)格四個(gè)方面對(duì)樣品進(jìn)行打分，滿(mǎn)分為100分，取15人的平均分。

總酸、總糖含量：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的檢測(cè)方法測(cè)定[17]；甲醇含量采用GB 5009.266—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中甲醇的測(cè)定》中的檢測(cè)方法測(cè)定[18]；乙醇含量采用GB 5009.225—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的檢測(cè)方法測(cè)定[19]；總酯含量采用GB/T 11856—2008《白蘭地》中的方法[20]。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法測(cè)定[19]。

（1）樣品前處理：準(zhǔn)確取3 mL樣品置于30 mL固相微萃取采樣瓶中，加入1 μL質(zhì)量濃度為10 μL/mL乙酸戊酯為內(nèi)標(biāo)，加入3.0 mL去離子水和0.3 g NaCl，放入磁力轉(zhuǎn)子，密封后將樣品瓶置于65 ℃水浴中熱平衡10 min，磁力攪拌器速度設(shè)置為800 r/min，用正己烷清洗萃取針頭表面并對(duì)其進(jìn)行活化，將活化后的萃取針頭插入樣品瓶?jī)?nèi)，推出纖維頭，使之距樣品液面約8 mm，頂空萃取50 min。萃取完畢迅速取出萃取針頭，并將萃取針頭迅速插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口中熱解吸6 min，進(jìn)樣。

（2）氣相色譜條件：固相微萃取針頭型號(hào)為75 μm CAR/PDMS。采用Agilent HP-5毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為高純He（99.999%），流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保留10 min；以5 ℃/min升至90 ℃，保留5 min；再以2 ℃/min升至180 ℃，保留5 min；最后以20 ℃/min升至280 ℃。

（3）質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍25～450 amu；輔助溫度280 ℃；掃描模式Scan。

（4）定性定量方法：檢測(cè)出的物質(zhì)根據(jù)相似度和保留指數(shù)，通過(guò)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）20譜庫(kù)結(jié)合人工解譜的方法進(jìn)行定性（匹配度＞80%）。采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)檢測(cè)物進(jìn)行定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，P＜0.01，表示差異性極顯著，P＜0.05，表示差異性顯著，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用Origin 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 柘果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)白蘭地的釀造工藝，將發(fā)酵結(jié)束后的果酒進(jìn)行二次蒸餾，得到的白蘭地酒精度為40%vol，進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)以及感官評(píng)分。

2.1.1 初始糖度對(duì)柘果白蘭地品質(zhì)的影響

由圖1可以看出，隨著初始糖度的增加，總酸含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，總糖含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量、感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，甲醇含量呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)；初始糖度為24°Bx時(shí)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最高為（1.24±0.07）g/L；糖度過(guò)低時(shí)酵母菌代謝不足，糖度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制酵母的代謝活性，都不利于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[21]。此時(shí)甲醇含量最低為（107±5.07）mg/L，酵母代謝途徑分為糖代謝途徑和其他物質(zhì)代謝途徑，當(dāng)初始糖度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)引發(fā)酵母進(jìn)行其他物質(zhì)代謝途徑，從而導(dǎo)致甲醇含量升高[16，22]。初始糖度為28°Bx時(shí)，感官評(píng)分值最高為（85.97±0.71）分。綜合考慮，選取初始糖度20°Bx、24°Bx、28°Bx為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖1 初始糖度對(duì)柘果白蘭地品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)柘果白蘭地品質(zhì)的影響

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酸含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)[23]，總糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量、感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，甲醇含量變化不明顯；發(fā)酵時(shí)間為9 d時(shí)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量達(dá)到最高，為（1.21±0.04）g/L，這種現(xiàn)象可能是由于風(fēng)味物質(zhì)的自然揮發(fā)或者被酵母代謝消耗[24-25]；發(fā)酵時(shí)間為9 d時(shí)，感官評(píng)分為（86.11±0.67）分，發(fā)酵時(shí)間為10 d時(shí)，感官評(píng)分最高為（86.25±0.49）分。綜合考慮，選取發(fā)酵時(shí)間8 d、9 d、10 d為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)柘果白蘭地品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.1.3 酵母添加量對(duì)柘果白蘭地發(fā)酵品質(zhì)的影響

由圖3可以看出，隨著酵母添加量的增加，總酸含量呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)[26]，總糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化不大，甲醇含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，感官評(píng)分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；酵母添加量為0.10%時(shí)，甲醇含量最低為（113.67±1.53）mg/L；酵母添加量為0.20%時(shí)，感官評(píng)分值最高為（84.26±0.35）分。綜合考慮，選取酵母添加量0.15%、0.20%、0.25%為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖3 酵母菌添加量對(duì)柘果白蘭地品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of yeast addition on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.2 柘果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始糖度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）及酵母添加量（C）為3個(gè)因素，以柘果白蘭地感官評(píng)分（R）為響應(yīng)值，采用Design Expert 13軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，對(duì)柘果果酒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 柘果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

根據(jù)表3數(shù)據(jù)得到柘果白蘭地感官評(píng)分響應(yīng)值所得回歸方程：

由表4可知，試驗(yàn)所預(yù)設(shè)的各種因素對(duì)感官評(píng)分的影響各不相同，按F值排列順序?yàn)锽＞A＞C，即對(duì)感官評(píng)分的影響為發(fā)酵時(shí)間＞初始糖度＞酵母添加量。由P值可知，交互項(xiàng)AC、BC對(duì)感官評(píng)分的影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)感官評(píng)分的影響極顯著（P＜0.01）。失擬項(xiàng)P值不顯著（P＞0.05），說(shuō)明回歸方程擬合度良好，能較好的在變量范圍內(nèi)反映響應(yīng)值的變化情況，可以用于柘果白蘭地發(fā)酵工藝的預(yù)測(cè)。

各因素交互作用對(duì)柘果白蘭地感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)如圖4所示。由圖4可知，初始糖度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和酵母接種量（C）這3個(gè)因素交互作用在感官評(píng)分響應(yīng)面3D圖上均存在極值，AB交互作用的響應(yīng)面坡度趨勢(shì)陡峭，說(shuō)明AB交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響較大，與方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)柘果白蘭地感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation score of Cudrania tricuspidata brandy

預(yù)測(cè)柘果白蘭地最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為初始糖度26.59°Bx，發(fā)酵時(shí)間9.61 d，酵母添加量0.21%。在此條件下，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為87.99分。為方便實(shí)際操作，修改發(fā)酵條件為初始糖度26.6 °Bx，發(fā)酵時(shí)間10 d，酵母添加量0.2%，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終得到感官評(píng)分實(shí)際值為86.59分，與預(yù)測(cè)值接近，證明該模型可行。

2.3 柘果白蘭地品質(zhì)指標(biāo)

在最佳條件下發(fā)酵得到的柘果白蘭地成品感官評(píng)分為86.59分，外觀呈金黃色，澄清透亮，無(wú)沉淀物，香氣協(xié)調(diào)且平衡，酒體醇厚飽滿(mǎn)，細(xì)膩綿柔，無(wú)辛辣味，具有柘果白蘭地的特殊風(fēng)格。酒精度為40%vol、總酸含量為2.05 g/L、總酯含量為2.96 g/L、總糖含量為3.03 g/L、甲醇含量為121 mg/L（≤2.0 g/L）、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量為1.22 g/L，理化指標(biāo)符合GB/T 11856—2008《白蘭地》的要求。細(xì)菌總數(shù)≤50CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/mL，沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等致病菌檢出。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)研究初始糖度、發(fā)酵時(shí)間和酵母接種量對(duì)柘果白蘭地品質(zhì)的影響，進(jìn)一步利用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為初始糖度26.6°Bx，發(fā)酵時(shí)間9.6 d，酵母添加量0.2%。在此發(fā)酵條件下得到的柘果果酒經(jīng)蒸餾得到的柘果白蘭地，外觀呈金黃色，澄清透亮，無(wú)沉淀物，香氣協(xié)調(diào)且平衡，酒體醇厚飽滿(mǎn)，細(xì)膩綿柔，無(wú)辛辣味，具有柘果白蘭地的特殊風(fēng)格，感官評(píng)分為86.59分。酒精度為40%vol、總酸含量為2.05 g/L、總酯含量為2.96 g/L、總糖含量為3.03 g/L、甲醇含量為121 mg/L（≤2.0 g/L）、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量為1.22 g/L，品質(zhì)指標(biāo)符合GB/T 11856—2008《白蘭地》的要求。