菅 蕊,張文娜,張東紅,解立斌,宋素潔,馮笑顏,劇慧棟,4

(1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000;2. 石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北 石家莊 050000;3. 河北資源環(huán)境職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北 石家莊 050000;4.河北省疑難細(xì)菌研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 050000)

驢消化道寄生蟲(chóng)主要以圓線科線蟲(chóng)(Strongylidae Baird,1853)為主,嚴(yán)重威脅宿主的生命和健康,不同種類的線蟲(chóng)對(duì)宿主的致病機(jī)制有所不同,因此,準(zhǔn)確迅速地識(shí)別寄生線蟲(chóng)可以有效地降低其對(duì)宿主的危害[1-2]。圓線科線蟲(chóng)在體前端的結(jié)構(gòu),尤其是頭部乳突、口囊、內(nèi)葉冠和外葉冠等結(jié)構(gòu),以及雄蟲(chóng)尾部生殖錐的形態(tài)是重要的形態(tài)學(xué)分類依據(jù),掃描電子顯微鏡可以更準(zhǔn)確地對(duì)驢寄生線蟲(chóng)的形態(tài)特征進(jìn)行觀察和描述[3-5]。

本試驗(yàn)首次對(duì)采自我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)的驢消化道內(nèi)的馬圓形線蟲(chóng)、無(wú)齒圓形線蟲(chóng)和杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)的體表形態(tài)進(jìn)行詳細(xì)的觀察和描述,為上述3種線蟲(chóng)的分類鑒定提供更精確的形態(tài)學(xué)依據(jù),并在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,基于線蟲(chóng)核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)基因?qū)ζ溥M(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果表明,馬圓形線蟲(chóng)、無(wú)齒圓形線蟲(chóng)和杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中該種的分類學(xué)地位一致。

1 材料與方法

1.1 主要材料 馬圓形線蟲(chóng)、無(wú)齒圓形線蟲(chóng)和杯狀彼得洛夫線蟲(chóng),采自我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)驢(Equusasinus)的腸道內(nèi)容物,用80 ℃左右的熱水將蟲(chóng)體燙直,將線蟲(chóng)保存于70%酒精中并記錄宿主種名、寄生部位、采集時(shí)間和地點(diǎn),利用光學(xué)顯微鏡觀察蟲(chóng)體,通過(guò)形態(tài)學(xué)特征確定其種類分別是馬圓形線蟲(chóng)、無(wú)齒圓形線蟲(chóng)和杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)。透明液(乳酸∶苯酚∶蒸餾水∶甘油=1∶1∶1∶2),河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與分子進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室配制;DNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;PCR試劑盒和蛋白酶K,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 掃描電子顯微鏡(HITACHI S-4800),日立公司產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡(Nikon E200MV),尼康公司產(chǎn)品。

1.3 線蟲(chóng)掃描電子顯微鏡樣品的制備和觀察 取保存于70%酒精溶液中的線蟲(chóng)標(biāo)本用0.1 mol/L 的磷酸鹽溶液清洗3次,每次15 min;使用戊二醛(濃度2.5%)溶液固定3 h;使用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;鋨酸(濃度1%)溶液固定1 h;再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;再進(jìn)行脫水,用乙醇作為脫水劑,按照70%、80%、90%和100%的梯度進(jìn)行2次脫水,每次脫水時(shí)間為20 min;將脫水的樣品放入醋酸異戊酯中30 min。使用臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥:(1)樣品室預(yù)冷(注入液氮)→(2)樣品放入樣品室→(3)注入液態(tài)二氧化碳(樣品室體積的70%)→(4)用二氧化碳置換樣品中的醋酸異戊酯(溫度調(diào)到20 ℃,壓力應(yīng)達(dá)到50～70 kg/cm2,保持20 min)→(5)臨界處理,溫度提高到40 ℃,壓力應(yīng)達(dá)到80～100 kg/cm2,保持5 min→(6)放氣,速度在100～500 mL/min→(7)當(dāng)壓力低于30 kg/cm2時(shí),切斷加熱器→(8)壓力為0時(shí),取出樣品,用雙面膠或?qū)щ娔z將樣品固定在專用的樣品臺(tái)上,進(jìn)行噴金,掃描電子顯微鏡觀察并拍照[6]。標(biāo)本保存于河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.4 線蟲(chóng)ITS基因的PCR擴(kuò)增和序列分析 從70%酒精中分別取出每種線蟲(chóng)的1條雌蟲(chóng),分別置于不同的1.5 mL離心管內(nèi)做好標(biāo)記,用蒸餾水漂洗3～5次,按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取DNA,分成兩段擴(kuò)增ITS目的片段,之后再進(jìn)行拼接。2對(duì)引物分別為NC5、NC1R和NC13、NC2[7-9],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其核酸序列分別為:NC5(5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′)(forward);NC1R(5′-AACAACCCTGAACCAGACGT-3′) (reverse);NC13(5′-ATCGATGAAGAACGCAGC-3′) (forward);NC2(5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′) (reverse)。預(yù)期PCR擴(kuò)增片段每段長(zhǎng)度約為500 bp,拼接后約為1 000 bp。

PCR 反應(yīng)總體系(50 μL):DNA模板5 μL,上、下游引物各1 μL,2×TaqMasterMix 25 μL,ddH2O 18 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)拼接,并在GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。使用BioPerl 5.8軟件對(duì)本試驗(yàn)測(cè)序結(jié)果與GenBank中圓線科線蟲(chóng)的ITS序列(共11條)進(jìn)行同源性分析。為了分析上述3種線蟲(chóng)的分類學(xué)地位,分別用最大似然法(Maximum likelihood method)和貝葉斯法(Bayesian method),將Oesophagostomumdentatum(AJ619979)設(shè)置為外群,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)探討線蟲(chóng)間的親緣關(guān)系[10],只標(biāo)注支持度>50%(重復(fù)1 000次)。

2 結(jié)果

2.1 掃描電子顯微鏡觀察

2.1.1 馬圓形線蟲(chóng)[Strongylusequinus(Mueller,1780)]

采集地點(diǎn):中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)

宿主:驢(Equusasinus)

雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)各觀察3條,雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)在頭端無(wú)明顯差異。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),蟲(chóng)體兩端稍細(xì),口領(lǐng)高0.22 mm(0.21～0.23 mm),寬0.7 mm(0.6～0.8 mm)?？谀页蕶E圓形,深0.8 mm(0.6～0.9 mm),寬0.7 mm(0.6～0.8 mm)。在口囊基部有4個(gè)突出的齒,2個(gè)位于亞腹面,2 個(gè)位于亞背面。亞腹齒分開(kāi);亞背齒不分開(kāi),較粗大,并高于亞腹齒。背溝長(zhǎng)。中部粗壯,紅褐色,體表具角質(zhì)橫紋。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),排泄孔位于口囊前1/3處(圖1 A和1 B),頸乳突1對(duì),小刺狀,位于體側(cè),長(zhǎng)35 μm(30～39 μm)(圖1 C和1 D)。內(nèi)葉冠短寬約80枚,外葉冠細(xì)長(zhǎng),約180枚,頭部直徑650 μm(635～670 μm),口孔直徑160 μm(150～175 μm)(圖1 E)。亞中乳突4個(gè),基部膨大,直徑10 μm(7～13 μm),頂端細(xì)(圖1F),頭感器2個(gè),有明顯橫溝狀凹陷,直徑24 μm(20～26 μm)(圖1G)。雄蟲(chóng)交合傘具2個(gè)發(fā)達(dá)的側(cè)葉和1個(gè)不發(fā)達(dá)的背葉,邊緣平滑(圖1H)。生殖錐具有指狀附屬物,長(zhǎng)85 μm(80～90 μm)(圖1I)。雌蟲(chóng)陰門(mén)位于蟲(chóng)體后1/4處,開(kāi)口橢圓形,直徑60 μm(50～65 μm)(圖1J),尾部鈍圓,肛門(mén)半月形,長(zhǎng)150 μm(120～180 μm),距尾200 μm(170～220 μm)(圖1K)。

圖1 馬圓形線蟲(chóng)的掃描電子顯微鏡觀察

2.1.2 無(wú)齒圓形線蟲(chóng)[Strongylusedentatus(Looss,1900)]

采集地點(diǎn):中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)

宿主:驢(Equusasinus)

雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)各觀察3條,雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)在頭端無(wú)明顯差異。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),口囊呈球形,寬1.0 mm(0.8～1.1 mm),在口囊的背壁上有1個(gè)背溝,深0.8 mm(0.7～0.9 mm),向前延伸開(kāi)口于口囊的前緣。蟲(chóng)體粗壯,兩端稍細(xì),體表具角質(zhì)橫紋。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),口領(lǐng)高而明顯,頭部直徑750 μm(700～790 μm),口孔直徑150 μm(130～180 μm),外葉冠細(xì)長(zhǎng),約80枚(圖2 A)。亞中乳突4個(gè),基部膨大,直徑8 μm(6～10 μm),頂端細(xì)(圖2 B),頭感器2個(gè),無(wú)明顯凹陷,直徑14 μm(11～18 μm)(圖2 C)。頸乳突1對(duì),小刺狀,位于食道中部后方。雄蟲(chóng)交合傘具2個(gè)發(fā)達(dá)的側(cè)葉和1個(gè)不發(fā)達(dá)的背葉,邊緣平滑,背肋先分為2支,再分為3支(圖2 D和2 E)。生殖錐較長(zhǎng),具有2對(duì)附屬物,第1對(duì)寬,乳頭形,第2對(duì)細(xì)長(zhǎng),長(zhǎng)60 μm(50～69 μm)(圖2 F)。雌蟲(chóng)陰門(mén)位于蟲(chóng)體后1/4處,開(kāi)口橢圓形,直徑89 μm(80～99 μm)(圖2 G),尾部鈍圓,肛門(mén)半月形,長(zhǎng)200 μm(180～210 μm),距尾250 μm(230～260 μm)(圖2H)。

圖2 無(wú)齒圓形線蟲(chóng)的掃描電子顯微鏡觀察

2.1.3 杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)[Petrovinemapoculatum(Looss,1900)]

采集地點(diǎn):中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)

宿主:驢(Equusasinus)

雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)各觀察3條,雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)在頭端無(wú)明顯差異。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),內(nèi)葉冠起始于口囊前緣稍后方,數(shù)目多?？谀冶谧郧跋蚝笾饾u彎曲增厚,至后1/4左右最厚,后端又持續(xù)變薄?？谀覀?cè)壁中部有1個(gè)橫脊伸向口囊內(nèi)腔。口囊呈柱狀,深度稍大,寬度稍小,口囊的前后寬度大體相等,前端部稍窄,中央偏前方最寬。食道長(zhǎng)。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),口領(lǐng)低而平緩,與蟲(chóng)體間無(wú)明顯分割,頭徑79 μm(70～85 μm),口孔直徑37 μm(30～45 μm),外葉冠細(xì)小,刺狀,為32枚(圖3A)。頸乳突刺狀,長(zhǎng)30 μm(25～34 μm),與排泄孔大致在同一平面(圖3B和3 C)。亞中乳突突出,長(zhǎng)18 μm(15～20 μm)(圖3D),頭感器丘狀凸起,寬10 μm(8～15 μm)(圖3E)。雄蟲(chóng)交合傘背葉和側(cè)葉較明顯,邊緣鋸齒狀,生殖錐發(fā)達(dá)且伸長(zhǎng),幾乎與交合傘側(cè)葉等長(zhǎng)300 μm(280～350 μm),具1對(duì)小囊狀附屬物,交合刺遠(yuǎn)端有倒鉤(圖3F和3G)。雌蟲(chóng)陰門(mén)開(kāi)口圓形,寬17 μm(14～20 μm),距肛門(mén)115 μm(100～125 μm),肛門(mén)開(kāi)口月牙形,長(zhǎng)75 μm(60～80 μm),尾長(zhǎng)320 μm(305～330 μm),末端平滑漸細(xì)(圖3H)。

圖3 杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)的掃描電子顯微鏡觀察

2.2 基于ITS序列的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 同源性分析 將本試驗(yàn)中經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得的馬圓形線蟲(chóng)和無(wú)齒圓形線蟲(chóng)的ITS序列與NCBI中普通圓形線蟲(chóng)的ITS序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,馬圓形線蟲(chóng)與無(wú)齒圓形線蟲(chóng)的同源性分別為90.0%,兩者與普通圓形線蟲(chóng)的同源性分別為78.4%和80.0%,表明馬圓形線蟲(chóng)與無(wú)齒圓形線蟲(chóng)有很近的親緣關(guān)系,而兩者與普通圓形線蟲(chóng)的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn),結(jié)合三者的形態(tài)學(xué)特征,三者應(yīng)屬于同一屬。

本試驗(yàn)測(cè)得的杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)的ITS序列與NCBI中冠環(huán)屬的冠狀冠環(huán)線蟲(chóng)的ITS序列同源性較高,為99.5%,與盅口亞科其他屬的代表種類的相似度介于80.0%～99.5%,其形態(tài)特征也符合盅口亞科線蟲(chóng)的鑒定特征,因此杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)應(yīng)屬于盅口亞科,但是杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)的形態(tài)特征與冠狀冠環(huán)線蟲(chóng)及其他盅口亞科線蟲(chóng)的形態(tài)有較大差別,因此,雖然杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)與冠狀冠環(huán)線蟲(chóng)具有相似度較高的ITS序列,但是兩者應(yīng)該為不同屬。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 本試驗(yàn)測(cè)得的線蟲(chóng)的ITS序列和NCBI中圓線科線蟲(chóng)的11條ITS序列,包括2亞科9屬11種,以最大似然法和貝葉斯法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示,馬圓形線蟲(chóng)、無(wú)齒圓形線蟲(chóng)和普通圓形線蟲(chóng)聚為一支,杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)與盅口亞科其他種類聚為一支(圖4)。

圖4 基于ITS序列采用貝葉斯法(A)和最大似然法(B)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

馬圓形線蟲(chóng)、無(wú)齒圓形線蟲(chóng)和杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)是驢消化道常見(jiàn)的大型寄生蟲(chóng),嚴(yán)重危害宿主健康,因此有必要對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的研究。目前,對(duì)于上述3種線蟲(chóng)的研究主要集中在分子鑒定、病理學(xué)研究、治療藥物研發(fā)和應(yīng)用等,而對(duì)寄生蟲(chóng)的準(zhǔn)確鑒定,尤其是基于形態(tài)學(xué)的鑒定是分子鑒定和其他研究的基礎(chǔ),本試驗(yàn)首次使用掃描電子顯微鏡對(duì)上述3種線蟲(chóng)進(jìn)行觀察描述和測(cè)量。

本試驗(yàn)掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示,馬圓形線蟲(chóng)雄蟲(chóng)生殖錐具有2對(duì)指狀突起,一長(zhǎng)一短;無(wú)齒圓形線蟲(chóng)具有2對(duì)附屬物,分別為乳頭狀和細(xì)長(zhǎng)狀的形態(tài)特征,補(bǔ)充了前人的描述。張路平等(2014年)[5]通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀測(cè)到馬圓形線蟲(chóng)有內(nèi)葉冠75～85枚,外葉冠172～189枚,無(wú)齒圓形線蟲(chóng)外葉冠75～80枚;本試驗(yàn)觀測(cè)到馬圓形線蟲(chóng)有內(nèi)葉冠80枚,外葉冠約180枚,無(wú)齒圓形線蟲(chóng)外葉冠80枚;與張路平等(2014年)[5]結(jié)果相似。本試驗(yàn)觀測(cè)到杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)的外葉冠呈刺狀,32枚,不同于張路平等(2014年)[5]的35枚,支持Lichtenfels 等(2008年)[11]的結(jié)果(30～36枚)。另外,本試驗(yàn)首次利用掃描電子顯微鏡觀察到馬圓形線蟲(chóng)雄蟲(chóng)尾部的生殖錐具有指狀附屬物;無(wú)齒圓形線蟲(chóng)雄蟲(chóng)尾部生殖錐較長(zhǎng),具有2對(duì)附屬物,第1對(duì)寬,乳頭形,第2對(duì)細(xì)長(zhǎng);杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)雄蟲(chóng)尾部具1對(duì)小囊狀附屬物。

本試驗(yàn)基于圓線科ITS基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果顯示,馬圓形線蟲(chóng)、無(wú)齒圓形線蟲(chóng)和普通圓形線蟲(chóng)聚為一支,說(shuō)明三者具有較近的親緣關(guān)系,這與三者具有相似的形態(tài)特征,同屬于圓形亞科圓線屬有關(guān);盅口亞科各屬的代表種類聚為一支,包含本試驗(yàn)中的杯狀彼得洛夫線蟲(chóng),說(shuō)明杯狀彼得洛夫線蟲(chóng)應(yīng)屬于盅口亞科,根據(jù)其形態(tài)特征將其歸于彼得洛夫?qū)偈菧?zhǔn)確的;圓形亞科三齒屬中的鋸齒三齒線蟲(chóng)[Triodontophorusserratus(Looss,1900)]與盅口亞科聚為一支,但是鋸齒三齒線蟲(chóng)與盅口亞科線蟲(chóng)的形態(tài)差距較大,說(shuō)明系統(tǒng)發(fā)育分析在線蟲(chóng)分類學(xué)鑒定中存在一定的局限性,針對(duì)這種形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果不相符的現(xiàn)象需要進(jìn)一步研究。

消化道寄生線蟲(chóng)嚴(yán)重威脅驢的健康,人類誤食感染寄生蟲(chóng)或寄生蟲(chóng)卵的驢肉有潛在感染寄生蟲(chóng)的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)使用掃描電子顯微鏡更準(zhǔn)確、形象、立體的展示了3種線蟲(chóng)的體表形態(tài)特征,為準(zhǔn)確鑒定線蟲(chóng)種類提供了影像學(xué)依據(jù);同時(shí),本試驗(yàn)還在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析,同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示,本試驗(yàn)中的3種線蟲(chóng)的分子分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征一致。