史 揚(yáng),董昭熙,周 盈,謝惠迪,郭 燕,宿家銘,鄭毅成,柳紅芳

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2. 北京市普仁醫(yī)院,北京 100062;3. 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心腎臟病全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100853)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是導(dǎo)致全球終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)的首位病因[1],由DKD進(jìn)展至ESRD的群體較其他患者群體具有更高的病死率[2],且世界范圍內(nèi)的疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查顯示,近30年來的DKD致死率均未見改善[3]。目前西醫(yī)對DKD的治療強(qiáng)調(diào)優(yōu)化生活方式管理及血糖、血壓控制,但研究顯示嚴(yán)格控制血糖和血壓的標(biāo)準(zhǔn)治療仍無法阻止DKD進(jìn)展至ESRD或降低DKD相關(guān)病死率[4-6]。蛋白尿作為DKD病情進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與病死率呈正相關(guān)[7],而腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙早于足細(xì)胞損傷且是早期微量蛋白尿的主要誘因,可多靶點(diǎn)作用推進(jìn)DKD病程進(jìn)展[8-9]。尋找早期影響腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能的致病因素可能是DKD防治的關(guān)鍵。作為首層腎小球?yàn)V過屏障,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞對葡萄糖水平變化高度敏感,高血糖可從多個(gè)分子機(jī)制誘發(fā)其功能障礙,焦亡通路激活在其中起著關(guān)鍵作用,并導(dǎo)致進(jìn)行性腎功能損害[10]。高糖刺激可誘導(dǎo)NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)募集,并與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體(pro-Caspase-1)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)組裝成多聚體蛋白復(fù)合物即NLRP3炎癥小體[11];隨后,NLRP3將pro-Caspase-1切割成其活性形式Caspase-1,進(jìn)一步切割消皮素D蛋白(GSDMD),從而導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)等炎性因子分泌并伴隨免疫細(xì)胞募集,觸發(fā)細(xì)胞焦亡[12],加速腎小球硬化的病理進(jìn)程。芪地糖腎方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院柳紅芳教授的經(jīng)驗(yàn)方,可通過改善腎臟微炎癥狀態(tài)、減少尿蛋白以對抗糖尿病腎病進(jìn)展[13-14],可減輕腎小球內(nèi)毛細(xì)血管基底膜增厚,緩解包括腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的DKD腎臟病理改變[15],但其作用機(jī)制尚有待明確。本研究從細(xì)胞水平探討了芪地糖腎方對高糖刺激的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞焦亡相關(guān)通路的調(diào)控作用,以期揭示其改善腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷、延緩DKD進(jìn)展的作用機(jī)制,為該方的臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物 小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞購于廣州吉尼歐生物科技有限公司。 芪地糖腎方(由熟地黃、生黃芪、炒芡實(shí)、山萸肉、水蛭、熟大黃、白花蛇舌草組成)所含的中藥飲片均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房,將該方飲片浸泡于1～2 L雙蒸水中15 min,按傳統(tǒng)煎藥方法將藥物煎煮2次后混合均勻,并過濾及濃縮,獲得中藥水煎液約100 mL,使用冷凍干燥機(jī)凍干后迅速收集凍干粉,密封后于-20 ℃儲存。使用完全培養(yǎng)基配置芪地糖腎方中藥母液(10 mg/mL),用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前以0.22 μm濾器過濾,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 NLRP3抗體(ABclonal公司,貨號:A21906),ASC抗體(Immunoway公司,貨號:YT0365),Caspase-1抗體(proteintech公司,貨號:22915-1-AP),GSDMD抗體(proteintech公司,貨號:20770-1-AP),IL-1β抗體(CST公司,貨號:12242),IL-18抗體(proteintech公司,貨號:10663-1-AP),GAPDH 抗體 (proteintech公司,貨號:60004-1-1g),β-actin抗體(proteintech公司,貨號:81115-1-RR),HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG(proteintech公司,SA00001-2),HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(proteintech公司,SA00001-1),鬼筆環(huán)肽(proteintech公司,PF00001),通用型抗體稀釋液(蘇州新賽美公司,WB500D),胎牛血清(FBS,Vivacell公司,C04001-500),0.25% Trypsin & 0.02%EDTA胰酶(Vivacell公司,C3530-0100),青鏈雙抗(Vivacell公司,C3420-0100),PBS(Vivacell公司,C3580-0500),D-Glucose (北京蘭博利德公司,G8270-1KG);24孔板專用細(xì)胞爬片劑(Solarbio公司,YA0350),防熒光淬滅封片劑(含DAPI)(Solarbio公司,ZLI-9557),一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒10%(雅酶生物公司,PG212),BCA定量試劑盒(雅酶生物公司,ZJ102),特超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物(Biosharp公司,BL520B),驢抗小鼠IgG(H+L) 高度交叉吸附二抗(Thermo Fisher公司,A21202),驢抗兔 IgG(H+L)高度交叉吸附二抗(Thermo Fisher公司,A21207),DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司,10567-014)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 37 ℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱 (日本SANYO),電泳儀、垂直電泳槽及轉(zhuǎn)印電泳槽 (北京龍方),Tanon 4600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能),細(xì)胞超凈工作臺(美國Theromo Fisher)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)方法 制備含有10%胎牛血清和1%雙抗的糖濃度為5.5 mmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的恒溫孵育箱內(nèi),隔天換液,細(xì)胞融合至80%左右進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1細(xì)胞中NLRP3表達(dá)和細(xì)胞骨架情況 采用免疫熒光染色法觀察:提前將爬片置于24孔板中,將約5 000個(gè)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞接種在24孔板中,分為正常組、高糖組、芪地糖腎方組,細(xì)胞過夜貼壁后分別予完全培養(yǎng)基、30 mmol/L高糖培養(yǎng)基、30 mmol/L高糖培養(yǎng)基+芪地糖腎方(凍干粉)100 μg/mL培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基,用無菌PBS洗3遍;4%多聚甲醛室溫固定20 min,PBS洗3遍;0.1%Triton X-100透膜6 min,PBS洗3遍;5%驢血清室溫封閉30 min,PBS洗3遍;一抗4 ℃慢搖床孵育過夜,PBS洗3遍;二抗室溫慢搖床孵育1.5 h(避光),PBS洗3遍;用含DAPI封片劑封片(鬼筆環(huán)肽孵育后直接DAPI封片,無需孵育二抗)。

1.5.2細(xì)胞中焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測:將約80萬個(gè)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞接種在直徑100 mm的培養(yǎng)皿中,分為正常組、高糖組、芪地糖腎方組,過夜貼壁后分別予完全培養(yǎng)基、30 mmol/L高糖培養(yǎng)基、30 mmol/L高糖培養(yǎng)基+芪地糖腎方(凍干粉)100 μg/mL培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基,無菌PBS快速清洗細(xì)胞3次,加入蛋白裂解液,于冰上用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,充分裂解后離心取上清,BCA定量測定蛋白濃度后配制蛋白樣品,于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。制?0%的PAGE凝膠,上樣電泳、濕轉(zhuǎn)法將蛋白印跡轉(zhuǎn)移至NC膜上,5%脫脂牛奶封閉70 min,加入一抗(NLRP3抗體1∶1 000,ASC抗體1∶1 000、Caspase-1抗體1∶1 000,GSDMD抗體1∶1 000,IL-18抗體1∶800,IL-1β抗體1∶500,GAPDH抗體1∶10000,β-actin抗體1∶10000),4 ℃慢搖床孵育一抗過夜。次日用TBST洗膜6 min×3次,加入HRP標(biāo)記山羊抗兔/鼠(1∶8 000)室溫慢搖床孵育二抗50min,后用TBST洗膜6min×3次。1∶1配置超敏ECL發(fā)光液浸泡條帶,全自動(dòng)發(fā)光儀顯影。使用Image J軟件分析WB條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性,Levene檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊性,若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布且方差齊,采用單因素方差分析;若數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布或方差不齊,采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3表達(dá)情況 與正常組比較,高糖組NLRP3熒光染色紅色點(diǎn)狀熒光信號顯著增強(qiáng);與高糖組比較,芪地糖腎方組NLRP3紅色點(diǎn)狀熒光表達(dá)信號減弱。見圖1。

圖1 正常組和高糖刺激各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3表達(dá)情況(免疫熒光染色,×400)

2.2各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞骨架情況 正常組細(xì)胞的綠色絲狀熒光信號較強(qiáng),清晰可見,數(shù)量可觀,排列有序;與正常組比較,高糖組細(xì)胞中綠色絲狀熒光強(qiáng)度顯著減弱,且微絲數(shù)量減少,排列紊亂,骨架受損情況明顯;與高糖組比較,芪地糖腎方組細(xì)胞的綠色絲狀熒光信號增強(qiáng),微絲數(shù)量增多,紊亂排列改善。見圖2。

圖2 正常組和高糖刺激各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞骨架情況(免疫熒光染色,×400)

2.3各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 高糖組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相對表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05),芪地糖腎方組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-18、IL-1β蛋白相對表達(dá)量均明顯低于高糖組(P均<0.05)。見圖3及表1。

表1 正常組和高糖刺激各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中焦亡通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

圖3 正常組和高糖刺激各組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

腎小球內(nèi)皮細(xì)胞附著在腎小球毛細(xì)血管腔的內(nèi)層表面,有獨(dú)特的窗孔結(jié)構(gòu),其表面的糖萼層帶有負(fù)電荷,二者構(gòu)成內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械和電荷濾過屏障。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通過腎小球基底膜與腎小球臟層上皮細(xì)胞(即足細(xì)胞)相連接,三者共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障,是腎小球內(nèi)執(zhí)行濾過功能的第一道關(guān)卡,對維持腎小球?yàn)V過屏障的正常運(yùn)作具有關(guān)鍵性作用[16-18]。高血糖首先引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷,窗孔結(jié)構(gòu)破壞并伴隨內(nèi)皮糖萼層的減少,導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障損傷,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加[19],且腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可通過細(xì)胞間通訊作用進(jìn)而導(dǎo)致腎小球基底膜及足細(xì)胞功能障礙,加速破壞腎小球?yàn)V過屏障,導(dǎo)致蛋白尿和腎功能損傷的持續(xù)加重[20]。另外高糖刺激能使腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)炎癥小體激活,并觸發(fā)Caspase-1主導(dǎo)的經(jīng)典焦亡通路,從而加劇尿蛋白漏出及腎小球硬化的病理損傷[21]。焦亡是以細(xì)胞腫脹、質(zhì)膜破裂及炎性因子釋放為標(biāo)志性特征的一種細(xì)胞死亡方式,NLRP3炎癥小體是焦亡通路的重要啟動(dòng)子,向下可觸發(fā)經(jīng)典的Caspase-1依賴性級聯(lián)反應(yīng),活化的Caspase-1進(jìn)一步切割GSDMD蛋白及IL-1β、IL-18前體蛋白,導(dǎo)致IL-1β、IL-18等促炎因子的成熟及分泌,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡產(chǎn)生[22]。近年研究發(fā)現(xiàn),腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷出現(xiàn)早于臨床尿微量白蛋白的檢出,其損傷是DKD的早期事件及有力的“幕后推手”,且焦亡通路激活是DKD早期常見的致病機(jī)制[23-25]。因此,針對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的早期干預(yù)治療可能是對抗DKD病程進(jìn)展的有效手段。

柳紅芳教授結(jié)合多年臨證經(jīng)驗(yàn),受呂仁和教授“微型癥瘕”及仝小林教授“虛、瘀、濁”病機(jī)理論所啟,提出DKD“精損絡(luò)痹”的核心病機(jī)?！熬珦p”即腎精虧虛,“絡(luò)痹”即腎絡(luò)痹阻[26]。精損與絡(luò)痹互為因果,又相互影響,DKD時(shí)瘀熱濕濁等邪可直接結(jié)聚,病久入臟,阻于腎絡(luò);腎精虧耗,腎氣陰陽乏源亦可致痰瘀熱濁等邪氣滋生,兼之正虛無以抗邪,因虛致實(shí),諸邪留滯膠結(jié)難去,郁閉絡(luò)脈、阻截精竅,故成腎絡(luò)痹阻之態(tài)。腎絡(luò)痹阻則腎精之源布失其道,藏精之地充無所充,精愈虧而邪愈盛,形成愈實(shí)愈虛、愈虛愈實(shí)的惡性循環(huán)。腎絡(luò)痹阻不僅直傷腎精,又劫生精之道,諸因互促加重腎精虧虛,由此見腎絡(luò)痹阻是DKD的關(guān)鍵病機(jī)?；贒KD精損絡(luò)痹的核心病機(jī),柳紅芳教授提出“填精通絡(luò)”即填補(bǔ)腎精、祛邪通絡(luò)的治療原則,并據(jù)此法凝練出芪地糖腎方為代表方,該方臨床效驗(yàn)明確且現(xiàn)已通過國家專利審批(專利號:ZL201711097315.2)。芪地糖腎方以熟地、生黃芪、山萸肉與炒芡實(shí)行填腎精、助腎用之功,扶正補(bǔ)虛,以補(bǔ)助通;以水蛭、熟大黃及白花蛇舌草共行泄熱逐瘀、疏通腎絡(luò)之功,祛邪安正,通絡(luò)除痹;諸藥并行,共奏填補(bǔ)腎精、通絡(luò)除痹之效,使腎精充、正強(qiáng)以助除痹,使絡(luò)痹通、邪祛以復(fù)精虧。

現(xiàn)代中醫(yī)研究認(rèn)為高糖刺激誘發(fā)細(xì)胞焦亡所引起的病理產(chǎn)物堆積與“絡(luò)毒”學(xué)說具有高度一致性[27],DKD時(shí)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子累積與瘀熱濕濁等邪結(jié)聚腎絡(luò),即與“絡(luò)痹”的病理過程高度同步。本課題組前期研究顯示,高糖刺激下足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙,使原本應(yīng)在足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加工合成的機(jī)體所需的精微物質(zhì)生成障礙,被視作“精損”的病理過程[28]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),腎小球內(nèi)皮細(xì)胞與足細(xì)胞存在密切的細(xì)胞間通訊機(jī)制,糖尿病階段腎小球內(nèi)皮細(xì)胞即出現(xiàn)病理性形態(tài)改變,DKD時(shí)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷可進(jìn)一步導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的發(fā)生,而足細(xì)胞功能障礙又加劇腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷[29-30]。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞焦亡激活導(dǎo)致邪積絡(luò)痹,不僅導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)精微物質(zhì)生成障礙,直傷腎精;腎精虧耗,正虛難抗邪聚,因虛致實(shí),足細(xì)胞功能障礙又加重腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷,正應(yīng)精損與絡(luò)痹互為因果又相互影響的過程。鬼筆環(huán)肽是從傘形毒蕈蘑菇中分離出來的毒素,可以特異性地與絲狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)相結(jié)合,F-actin是細(xì)胞骨架的必備組分,可維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和生理功能。本實(shí)驗(yàn)通過鬼筆環(huán)肽染色觀察芪地糖腎方對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用,結(jié)果顯示芪地糖腎方可明顯改善高糖刺激后腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架受損狀態(tài),這與前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[15]。焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況顯示,高糖誘導(dǎo)下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞焦亡通路被激活,而芪地糖腎方可通過抑制焦亡通路重要啟動(dòng)子,即NLRP3、ASC及Caspase-1前體蛋白組裝成的炎癥小體激活,進(jìn)一步下調(diào)焦亡執(zhí)行因子GSDMD蛋白表達(dá)水平,從而減少IL-1β、IL-18的成熟與分泌。提示逆轉(zhuǎn)高糖影響下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞焦亡通路激活狀態(tài),可能是芪地糖腎方改善DKD腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷,對抗腎小球硬化病變的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

綜上所述,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在高糖持續(xù)刺激下可觸發(fā)NLRP3炎癥小體并激活焦亡通路,促使炎癥因子IL-1β、IL-18堆積,導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷,推進(jìn)腎臟炎癥、腎小球硬化進(jìn)程;芪地糖腎方可通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡相關(guān)通路激活誘導(dǎo)的IL-1β、IL-18等促炎因子分泌,從而顯著改善高糖刺激引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷,進(jìn)一步為芪地糖腎方的臨床應(yīng)用與推廣提供了理論依據(jù)。但本研究僅從體外實(shí)驗(yàn)初步探討驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論,仍需深入研究以進(jìn)一步完善其相關(guān)藥理作用機(jī)制和靶點(diǎn)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。