張麗瑩 薄曉文 張婷 孟強 李秋迎

1 山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院 （山東 濟南 250101）

2 國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室 （山東 濟南 250101）

3 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室 （山東 濟南 250101）

內(nèi)容提要： 文章闡述并驗證了采用紫外-可見分光光度（UV-VIS）法和高效液相色譜（HPLC）法測定醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料中透明質(zhì)酸鈉含量，并對HPLC法中透明質(zhì)酸鈉酶解過程中的酶解反應(yīng)時間進行進一步研究。結(jié)果顯示，HPLC法和UV-VIS法均可以準確高效地測定出不同類型的醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料中透明質(zhì)酸鈉含量，當敷料產(chǎn)品中存在干擾UV-VIS法測定的成分時，應(yīng)首選HPLC法，可以大幅度提高檢測效率和準確度。研究同時發(fā)現(xiàn)，在HPLC法中，酶解反應(yīng)時間對透明質(zhì)酸鈉含量測定結(jié)果的準確性起著關(guān)鍵作用，通過對酶解反應(yīng)時間進行研究，最終確定了不同類型敷料產(chǎn)品的最佳酶解反應(yīng)時間。

透明質(zhì)酸是一種高分子黏多糖，最早是在1934 年由Meyer和Palmer[1]從牛眼玻璃體中分離得到。它作為人體生理所必需的物質(zhì)，廣泛地存在于以皮膚真皮為主的多種人體組織、器官中，具有顯著獨特的潤滑和保濕作用[2,3]。由于透明質(zhì)酸的溶解性和穩(wěn)定性較差，實際使用時常加入鈉質(zhì)，轉(zhuǎn)化為透明質(zhì)酸鈉。透明質(zhì)酸鈉是一種白色粉末狀固體，是由β-D-葡糖醛酸和β-D-N-乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位反復(fù)交替連接而成的非均一性鏈狀天然高分子多糖類物質(zhì)，它無味、可溶于水、難溶于有機溶劑[4-6]。透明質(zhì)酸鈉不僅擁有透明質(zhì)酸的高保濕性、高潤滑性和高黏彈性，而且還有舒敏修復(fù)和抗炎功效，其化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定、溶解性更好[7]。透明質(zhì)酸鈉現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各類醫(yī)用敷料產(chǎn)品中，在現(xiàn)有的法規(guī)文件中，按照醫(yī)療器械管理的含透明質(zhì)酸鈉的醫(yī)用敷料僅限于《分類目錄》中管理類別為第三類的“透明質(zhì)酸鈉凝膠（分類編碼：14-08-02）”，多利用其物理特性用于術(shù)后防粘連[8-10]。由于相關(guān)該類產(chǎn)品的使用領(lǐng)域越來越廣泛，受用人群也越來越多，所以對該類醫(yī)用敷料產(chǎn)品的質(zhì)量檢測和把控變得尤為重要。目前，對透明質(zhì)酸鈉含量測定的方法相對成熟，主要包括兩種方法：紫外-可見分光光度（Ultraviolet-Visible Spectrophotometry，UV-VIS）法和高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法。本研究根據(jù)醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料的產(chǎn)品特性，首先初步確定了透明質(zhì)酸鈉含量測定的UV-VIS法和HPLC法，同時廣泛收集各類醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料產(chǎn)品，最后對兩個方法進行了試驗驗證。

1.實驗部分

1.1 UV-VIS法

1.1.1 儀器與試劑

研究起止時間：2023年4月～2023年6月。

儀器：紫外可見分光光度計：UV-2550型，日本島津公司。超純水系統(tǒng)：Milli-Q A10型，美國密理博公司。電子天平：德國Mettler Toledo公司。渦旋式混合器：VORTEX-5型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

試劑：咔唑（批號：A0373051），Acros Organics。無水乙醇、十水合四硼酸鈉、硫酸：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。葡萄糖酸醛酸（GA）標準品（批號：SLCM5812，純度：100%，有效期：2025年1月），Sigma。實驗用水為超純水。

1.1.2 溶液配制

0.125%的咔唑乙醇溶液：精密稱取0.1250g 咔唑，加100mL無水乙醇溶解，通過超聲使其溶解完全。

0.025mol/L的四硼酸鈉硫酸溶液：精密稱取4.7701g四硼酸鈉，加500mL濃硫酸，加蓋，正負顛倒搖勻使其溶解完全，低溫冷藏保存。

精密稱取葡萄糖醛酸（GA）100.16mg于100mL容量瓶中，加純水溶解并定容至刻度，搖勻，制成1001.6μg/mL的葡萄糖醛酸溶液，作為儲備液。

臨用前，精密移取儲備液5.0mL于100mL容量瓶中，加純水稀釋并定容至刻度，搖勻，制成50.08μg/mL的葡萄糖醛酸標準溶液。分別精密移取該標準溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL 于消解管中，加純水補充體積至1.0mL，制成濃度為0μg/mL、10.016μg/mL、20.032μg/mL、30.048μg/mL、40.064μg/mL、50.080μg/mL的系列標準溶液。

1.1.3 測定方法

將系列標準溶液各消解管和樣品消解管一起置于冰水浴中，緩慢地向每管中加入0.025 mol/L四硼酸鈉硫酸5.0mL，渦旋振蕩搖勻。置于沸水浴中煮沸10min后取出，放置冰水浴中冷卻。然后精密移取0.2mL咔唑乙醇溶液分別加入各消解管內(nèi)，充分振蕩搖勻后，置于沸水浴中加熱15min，冷卻至室溫。用濃度為0μg/mL的消解管作為空白對照，用紫外可見分光光度計，在波長530nm處測定系列標準溶液和樣品溶液的吸光度。

用系列標準溶液繪制吸光度與濃度（μg/mL）的標準曲線，將樣品溶液的吸光度代入標準曲線計算，得到樣品溶液中葡萄糖醛酸的濃度。

1.1.4 樣品預(yù)處理

精密稱取樣品適量于適當?shù)娜萘科恐?，加純水稀釋至刻度，使溶液中透明質(zhì)酸鈉的含量約為50μg/mL，渦旋搖勻，作為樣品溶液。精密移取樣品溶液1.0mL于消解管中備用。

1.2 HPLC法

1.2.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀：1260型，配PDA檢測器，美國安捷倫科技有限公司。電子天平：德國Mettler Toledo公司。渦旋式混合器：VORTEX-5型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。數(shù)控超聲波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超聲儀器有限公司。超純水系統(tǒng)：Milli-Q A10型，美國密理博公司。水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠0.2μm PTFE濾膜，美國Millippre公司。

試劑：磷酸：優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。二水合磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。透明質(zhì)酸鈉對照品：對照品1（批號：22031411，純度：100%），華熙生物科技股份有限公司；對照品2（純度：100%），濟南磐升生物技術(shù)有限公司。透明質(zhì)酸酶（批號：2204211，純度：50000 IU/mL），華熙生物科技股份有限公司。實驗用水為超純水。

1.2.2 溶液配制

酶解緩沖液：稱取二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）2.7450g、無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）0.3450g置100mL容量瓶中，加純水稀釋定容至刻度，搖勻，得到0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。準確量取上述緩沖液12.5～500mL容量瓶中，加純水稀釋至刻度，搖勻，得到稀釋40倍后的酶解緩沖液（5mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液）。

透明質(zhì)酸酶溶液：準確移取透明質(zhì)酸酶2.0～25mL的容量瓶中，加酶解緩沖液稀釋至刻度，搖勻，得到4000IU/mL透明質(zhì)酸酶溶液。

1%磷酸：準確量取濃磷酸10.0～1000mL容量瓶中，加純水稀釋至刻度，搖勻，得到1%磷酸。

精密稱取透明質(zhì)酸鈉對照品50.05mg于50mL容量瓶中，加酶解緩沖液適量，超聲30min，使透明質(zhì)酸鈉對照品充分溶解溶脹，用酶解緩沖定容至刻度，搖勻，制成1001μg/mL的透明質(zhì)酸鈉對照溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：MCI GEL CK08EH色譜柱（8×300mm，5μm），三菱化學(xué)株式會社；流動相：1%磷酸；流速：0.6mL/min；進樣量：20μL；柱溫：40°C；檢測波長：232nm。

1.2.4 樣品預(yù)處理

精密稱取樣品適量于帶刻度的塑料離心管中，加入5.0mL酶解緩沖液使樣品充分溶解，再加入1.0mL透明質(zhì)酸鈉酶溶液，渦旋混勻，用酶解緩沖溶液補充溶液體積至10mL，使溶液中透明質(zhì)酸鈉濃度約在0.05mg/mL，渦旋混勻，蓋蓋密封，置于42°C水浴鍋中酶解完全后，再煮沸2min使透明質(zhì)酸鈉酶失活，冷卻至室溫，經(jīng)0.20μm水性濾膜過濾得到樣品溶液。

2.結(jié)果與討論

2.1 UV-VIS法

2.1.1 樣品測試結(jié)果

用1.1.4項下的樣品預(yù)處理，采用1.1.3項下的測定方法，對5家生產(chǎn)廠家不同類型的醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料進行含量測試，將測試結(jié)果代入公式（1），計算產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉的含量，樣品信息及含量測試結(jié)果見表1。

表1.5家生產(chǎn)廠家UV-VIS法測試透明質(zhì)酸鈉含量結(jié)果

式中：X1-透明質(zhì)酸鈉含量，單位為mg/mL；2.0675-雙糖片斷分子量（401.3）與葡萄糖醛酸分子量（194.1）的比值；Ci-由回歸方程得到的樣品溶液中葡萄糖醛酸（GA）濃度，單位為μg/mL；V-樣品稀釋倍數(shù)；1.01-樣品密度，單位為g/mL；S-稱取樣品重量，單位為g；G-為標示量，單位為mg/mL或mg/g。

2.1.2 討論

采用UV-VIS法對5家產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉的含量進行測定，結(jié)果顯示，這5家產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉含量測試結(jié)果良好，結(jié)果均在標示含量規(guī)定的范圍內(nèi)。以上結(jié)果進一步表明，UV-VIS法準確、可靠、高效，可以適用于不含多元醇和色素等干擾性添加劑的醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉含量的測定。

2.2 HPLC法

2.2.1 樣品測試

廣泛收集并選擇了具有代表性的含有復(fù)雜添加劑的4個不同廠家的醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料產(chǎn)品，對這4批產(chǎn)品用1.2.4項下的樣品預(yù)處理，采用1.2.3項下的色譜條件進行含量測試，以外標法按照峰面積計算產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉的含量，將測試結(jié)果代入公式（2）或（3），樣品信息及含量測試結(jié)果見表2，空白酶解液色譜圖見圖1，透明質(zhì)酸鈉標準溶液色譜圖見圖2。

表2.4個生產(chǎn)廠家HPLC法測試透明質(zhì)酸鈉含量結(jié)果

圖1.空白酶解液色譜圖

圖2.透明質(zhì)酸鈉標準溶液色譜圖

式中：X2-透明質(zhì)酸鈉含量，單位為mg/mL 或mg/g；As-樣品溶液峰面積；Wr-對照品稱樣量，單位為mg；Z-對照品純度；Ar-對照溶液峰面積；ρ-樣品密度，單位為g/mL；S-樣品稱樣量，單位為g。

式中：X3-透明質(zhì)酸鈉含量，單位為%；As-樣品溶液峰面積；Wr-對照品稱樣量，單位為mg；Z-對照品純度；Ar-對照溶液峰面積；S-樣品稱樣量，單位為g。

2.2.2 討論

采用HPLC法對4家產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉的含量進行測定，結(jié)果顯示，這4家產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉含量測試結(jié)果良好，結(jié)果均在標示含量規(guī)定的范圍內(nèi)。以上結(jié)果進一步表明，當醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料中添加多元醇和色素等干擾性添加劑時，HPLC法可以對產(chǎn)品中的透明質(zhì)酸鈉進行準確定量，該法適應(yīng)性好且高效可靠。

2.2.3 酶解反應(yīng)時間研究

試驗過程中，發(fā)現(xiàn)酶解反應(yīng)時間長短對透明質(zhì)酸鈉酶解結(jié)果有至關(guān)重要的影響。該研究在最佳酶用量（4000 IU/mL，1.0mL）的基礎(chǔ)上對酶解反應(yīng)時間開展深入探索，對來源不同的4批醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料分別設(shè)置了不同的酶解反應(yīng)時間，即2h、2.5h、3h，采用1.2.3項下的色譜條件進行含量測試，將透明質(zhì)酸鈉含量最大值所對應(yīng)的酶解反應(yīng)時間作為最佳酶解反應(yīng)時間。樣品信息及實驗結(jié)果見表3。

表3.HPLC法中不同酶解反應(yīng)時間含量測試結(jié)果

結(jié)果顯示，產(chǎn)品F、H、I在酶解反應(yīng)時間為2h時達到了含量最大值，產(chǎn)品G在酶解反應(yīng)時間為2.5h時達到了含量最大值，表明不同生產(chǎn)工藝的醫(yī)用敷料產(chǎn)品在透明質(zhì)酸鈉酶解過程中所需的最佳酶解反應(yīng)時間不同。因此采用HPLC法測定不同類型敷料中的透明質(zhì)酸鈉含量時，須對最佳酶解反應(yīng)時間進行研究和驗證，以保證測定結(jié)果的準確性。

3.小結(jié)

隨著技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料產(chǎn)品的工藝類型越來越多樣化，市面上已存在包括液體敷料、凝膠敷料、敷貼、凍干粉和凍干海綿等形式各異的醫(yī)用敷料產(chǎn)品。在醫(yī)用敷料產(chǎn)品中起到主要功效的成分是透明質(zhì)酸鈉，因此它是進行研究的首要對象，完善針對該類產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉含量快速高效檢測方法的建立，關(guān)乎全民醫(yī)療器械使用安全，對保障人民健康具有重要意義。

現(xiàn)已執(zhí)行的醫(yī)療器械行業(yè)標準YY/T 0308-2015《醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠》和YY/T 0962-2021《整形手術(shù)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠》均采用UV-VIS法對透明質(zhì)酸鈉含量進行測定。劉麗君等[11]、李敏等[12]和湯祥忠等[13]也曾采用UV-VIS法對止血材料、滴眼液和乳制品等產(chǎn)品中的透明質(zhì)酸鈉含量進行了測定。UV-VIS法是Bitter和Muir改良的咔唑法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品和醫(yī)療器械等各個領(lǐng)域中對透明質(zhì)酸鈉含量的測定，但該法還未針對醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料產(chǎn)品進行全面系統(tǒng)的試驗驗證，因此通用的UV-VIS法成為醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉含量測定的首選方法[14]。但由于醫(yī)用敷料產(chǎn)品中的成分往往很復(fù)雜，主要成分除了水和透明質(zhì)酸鈉外，也常添加多元醇（丙三醇）和色素等顯色成分添加劑來增強其保濕和識別作用，這些添加劑會干擾UV-VIS法中的顯色過程，對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，此時可以選擇高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法對透明質(zhì)酸鈉含量進行測定。張志舟等[15]、陳玉娟等[16]和張莉等[17]曾采用HPLC法對透明質(zhì)酸鈉含量展開了研究，結(jié)合現(xiàn)已有的色譜方法，將HPLC法作為醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料產(chǎn)品中透明質(zhì)酸鈉含量測定的另一高效、準確、可行的檢測方法。

本研究同時確定了醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料中透明質(zhì)酸鈉含量測定的UV-VIS法和HPLC法，并對兩種方法進行了試驗驗證。驗證結(jié)果表明UV-VIS法和HPLC法均可用于醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料類產(chǎn)品的透明質(zhì)酸鈉含量測定。但當產(chǎn)品中添加了多元醇、色素等干擾UV-VIS法的添加劑時，應(yīng)首選HPLC法進行含量測定。另外，在選擇HPLC法時，要對透明質(zhì)酸鈉的酶解時間進行控制，選擇透明質(zhì)酸鈉能夠酶解完全的反應(yīng)時間作為最終酶解時間，以便高效、準確地測得醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料中透明質(zhì)酸鈉的真實含量。