王曉晨 張璐 閆芳 王亞琳 柴謙 山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心 （山東 濟(jì)南 250014）

內(nèi)容提要： 重組膠原蛋白液體敷料進(jìn)行第二類醫(yī)療器械注冊(cè)申報(bào)時(shí)，按照《重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》進(jìn)行關(guān)鍵性能測(cè)試。文章對(duì)產(chǎn)品的有效成分進(jìn)行鑒別和含量檢測(cè)、并對(duì)是否體外透皮吸收、成膜性、膜微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率及平均孔徑等進(jìn)行性能測(cè)試，以此評(píng)價(jià)該液體創(chuàng)面敷料在注冊(cè)申報(bào)第二類醫(yī)療器械時(shí)的安全性和有效性。結(jié)果表明，采用2，2’-聯(lián)喹啉二羧酸（BCA）法測(cè)得該敷料所含有效成分（以重組膠原蛋白為有效成分計(jì)）含量平均值為2.01mg/mL，在0.5、1、2、6、12h時(shí)均未透過(guò)巴馬香豬的新鮮離體缺損皮膚，判定不可被人體吸收。該液體敷料的成膜性良好，37°C下干燥1min后形成一層肉眼可見(jiàn)的膜狀物。控制成膜厚度為3mm，45°C下放置12h干燥，在掃描電子顯微鏡下觀察的膜微觀形態(tài)，分別放大400倍和5000倍的膜狀物表面分別呈現(xiàn)出不同孔隙狀的物理屏障保護(hù)層，經(jīng)計(jì)算孔隙率為7.645%，平均孔徑為1.414μm。該液體敷料適用于切割傷等非慢性創(chuàng)面的護(hù)理，具有廣闊的臨床使用價(jià)值和市場(chǎng)前景。

在意外傷害、外科手術(shù)等多種原因造成的真皮淺層及其以上的淺表性小創(chuàng)口、擦傷中，創(chuàng)面敷料能否形成屏障保護(hù)或?yàn)閯?chuàng)面愈合提供良好的護(hù)理基礎(chǔ)，一直是臨床應(yīng)用急需考慮的問(wèn)題[1,2]。重組膠原蛋白（Recombinant Collagen Protein，RCP）是近年來(lái)關(guān)注度較高的新興生物材料，具有良好的人體同源性、親水性和細(xì)胞黏附性，可制備成液體、凝膠、海綿等不同型式的創(chuàng)面敷料[3-5]。RCP創(chuàng)面敷料進(jìn)行第二類醫(yī)療器械注冊(cè)申報(bào)時(shí)，需符合國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》[6]的關(guān)鍵性能，制定出產(chǎn)品技術(shù)要求，進(jìn)行的研究能證明敷料在非慢性創(chuàng)面形成物理屏障作用，以保證醫(yī)療器械上市注冊(cè)的安全性和有效性。本文測(cè)試了RCP液體敷料的有效成分鑒別和含量、是否體外透皮吸收、成膜性、膜微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率及平均孔徑等性能，以此評(píng)價(jià)該液體創(chuàng)面敷料在注冊(cè)申報(bào)第二類醫(yī)療器械時(shí)的安全性和有效性，為各省的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)醫(yī)療器械審評(píng)審批人員、醫(yī)療器械生產(chǎn)研發(fā)人員、注冊(cè)申請(qǐng)人等提供一些RCP敷料產(chǎn)品的數(shù)據(jù)參考和信息評(píng)估。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試驗(yàn)起止時(shí)間：2022年1月～2023年10月。

原料試劑：重組膠原蛋白液體敷料（Recombinant Collagen Protein Liquid Dressing，RCPLD），實(shí)驗(yàn)室自制；重組人源膠原蛋白參比品（SYB），批號(hào)DA2290S009，江蘇江山聚源生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）（測(cè)序級(jí)），批號(hào)AS01589，Promega公司；生理鹽水，批號(hào)20221514，信合援生制藥股份有限公司；BSA牛血清白蛋白、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，批號(hào)均為P0011，碧云天生物技術(shù)有限公司。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀，型號(hào)Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific公司；透皮擴(kuò)散儀，型號(hào)TK-12D，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀，型號(hào)SpectraMax M2e，美谷分子儀器（上海）有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)DNP-9082，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；掃描電子顯微鏡，型號(hào)SUPRA 55，德國(guó)蔡司Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 鑒別試驗(yàn)

參考《中華人民共和國(guó)藥典》[7]（2020版）第四部通則3405通則肽圖檢查法的第一法“胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法”進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 體外透皮試驗(yàn)

巴馬香豬經(jīng)麻醉剃毛、常規(guī)消毒后，在背部脫毛部位用無(wú)菌針頭或手術(shù)刀片劃切，制備類似“井”字形創(chuàng)面，以滲血為宜，剔除皮下脂肪及組織沖凈為離體豬皮創(chuàng)面模型（見(jiàn)圖1）[8-11]。將其固定于透皮吸收擴(kuò)散儀上，角質(zhì)層朝上，真皮層與接收池內(nèi)接收液完全接觸，設(shè)定水浴溫度為32°C，磁力攪拌子作用于接收液中，轉(zhuǎn)速100r/min，向接收池內(nèi)注滿預(yù)溫32°C±1°C的生理鹽水8mL，排盡氣泡。擴(kuò)散液為受試物，接收池容積為8mL，接收液為生理鹽水。皮膚涂覆面積為1.8cm2。

圖1.新鮮離體巴馬香豬創(chuàng)面模型

取1mLRCPLD作為試驗(yàn)組，均勻覆蓋離體皮膚，每組設(shè)三個(gè)平行組，設(shè)置1mL生理鹽水為對(duì)照組。參照有關(guān)暴露時(shí)間的規(guī)定，同時(shí)考慮到皮膚完整性超過(guò)24h就會(huì)變差，因此于第0.5、1、2、6、12h用注射器吸取全部接收液，采用2，2’-聯(lián)喹啉二羧酸（BCA）法定量分析RCP含量，作為敷料產(chǎn)品有效成分是否被人體吸收的判斷依據(jù)[8,12]。

1.2.3 成膜測(cè)試

吸取RCPLD約2～3滴均勻涂布于載玻片上，在37°C恒溫箱中放置1min后翻轉(zhuǎn)載玻片觀察。以純化水組做對(duì)照。肉眼觀察是否能附著在載玻片上，且能否在載玻片上形成膜狀物。

1.2.4 掃描電子顯微鏡和孔隙率測(cè)試

取RCPLD倒入底部平整的直徑為3.8cm的干燥培養(yǎng)皿中，控制厚度為3mm，在45°C下放置12h待干燥、成膜。用掃描電子顯微鏡分別放大400倍和5000倍，觀察以上條件形成的RCPLD膜的微觀結(jié)構(gòu)，測(cè)試孔隙率和平均孔徑。

2.結(jié)果

2.1 鑒別試驗(yàn)結(jié)果

RCPLD主要特征肽段相對(duì)比例（響應(yīng)強(qiáng)度）與參比品（SYB）基本一致。見(jiàn)圖2。

圖2.RCPLD 與參比品（SYB）主要特征肽段相對(duì)比例（響應(yīng)強(qiáng)度）（注：2a.RCPLD；2b.參比品）

2.2 體外透皮試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 BCA法蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白濃度線性檢測(cè)范圍為0～1mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備是將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA 按照0、1、2、4、8、12、16、20μL依次加入96孔板中，然后每個(gè)孔依次加入20、19、18、16、12、8、4、0μL生理鹽水，使其體積補(bǔ)足到20μL，按照BCA法處理后測(cè)定562nm處的吸光度，并以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得回歸方程為Y=1.7051X-0.1873，R2=0.9991。見(jiàn)圖3。

圖3.BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～1mg/mL）

2.2.2 質(zhì)控樣品考察

以濃度為0.50mg/mL的BSA為質(zhì)控樣品，設(shè)置3個(gè)平行樣品，在同一批次內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求算測(cè)定濃度，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，平均值0.51mg/mL。

表1.質(zhì)控樣BSA膠原蛋白含量

2.2.3 RCPLD中膠原蛋白含量測(cè)定

將RCPLD稀釋后檢測(cè)膠原蛋白含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，RCPLD中膠原蛋白含量平均值為2.01mg/mL。

表2.驗(yàn)樣RCPLD膠原蛋白含量

2.2.4 RCPLD體外透皮結(jié)果

采用BCA法測(cè)定RCPLD中膠原蛋白含量的方法靈敏度高，準(zhǔn)確度好，在20～1000μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，作用不同時(shí)間后接收液中膠原蛋白含量見(jiàn)表3，可以看出，不同透皮時(shí)間，生理鹽水組和受試物組接收液中蛋白含量均增加，與對(duì)照組相比，受試物組的蛋白含量增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在0.5、1、2、6、12h時(shí)均未透過(guò)離體缺損皮膚。

表3.接收液中累計(jì)蛋白含量對(duì)比(n=3,±s,mg)

表3.接收液中累計(jì)蛋白含量對(duì)比(n=3,±s,mg)

組別時(shí)間0.5h 1h 2h 6h 12h生理鹽水組0.61±0.11 1.25±0.14 2.63±0.17 4.22±0.15 6.86±0.18 RCPLD組0.59±0.14 1.26±0.15 2.43±0.22 4.05±0.24 6.67±0.34

體外透皮試驗(yàn)結(jié)果顯示，生理鹽水組接收液中檢測(cè)出蛋白，認(rèn)為來(lái)自離體皮膚，表明離體狀態(tài)下皮膚中膠原蛋白有滲出。RCPLD組接收液中蛋白含量增加，但增加量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），進(jìn)一步表明RCPLD組接收液中蛋白來(lái)自離體皮膚。

2.3 成膜測(cè)試結(jié)果

分別取2、3滴RCPLD和純化水均勻地涂抹于載玻片上，在37°C恒溫箱1min后成膜對(duì)比圖（見(jiàn)圖4）。從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，RCPLD溶液可附著在載玻片上并在載玻片上形成一層透明的膜狀物，具備成膜性能。

圖4.RCPLD 和純化水在37?C 恒溫箱1min 后成膜對(duì)比圖（注：4a.RCPLD 和純化水涂覆載玻片的情況對(duì)比圖；4b.試驗(yàn)條件下RCPLD 涂覆后形成膜狀物；4c.試驗(yàn)條件下純化水涂覆后的殘留）

2.4 掃描電子顯微鏡和孔隙率測(cè)試結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，45°C下干燥12h形成半透明RCPLD膜，可用鑷子取下。其微觀結(jié)構(gòu)不是一個(gè)平滑表面，均呈多孔網(wǎng)狀的纖維結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5）。對(duì)RCPLD膜孔隙率和孔徑的測(cè)試結(jié)果為，孔隙率為7.645%，孔徑平均為1.414μm。由此可見(jiàn)，RCPLD具有一定的鎖水性（結(jié)合水后相分離均勻）、機(jī)械性能及熱穩(wěn)定性。

圖5.掃描電子顯微鏡下放大400 倍(5a)和放大5000 倍(5b)的RCPLD 成膜圖像

3.討論

RCP敷料的用途主要在于促進(jìn)傷口愈合，增強(qiáng)受損皮膚的修復(fù)能力。為了模擬真實(shí)條件下RCP透皮吸收情況，選用具有淺表性傷口的豬皮作為離體供試皮膚。機(jī)械性傷口是各種外力作用的結(jié)果，根據(jù)受傷的深度又分為淺表性或上皮性損傷傷口、穿透性傷口、復(fù)合傷口。其中淺表性或上皮性損傷傷口是指?jìng)诶奂氨砥?，因表皮具有再生能力，愈合后一般無(wú)瘢痕，如Ⅰ度燒傷或燙傷傷口、中厚皮片供皮區(qū)均可視為淺表性傷口，這類淺表性傷口為RCP敷料主要修復(fù)類型[13,14]。

本文對(duì)RCPLD，分別進(jìn)行了有效成分含量、是否透皮吸收、成膜性、膜微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率及平均孔徑的性能測(cè)試。選擇巴馬香豬的新鮮離體缺損皮膚為測(cè)試模型，采用BCA法設(shè)定0.5、1、2、6、12h，測(cè)得該創(chuàng)面敷料所含膠原蛋白含量平均值為2.01mg/mL，均未透過(guò)測(cè)試模型，因此判定該敷料不可被人體吸收。此外37°C下干燥1min后該敷料能形成一層肉眼可見(jiàn)的膜狀物，成膜性良好。在控制成膜厚度為3mm，45°C條件下放置12h干燥，觀察掃描電子顯微鏡下放大400倍和5000倍的膜狀物表面分別呈現(xiàn)出不同孔隙狀的物理屏障保護(hù)層，測(cè)得孔隙率為7.645%，平均孔徑為1.414μm。RCPLD進(jìn)行第二類醫(yī)療器械注冊(cè)申報(bào)時(shí)，符合了《重組膠原蛋白創(chuàng)面敷料注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》[6]的關(guān)鍵性能要求，通過(guò)以上對(duì)第二類醫(yī)療器械上市注冊(cè)的安全性和有效性進(jìn)行的相關(guān)測(cè)試，能證明該敷料形成物理屏障起到屏障修護(hù)作用，適用于切割傷、擦傷、淺表創(chuàng)口等非慢性創(chuàng)面的覆蓋和護(hù)理。本文的測(cè)試結(jié)果可以為各省藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)醫(yī)療器械審評(píng)審批人員、醫(yī)療器械生產(chǎn)研發(fā)人員、注冊(cè)申請(qǐng)人等提供一些較為直觀的數(shù)據(jù)參考，同時(shí)對(duì)RCP創(chuàng)面敷料產(chǎn)品的注冊(cè)申報(bào)信息進(jìn)行科學(xué)合理的評(píng)估提供一些幫助。