王麗潔 梁羽 朱雨婷 孫國(guó)偉 蘇州蘇大衛(wèi)生與環(huán)境技術(shù)研究所有限公司 （江蘇 蘇州 215123）

內(nèi)容提要： 目的：評(píng)價(jià)注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的生物相容性。方法：分別通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、植入試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)來(lái)全面評(píng)價(jià)注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的生物相容性。結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠對(duì)L929細(xì)胞有輕度細(xì)胞毒性、無(wú)致敏反應(yīng)、無(wú)遺傳毒性、無(wú)急性和慢性毒性反應(yīng)、皮內(nèi)反應(yīng)記分為1.5，植入試驗(yàn)4、13、26、52周各階段評(píng)分為3.08、1.83、0.33、0，52周基本完成降解。結(jié)論：該注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠對(duì)局部組織有輕微不良反應(yīng)，但未發(fā)現(xiàn)全身毒性和遺傳毒性影響。

透明質(zhì)酸又名玻尿酸，為雙糖（D-葡萄糖醛酸和D-N乙酰氨基葡萄糖）重復(fù)構(gòu)成的直鏈結(jié)構(gòu)，主要以鈉鹽的形式存在，在人體內(nèi)主要分布在皮膚、結(jié)締組織、關(guān)節(jié)腔滑液等組織中。由于其沒(méi)有種屬和組織特異性，被廣泛用于臨床如骨科潤(rùn)滑補(bǔ)充劑、術(shù)后防粘連劑、眼科黏彈劑及皮膚填充劑等產(chǎn)品[1]。其中用于皮膚填充的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，由于其在組織局部保留時(shí)間長(zhǎng)，可通過(guò)注射實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)填充美容，近年來(lái)受到醫(yī)美界的關(guān)注[2,3]。但交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠由于其生產(chǎn)工藝中引入了添加劑和交聯(lián)劑，其殘留量的控制將直接影響生物學(xué)反應(yīng)，交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的原材料分子結(jié)構(gòu)變化和植入后體內(nèi)酶解中間產(chǎn)物均有可能導(dǎo)致生物學(xué)反應(yīng)[4,5]。本研究按照ISO 10993.1-2018[6]設(shè)計(jì)方案策略，并按ISO系列標(biāo)準(zhǔn)[7-11]

要求開展細(xì)胞毒性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、植入試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)，為這一產(chǎn)品的后續(xù)的申報(bào)注冊(cè)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 一般材料

研究起止時(shí)間：2020年1～2021年5月。

儀器設(shè)備：高壓滅菌器；CO2培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；電子天平；超凈工作臺(tái)；恒溫振蕩器；電子秤；恒溫水浴鍋；離心機(jī)；生物安全柜；生化培養(yǎng)箱；生物顯微鏡等。

試劑：注射用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠（由某單位提供）；胎牛血清（GiBco）；1640培養(yǎng)基（HyClone）；胰酶（GiBco）；青霉素鏈霉素（GiBco）；MEM（GiBco）；PBS（GiBco）；中性紅（Sigma）；弗氏完全佐劑（Sigma）；十二烷基硫酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)）；秋水仙素（國(guó)藥集團(tuán)）；DMSO（國(guó)藥集團(tuán)）；S9（MOLECULAR TOXICOLOGY，INC）；甲磺酸甲酯（Sigma）；環(huán)磷酰胺（RHAWN）；絲裂霉素（GLPBIO）；9-氨基吖啶（Sigma）；2-硝基芴（Sigma）；2-氨基蒽（Sigma）；苯并（a）芘（Aladdin）；疊氮鈉（Alfa Aesar）；吉姆薩染液（Solarbio）；三氟胸苷（Sigma）；L-組氨酸（國(guó)藥集團(tuán)）；D-生物素（國(guó)藥集團(tuán)）。

試驗(yàn)系統(tǒng)：小鼠成纖維細(xì)胞（L929）；鼠傷寒沙門氏菌（TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535）；小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Ytk+/-）；中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL）；新西蘭白兔（蘇州高新區(qū)鎮(zhèn)湖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司）；白化短毛豚鼠（上海甲干生物科技有限公司）；ICR小鼠、SD大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞試驗(yàn)

按照ISO 10993-5:2009方法進(jìn)行試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。以10mm×10mm濾紙為載體，涂布樣品用于試驗(yàn)組。陽(yáng)性組為天然乳膠，陰性組為高密度聚乙烯，每組分別設(shè)3個(gè)平行。將樣品覆蓋于L929細(xì)胞層，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，取出平皿在底部用標(biāo)記筆標(biāo)出樣品所在位置，棄樣品并去除培養(yǎng)基，在每皿中加入2mL中性紅孵育1h，吸棄中性紅，加入2mL PBS，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2 致敏試驗(yàn)

按照ISO 10993-10:2009方法進(jìn)行試驗(yàn)，評(píng)價(jià)樣品潛在的皮膚致敏反應(yīng)。采用豚鼠最大限度試驗(yàn)，試驗(yàn)組以樣品原液對(duì)豚鼠背部進(jìn)行6點(diǎn)位皮內(nèi)注射誘導(dǎo)，注射后7d以樣品于皮內(nèi)注射部位進(jìn)行48h局部貼敷誘導(dǎo)，局部誘導(dǎo)后14d于側(cè)腹部進(jìn)行24h敷貼加以激發(fā)，除去樣品后24、48h觀察皮膚紅斑和水腫并記分。

1.2.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)

按照ISO 10993-10:2009方法進(jìn)行試驗(yàn)，采用原液皮內(nèi)注射方式給藥。動(dòng)物背部剃毛后在左側(cè)指定區(qū)域注射5個(gè)位點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.2mL樣品原液，右側(cè)區(qū)域注射對(duì)照生理鹽水。注射后0、24、48、72h觀察各注射局部和周圍皮膚反應(yīng)，包括紅斑、水腫、壞死等，并按照標(biāo)準(zhǔn)記分方法進(jìn)行記錄。

1.2.4 急性毒性試驗(yàn)

按照ISO 10993-11:2017方法進(jìn)行試驗(yàn)。取10只SD大鼠，雌雄各半，采用原液進(jìn)行一次性腹腔注射給藥，注射劑量15mL/kg體重（相當(dāng)于體重70kg成人在100倍安全系數(shù)下注射10mL），對(duì)照組給予等劑量生理鹽水。注射后觀察小鼠即時(shí)反應(yīng)，并于4、24、48和72h觀察和記錄動(dòng)物的一般狀態(tài)，毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)。

1.2.5 慢性毒性試驗(yàn)

按照ISO 10993-11:2017方法進(jìn)行試驗(yàn)。取60只SD大鼠，雌雄各半，以原液在動(dòng)物背部進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射給藥，注射總劑量15mL/kg體重，對(duì)照組植入高密度聚乙烯對(duì)照。試驗(yàn)周期180d。每天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行臨床觀察，每周稱重。試驗(yàn)終止日前一晚禁食過(guò)夜，終止日采血進(jìn)行血液學(xué)和血液生化檢查。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行大體解剖觀察，稱取臟器濕重，將器官和組織保存于10%甲醛固定液中。用組織學(xué)方法處理組織（包埋、切片、蘇木精-伊紅染色），進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.2.6 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

按照ISO 10993-3:2014和ISO/TR 10993-33:2015方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)組將樣品按5μL/皿分別加入有、無(wú)活化系統(tǒng)S9的頂層培養(yǎng)基中，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別用等體積的生理鹽水和陽(yáng)性誘變劑。于37°C培養(yǎng)72h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，計(jì)數(shù)每皿回復(fù)突變的菌落數(shù)，用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

1.2.7 染色體畸變?cè)囼?yàn)

按照ISO 10993-3:2014和ISO/TR 10993-33:2015方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)組將樣品以5μL/mL（樣品與試驗(yàn)系統(tǒng)終體積比）在有、無(wú)活化系統(tǒng)S9情況下，與中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞共孵育4h和（或）24h。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別加入等體積的生理鹽水和陽(yáng)性誘變劑。染毒結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)，加入秋水仙素。收集細(xì)胞，低滲及固定。滴片，吉姆薩染液染色，中性樹膠封片及鏡檢閱片。每一劑量組至少選200個(gè)分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體畸變分析，計(jì)算畸變率，用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

1.2.8 基因突變?cè)囼?yàn)

按照ISO 10993-3:2014和ISO/TR 10993-33:2015方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)組將樣品以5μL/mL（樣品與試驗(yàn)系統(tǒng)終體積比）在有、無(wú)活化系統(tǒng)S9情況下，與L5178Y tk+/-細(xì)胞共孵育3h和（或）24h。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別加入等體積的生理鹽水和陽(yáng)性誘變劑。在三氟胸苷選擇下計(jì)數(shù)大、小集落數(shù)，計(jì)算抗性突變頻率（Mutation Frequency，MF）和小集落突變百分比（Small Colony Mutation Frequency，SCMF）。

1.2.9 皮下植入試驗(yàn)

按照ISO 10993-6:2016方法進(jìn)行試驗(yàn)。動(dòng)物背部脊柱左側(cè)皮下進(jìn)行3個(gè)部位注射，每個(gè)部位0.2mL試驗(yàn)樣品，右側(cè)對(duì)照植入同類已上市產(chǎn)品，于4、13、26、52周4個(gè)觀察期分別處死動(dòng)物，觀察植入部位情況并取材進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞毒性的大小用反應(yīng)分級(jí)來(lái)表示，結(jié)果見表1。試驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)變性或裂解，反應(yīng)局限于樣品下區(qū)域，細(xì)胞毒性為2級(jí)輕度反應(yīng)。

表1.細(xì)胞毒性反應(yīng)(n=3)

2.2 致敏試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)后均未見皮膚紅斑和水腫反應(yīng)，致敏率為0%，表明樣品在豚鼠未發(fā)現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)。

2.3 皮內(nèi)反應(yīng)結(jié)果

皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見表2。試驗(yàn)組皮內(nèi)反應(yīng)超過(guò)對(duì)照組，平均記分之差＞1.0，不符合標(biāo)準(zhǔn)要求。繼續(xù)觀察7d，注射部位周圍皮膚紅斑消退，說(shuō)明該損傷是可逆的。但試驗(yàn)樣品仍存于皮內(nèi)，形成隆起，延長(zhǎng)觀察至14d仍未有變化。

表2.皮內(nèi)反應(yīng)結(jié)果(n=3,分)

2.4 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

注射完畢后，試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠均未出現(xiàn)動(dòng)物死亡，未見任何毒性反應(yīng)，精神狀態(tài)良好，體重增長(zhǎng)在正常范圍內(nèi)。

2.5 慢性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠均未觀察到臨床異常表現(xiàn)，兩組大鼠試驗(yàn)前后的體重變化無(wú)顯著差異（P＞0.05）。動(dòng)物大體解剖觀察未見異常，試驗(yàn)組和對(duì)照組臟器系數(shù)亦無(wú)顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)組個(gè)別血液學(xué)（MCH、MPV）和血液生化參數(shù)（ALB、P、K）與對(duì)照組相比有差異（P＜0.05），但均在大鼠正常生物學(xué)范圍之內(nèi)，無(wú)實(shí)際生物學(xué)意義。試驗(yàn)組和對(duì)照組比較，未見明顯組織病理學(xué)差異。

2.6 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

試驗(yàn)背景菌苔生長(zhǎng)良好，各菌株自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)在預(yù)期數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，在有、無(wú)活化系統(tǒng)情況下，陽(yáng)性組各菌株突變數(shù)較陰性組均有顯著增加（P＜0.05）且在試驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，試驗(yàn)組各菌株突變數(shù)與陰性組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），見表3。

表3.鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果(n=3,±s,CFU/皿)

表3.鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果(n=3,±s,CFU/皿)

組別TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9試驗(yàn)組209±23 212±8 30±5 27±4 231±34 235±21 335±26 430±27 25±3 26±3陰性組206±43 248±25 27±1 29±2 236±52 242±17 355±35 317±12 25±3 21±2自發(fā)回復(fù)突變組192±13 226±21 26±6 28±8 270±15 275±24 317±15 331±23 31±3 26±4陽(yáng)性組1,150±161 871±48 916±42 311±25 897±49 732±41 1,030±93 1,006±102 481±34 316±77

2.7 染色體畸變?cè)囼?yàn)

在有、無(wú)活化系統(tǒng)情況下，經(jīng)4h和（或）24h受試物暴露，試驗(yàn)組結(jié)構(gòu)畸變率、細(xì)胞畸變率和陰性組比較均無(wú)明顯差異（P＞0.05），而陽(yáng)性組結(jié)構(gòu)畸變率和細(xì)胞畸變率較陰性組有顯著差異（P＜0.05），見表4。

表4.染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果(n=3,±s,%)

表4.染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果(n=3,±s,%)

組別-S9(4h)-S9(24h)+S9(4h)結(jié)構(gòu)畸變率細(xì)胞畸變率結(jié)構(gòu)畸變率細(xì)胞畸變率結(jié)構(gòu)畸變率細(xì)胞畸變率試驗(yàn)組2.5±0.71 2.5±0.71 2.5±0.71 2.5±0.71 3.0±0.00 3.0±0.00陰性組1.5±2.12 1.5±2.12 2.0±1.41 2.0±1.41 2.0±0.00 2.0±0.00陽(yáng)性組24.5±0.71 31.0±8.49 24.5±2.12 31.5±10.61 24.5±3.54 31.5±7.78

2.8 基因突變?cè)囼?yàn)

在有、無(wú)活化系統(tǒng)情況下，經(jīng)3h和（或）24h受試物暴露，試驗(yàn)組抗性MF及SCMF與陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05），陽(yáng)性組MF和SCMF較陰性組有顯著差異（P＜0.05），見表5。

表5.基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果(n=3)

2.9 皮下植入試驗(yàn)

植入后4、13、26、52周處死動(dòng)物，分離皮下組織，肉眼觀察4、13周植入物包囊明顯，26周時(shí)植入物可見，52周時(shí)未見植入物包囊。植入后4、13、26周顯微鏡檢查，可見不同程度纖維化包囊及炎癥反應(yīng)，包囊內(nèi)可以觀察到大量樣品殘留和碎片（見圖1），組織病理學(xué)計(jì)分分別為3.08、1.83和0.33。植入52周后，病理觀察基本無(wú)樣品殘留，炎癥反應(yīng)消失，記分為0。

圖1.皮下植入部位組織病理學(xué)觀察（注：a.×100，4 周；b.×400，13 周；c.×100，26 周；d.×400，52 周；蘇木精-伊紅染色，黑色箭頭所指為樣品殘留）

3.討論

臨床上透明質(zhì)酸凝膠用于美容皮膚填充時(shí)，一般直接皮內(nèi)或皮下注射至人體組織，故本研究體外試驗(yàn)中用樣品原液直接和試驗(yàn)系統(tǒng)接觸，體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)均模擬臨床使用方式或采取更嚴(yán)格的接觸途徑開展試驗(yàn)，充分評(píng)估透明質(zhì)酸凝膠生物安全性。

透明質(zhì)酸進(jìn)入人體后容易被代謝吸收，為維持填充的效果，用于醫(yī)美時(shí)一般需加入交聯(lián)劑及添加劑合成大分子結(jié)構(gòu)，使其降解速度變慢。有文獻(xiàn)指出，常用交聯(lián)劑1,4-丁二醇二縮水甘油醚與細(xì)胞接觸會(huì)引起一定毒性和炎癥應(yīng)[5]。本研究中細(xì)胞毒性、皮內(nèi)反應(yīng)、植入等局部試驗(yàn)中出現(xiàn)一定程度的毒性、刺激和炎癥反應(yīng)，可能是由交聯(lián)劑的殘留造成的，故生產(chǎn)商在產(chǎn)品生產(chǎn)合成工藝中應(yīng)考慮交聯(lián)劑的添加量和透明質(zhì)酸的交聯(lián)程度的合理控制，并對(duì)交聯(lián)劑及其他添加劑殘留進(jìn)行有效去除，在保持合理降解速度維持填充效果的同時(shí)，盡量減少交聯(lián)劑和添加劑對(duì)局部組織造成的不良反應(yīng)。另外，由于透明質(zhì)酸的可降解性，植入后按預(yù)估降解周期設(shè)定4個(gè)觀察期，考慮覆蓋降解開始、降解中期、降解完全整個(gè)過(guò)程，以充分研究產(chǎn)品降解吸收全過(guò)程對(duì)局部組織的影響[11]。結(jié)果表明，交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠在植入后6個(gè)月基本吸收完全，僅有部分切片可看到包囊殘留。

在全身毒性試驗(yàn)中，急性毒性采用比皮下接觸更嚴(yán)苛的接觸途徑腹腔注射，慢性毒性則模擬臨床使用行皮下注射，且選擇全身毒性暴露劑量為15mL/kg體重，為該產(chǎn)品人臨床使用劑量（按70kg成人注射10mL計(jì)算）的100倍，充分考慮由動(dòng)物外推至人體的可能性，評(píng)估該產(chǎn)品臨床使用的風(fēng)險(xiǎn)。在遺傳毒性試驗(yàn)中，由于樣品為液體，且與試驗(yàn)系統(tǒng)相容，故采用極限暴露劑量5μL/皿或5μL/mL，另外在非活化系統(tǒng)下延長(zhǎng)暴露期，從而最大程度考察樣品的遺傳毒性[12]。

根據(jù)ISO 10993-1要求，通過(guò)局部反應(yīng)、全身毒性、遺傳毒性試驗(yàn)等全面評(píng)估交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的生物相容性，證明透明質(zhì)酸鈉凝膠具有比較好的生物相容性，但要注意控制和去除生產(chǎn)過(guò)程中可能引入的交聯(lián)劑和其他添加劑殘留，避免外源性物質(zhì)對(duì)局部組織造成不良反應(yīng)，以使最終成品滿足臨床安全性應(yīng)用。后期還可以從交聯(lián)殘留定量檢測(cè)或生產(chǎn)工藝控制和生物學(xué)試驗(yàn)間的反應(yīng)聯(lián)系等開展研究，為該產(chǎn)品的研發(fā)生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[13]。