徐 峰,姚 快,曲瑞雪,牟莎莎,鄧舒元,孫珊珊*,佘躍惠,王正良

(1.江漢油田石油工程技術(shù)研究院,湖北 武漢 430000;2.非常規(guī)油氣省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢 430100;3.油氣鉆采工程湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430100;4.長(zhǎng)江大學(xué)石油工程學(xué)院,湖北 武漢 430100;5.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)能源學(xué)院,北京 100083;6.長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 荊州 434000)

稠油是世界原油資源的重要組成部分,與輕質(zhì)原油相比,其黏度高、流動(dòng)性差、開(kāi)采難度較大[1]。江漢油田普通稠油油藏大多屬難動(dòng)用儲(chǔ)量,難以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)有效的開(kāi)發(fā)。微生物提高原油采收率(microbial enhanced oil recovery,MEOR)技術(shù)是一種環(huán)境友好、成本較低、高效、可持續(xù)作用的方法[2]。油藏是一個(gè)寡營(yíng)養(yǎng)的極端環(huán)境,通過(guò)向油藏中注入碳源、氮源及磷源等有機(jī)或無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)激活某些內(nèi)源采油功能菌[3-4],利用內(nèi)源微生物的繁殖產(chǎn)生代謝物(如小分子有機(jī)酸、氣體、生物表面活性劑、生物聚合物等),達(dá)到乳化原油、降解原油組分、改變儲(chǔ)層物性等目的,進(jìn)而提高采收率[5-6]。由于油藏微生物的種類(lèi)繁多,針對(duì)性激活內(nèi)源采油功能菌、維持微生物高效可持續(xù)作用原油是MEOR技術(shù)的關(guān)鍵。目前,針對(duì)稠油油藏的微生物生態(tài)學(xué)研究是解決該關(guān)鍵問(wèn)題的基礎(chǔ)。鑒于此,作者通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)江漢油田稠油油藏4個(gè)中高溫高礦化度區(qū)塊采出液中的細(xì)菌和古菌群落多樣性進(jìn)行研究,為后續(xù)激活中高溫油藏內(nèi)源微生物提高原油采收率技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

采出液取自江漢油田的4個(gè)中高溫區(qū)塊,分別標(biāo)記為H2-12、Z-2X、YP-9、W-1X;其中,H2-12和Z-2X取自60～70 ℃油藏,YP-9和W-1X取自50 ℃油藏。將采出液樣品放入?yún)捬跗恐?置于實(shí)驗(yàn)室-4 ℃冰箱中冷藏保存,防止與空氣接觸。

1.2 方法

1.2.1 采出液的離子組成分析

1.2.2 DNA提取與檢測(cè)

用無(wú)菌磷酸緩沖液沖洗樣品(去除采出液中的原油組分),抽濾,收集樣品中的菌體,提取 DNA,采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其中細(xì)菌和古菌的群落組成進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)后樣品置于-20 ℃下保存[8],進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增[9]

采用引物對(duì) 338F、806R對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;采用引物對(duì)519F(5′-CAGCCGCCGCGGTAA-3′)、915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)對(duì)古菌16S rRNA基因V4-V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為:Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL,5×Reaction Buffer 5 μL,dNTP(10 mmol·L-1)2 μL,模板 DNA 2 μL,正向引物(10 μmol·L-1)1 μL,反向引物(10 μmol·L-1)1 μL,水 8.75 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,保持4 ℃,30個(gè)循環(huán)。前引物中的barcode是7個(gè)堿基的寡核苷酸序列,用來(lái)區(qū)分同一文庫(kù)中的不同樣品。PCR 采用 NEB Q5 DNA 高保真聚合酶,用 2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳;切取目的片段,并用 Axygen 凝膠回收試劑盒回收。

在Microplate Reader(BioTek,FLx800)上利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量,然后將每個(gè)樣品按照其所需的數(shù)量進(jìn)行混合。

1.2.4 文庫(kù)構(gòu)建

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建文庫(kù)。首先利用試劑盒中的EndRepair Mix2將DNA 5′端突出的堿基切除,然后將3′端缺失的堿基補(bǔ)齊,同時(shí)在5′端加上1個(gè)磷酸基團(tuán),進(jìn)行末端修復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 采出液的離子組成

4種樣品的離子組成如表1所示。

表1 4種樣品的離子組成/(mg·L-1)

2.2 細(xì)菌群落組成分析

2.2.1 物種分類(lèi)學(xué)注釋

采用QIIME2的classify-sklearn算法[10](https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier),具體步驟如下:對(duì)于每個(gè)ASV(擴(kuò)散序列變異)的特征序列或每個(gè)OTU(操作分類(lèi)單元)的代表序列,在QIIME2軟件中使用默認(rèn)參數(shù),使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類(lèi)器進(jìn)行物種注釋,即與參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行打分判定。通過(guò)16S rDNA測(cè)序,對(duì)4種樣品中的細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)學(xué)統(tǒng)計(jì)及多樣性揭示,物種分類(lèi)學(xué)注釋結(jié)果如圖1所示。

圖1 4種樣品中細(xì)菌的分類(lèi)學(xué)注釋Fig.1 Taxonomic notes on bacteria in four samples

從圖1可知,H2-12樣品中細(xì)菌種類(lèi)最多,其次是W-1X樣品,Z-2X樣品中細(xì)菌種類(lèi)最少,不足H2-12樣品中的一半。

2.2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指在一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)或者特定區(qū)域內(nèi)反映物種豐度和均勻度的綜合指標(biāo)[11]。4種樣品中細(xì)菌的稀疏曲線(xiàn)如圖 2 所示。

從圖2可知,隨著測(cè)序深度的增加,4種樣品中細(xì)菌群落的ASV/OTU總數(shù)均先增加后逐漸趨于穩(wěn)定,說(shuō)明測(cè)序深度合適、取樣合理。4種樣品中細(xì)菌群落的Alpha 多樣性指數(shù)如表2所示。

圖2 4種樣品中細(xì)菌的稀疏曲線(xiàn)Fig.2 Sparse curves of bacteria in four samples

表2 4種樣品中細(xì)菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

Chao1和Observed species指數(shù)表征豐度,Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性[12]。從表2可知,H2-12樣品的Chao1、Shannon和Observed species指數(shù)均最高,分別為655.106、5.510 76和652.1,其Simpson指數(shù)為 0.927 947,僅次于YP-9樣品的Simpson指數(shù)(0.938 390),表明H2-12樣品的物種豐度和多樣性均最高;Z-2X樣品的Chao1、Shannon和Observed species指數(shù)均最低,表明Z-2X樣品的物種豐度和多樣性均最低,這與物種分類(lèi)學(xué)注釋結(jié)果一致。

2.2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性聚類(lèi)分析多采用層次聚類(lèi)(hierarchical clustering)法,以等級(jí)樹(shù)的形式展示樣本間的相似度,通過(guò)聚類(lèi)樹(shù)的分枝長(zhǎng)度衡量聚類(lèi)效果。聚類(lèi)分析可以采用任何距離評(píng)價(jià)樣本之間的相似度。 4種樣品中細(xì)菌群落在屬水平上的層次聚類(lèi)分析結(jié)果如圖 3所示。

從圖3可知,YP-9和H2-12樣品的距離最近,且同為一支,說(shuō)明YP-9和H2-12樣品中細(xì)菌的微生物群落最為相似;W-1X 樣品屬于單獨(dú)一支,離其它樣品較遠(yuǎn),說(shuō)明W-1X樣品與其它樣品中細(xì)菌的微生物群落差距較大。

圖 3 4種樣品中細(xì)菌群落在屬水平上的層次聚類(lèi)分析Fig.3 Hierarchical clustering analysis of bacterial communities in four samples at genus level

2.2.4 物種組成分析

高通量測(cè)試結(jié)果通過(guò)BLAST比對(duì)后,將4種樣品的細(xì)菌群落組成在門(mén)水平和屬水平上進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖4所示。

圖 4 4種樣品在門(mén)水平(a)和屬水平(b)的細(xì)菌群落組成Fig.4 Bacterial community composition of four samples at phylum level(a) and genus level(b)

從圖4a可知,在門(mén)水平上,Proteobacteria在4種樣品中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì),占比在53%～96%之間。研究[13-14]發(fā)現(xiàn),Proteobacteria在自然水體、人工水體中均占比較大,在污水處理及氮磷形態(tài)轉(zhuǎn)換方面具有十分重要的作用 。H2-12 和 Z-2X 樣品中還有較多的Firmicutes(33%、42%)。

從圖4b可知,在屬水平上,4種樣品的細(xì)菌群落主要由Pseudomonas(9%～47%)、Thauera(0%～52%)、Halobacillus(0%～27%)、Marinobacter(0%～30%)、Acinetobacter(1%～12%)、Hydrogenophilus(0%～13%)、Rehaibacterium(0%～10%)、Oligoflexus(0%～4%)、Tepidiphilus(0%～5%)和Methylobacterium(0%～4%)組成。

其中,H2-12和YP-9樣品中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群為Pseudomonas(29%、47%)、Halobacillus(27%、8%)和Acinetobacter(12%、7%)。Pseudomonas是革蘭氏陰性好氧棒狀細(xì)菌,能從大多數(shù)環(huán)境中分離出來(lái),可產(chǎn)鼠李糖脂型表面活性劑,具有降解石油烴、驅(qū)油、修復(fù)烴類(lèi)污染、降黏等作用。馬鑫等[15]研究發(fā)現(xiàn),Pseudomonasaeruginosa發(fā)酵液在模擬實(shí)驗(yàn)中的驅(qū)油率較水驅(qū)提高了33.5%。Halobacillus屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae),分離自鹽湖、鹽土、海洋太陽(yáng)能鹽場(chǎng)等高鹽環(huán)境中,屬嗜鹽菌。Halobacillusspp.在石油烴類(lèi)化合物的生物降解中具有重要作用[16]。Acinetobacter具有代謝多樣性,能降解己內(nèi)酰胺、除草劑、有機(jī)磷農(nóng)藥和多種石油烴組分等,可產(chǎn)鼠李糖脂型表面活性劑,也可進(jìn)行反硝化和氨氧化作用。

W-1X樣品中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群為T(mén)hauera(52%)、Hydrogenophilus(13%)和Rehaibacterium(10%)。Thauera屬于脫氮菌,在反硝化系統(tǒng)運(yùn)行 51 d以上時(shí),Thauera的相對(duì)豐度在 60%以上[17-18]。

Z-2X樣品中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群為Pseudomonas(13%)和Marinobacter(30%)。Marinobacter是目前國(guó)外報(bào)道較多的一類(lèi)能夠耐高鹽環(huán)境的反硝化微生物,具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[19-21]。

2.2.5 代謝通路分析

微生物生態(tài)學(xué)研究也需要關(guān)注菌群所具備的功能潛能,了解檢測(cè)樣本中菌群功能潛能的概況,能最大化擴(kuò)增子測(cè)序性?xún)r(jià)比高的優(yōu)勢(shì),此外,分析結(jié)果或許還能幫助指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)(如宏基因組測(cè)序)。獲得的功能單元可以依據(jù)代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)和一定的計(jì)算方法獲得代謝通路的豐度。4種樣品中的細(xì)菌代謝通路主要分為生物合成、降解/利用/同化、脫毒、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、聚糖途徑、高分子修飾和代謝簇。通過(guò)對(duì)4種樣品中細(xì)菌群落的代謝通路分析可知,生物合成中豐度最高的是輔因子、輔基、電子載體、維生素生物合成和氨基酸生物合成;降解/利用/同化中豐度最高的是芳香族化合物降解、碳水化合物降解及核苷和核苷酸降解;前體代謝物和能量的產(chǎn)生中豐度最高的是TCA循環(huán)和發(fā)酵作用。

2.3 古菌群落組成分析

2.3.1 物種分類(lèi)學(xué)注釋

通過(guò)16S rDNA測(cè)序,對(duì)4種樣品中的古菌進(jìn)行分類(lèi)學(xué)統(tǒng)計(jì)及多樣性揭示,物種分類(lèi)學(xué)注釋結(jié)果如圖5所示。

圖5 4種樣品中古菌的分類(lèi)學(xué)注釋Fig.5 Taxonomic notes on archaea in four samples

從圖5可知,H2-12樣品中古菌種類(lèi)最多,這與細(xì)菌的物種分類(lèi)學(xué)注釋結(jié)果一致,其次是YP-9樣品,W-1X樣品中古菌種類(lèi)最少。4種樣品中古菌種類(lèi)均高于細(xì)菌種類(lèi),表明樣品中古菌種類(lèi)很豐富。

2.3.2 Alpha多樣性分析

4種樣品中古菌的稀疏曲線(xiàn)如圖6所示。

圖6 4種樣品中古菌的稀疏曲線(xiàn)Fig.6 Sparse curve of archaea in four samples

從圖6可知,隨著測(cè)序深度的增加,4種樣品中古菌群落的ASV/OTU總數(shù)均先增加后逐漸趨于穩(wěn)定,說(shuō)明測(cè)序深度合適,取樣數(shù)量合理,取樣數(shù)量更多只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU。

4種樣品中古菌群落的Alpha多樣性指數(shù)如表3所示。

表3 4種樣品中古菌群落的Alpha 多樣性指數(shù)

從表3可知,H2-12樣品的物種豐度最高,Chao1和Observed species指數(shù)分別為823.511和761.7,這與物種分類(lèi)學(xué)注釋結(jié)果一致;YP-9樣品的物種多樣性最高,Shannon和Simpson指數(shù)分別為5.127 64和0.917 360;W-1X樣品的物種豐度和多樣性均最低。根據(jù)Chao1和Observed species指數(shù)可知,4種樣品中古菌群落的豐度均高于細(xì)菌群落。

2.3.3 Beta多樣性分析

4種樣品中古菌群落在屬水平上的層次聚類(lèi)分析結(jié)果如圖7所示。

圖7 4種樣品中古菌群落在屬水平上的層次聚類(lèi)分析Fig.7 Hierarchical clustering analysis of archaea communities in four samples at genus level

從圖7可知,Z-2X和H2-12樣品的距離最近,且同為一支,說(shuō)明Z-2X和H2-12樣品中古菌的微生物群落最為相似;W-1X樣品屬于單獨(dú)一支,離其它樣品較遠(yuǎn),說(shuō)明W-1X 樣品與其它樣品中古菌的微生物群落差距較大。

2.3.4 物種組成分析

4種樣品在門(mén)水平和屬水平的古菌群落組成如圖8所示。

圖8 4種樣品在門(mén)水平(a)和屬水平(b)的古菌群落組成Fig.8 Archaea community composition of four samples at phylum level(a) and genus level(b)

從圖8a可知,在門(mén)水平上,4種樣品的古菌群落主要以Euryarchaeota(29%～96%)為主;此外,H2-12樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)還有Crenarchaeota(11%),Z-2X樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)還有Thaumarchaeota(5%)。

從圖8b可知,在屬水平上,4種樣品的古菌群落主要由Halogeometricum(0%～69%)、Methanobacterium(0%～36%)、Methanothermobacter(0%～22%)、Salinarchaeum(0%～17%)、Halogranum(0%～9%)、Nitrososphaeraceae(0%～5%)、Methanohalophilus(0%～5%)、Methanohalobium(0%～4%)、Halodesulfurarchaeum(0%～1%)和Halapricum(0%～1%)組成。

W-1X樣品中古菌的優(yōu)勢(shì)菌群主要為Salinarchaeum(17%)、Halodesulfurarchaeum(1%)和Halapricum(1%)。Salinarchaeum和Halapricum均為嗜鹽菌屬,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,是一種較強(qiáng)的SRB抑制劑。Halapricum由革蘭氏染色陰性的球狀或卵球形多形性細(xì)胞組成,在含2.5～5.1 mol·L-1NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。Halodesulfurarchaeum隸屬于嗜鹽菌綱,由專(zhuān)性厭氧、極端嗜鹽的廣古菌門(mén)組成,以單質(zhì)硫、二甲基亞砜或硫代硫酸鹽為電子受體,通過(guò) H2或甲酸氧化生長(zhǎng)。

2.3.5 代謝通路分析

通過(guò)對(duì)4種樣品中古菌群落的代謝通路分析可知,生物合成中豐度最高的是核苷和核苷酸生物合成,其次是氨基酸生物合成;降解/利用/同化中豐度最高的是C1化合物利用與同化;前體代謝物和能量的產(chǎn)生中豐度最高的是TCA循環(huán)和發(fā)酵作用,這與細(xì)菌群落中的前體代謝物和能量的產(chǎn)生豐度是一致的。

3 結(jié)論

利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)江漢油田普通稠油油藏的4個(gè)采出液樣品中的細(xì)菌和古菌群落組成進(jìn)行了多樣性分析。物種分類(lèi)學(xué)注釋結(jié)果表明,H2-12樣品中的微生物種類(lèi)最多,4種樣品中古菌種類(lèi)均高于細(xì)菌種類(lèi),表明樣品中古菌種類(lèi)很豐富。Alpha多樣性分析結(jié)果表明,4種樣品中古菌群落的豐度均高于細(xì)菌群落。在門(mén)水平上,細(xì)菌群落主要以Proteobacteria(53%～96%)為主;古菌群落主要以Euryarchaeota(29%～96%)為主。在屬水平上,細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群主要為Pseudomonas(9%～47%)、Thauera(0%～52%)、Halobacillus(0%～27%)和Marinobacter(0%～30%);古菌的優(yōu)勢(shì)菌群主要為Halogeometricum、Methanobacterium和Methanothermobacter。細(xì)菌群落組成分析可知,4種樣品中的內(nèi)源微生物群落均具有降黏和脫氮的性能,表明江漢油田內(nèi)源微生物具有降黏和脫氮的巨大潛力,可通過(guò)不同培養(yǎng)基富集篩選高效的降黏和脫氮菌株,進(jìn)而大大提高江漢油田的原油采收率。