苗鳴殊,孫鴻妍,張曉天,賀思思,任浩文,楊 梅,朱洪權(quán)*

(1.吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院 檢驗科,吉林 長春130022;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,病理生理系,吉林 長春 130021)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,2020年全球癌癥統(tǒng)計報告表明,宮頸癌的全球新發(fā)病例為60.4萬例,死亡人數(shù)達(dá)34.1萬人[1]。近年來,我國女性宮頸癌的發(fā)病率和死亡率也逐年增高,同時發(fā)病人群趨于年輕化[2]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌的主要原因,其中以高危型HPV16和HPV18為主[3]。宮頸癌具有早期無自覺癥狀、發(fā)病隱匿及易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特點,患者出現(xiàn)臨床癥狀時大多數(shù)患者已錯過最佳治療時期,因此療效和預(yù)后較差。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者死亡的最主要的原因之一,許多研究表明在早期就可能出現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。目前預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)有腫瘤直徑大小、國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期及浸潤深度等,然而該類指標(biāo)都是術(shù)后獲取的信息,對于高危病人的及時診斷和病情的精準(zhǔn)評估存在限制[4]。因此,尋找一種可早期反應(yīng)患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物是十分重要的。目前,新興的液體活檢中對循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的檢測可早期反映轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、評估預(yù)后、判斷療效、指導(dǎo)個性化治療,具有豐富的臨床應(yīng)用價值[5]。

1 CTC生物學(xué)特性

CTC是指自發(fā)或因診療等因素從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移病灶脫落,釋放入外周血液的腫瘤細(xì)胞[6]。在循環(huán)中逃避免疫監(jiān)視等影響的CTC向繼發(fā)性部位外滲,最終導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移性病變[7]。大部分的CTC通常由于物理剪切力、細(xì)胞死亡、免疫監(jiān)視、缺乏生長因子等綜合因素在血液中很快被清除,只有少數(shù)CTC處于休眠狀態(tài)而存活[8]。因此,CTC具有稀缺性。此外,CTC以單個細(xì)胞或細(xì)胞簇的形式存在,其中CTC簇稱為循環(huán)腫瘤微栓子(Circulating Tumor Microemboli,CTM),CTM的數(shù)量相對于CTC更為稀少,但CTM的轉(zhuǎn)移能力比單個CTC高23～50倍[9],且持續(xù)存在的可能性更大,可作為提示患者預(yù)后不良的指標(biāo)[10]。CTC具有上皮-間充質(zhì)可塑性,可從外周血中分離出上皮、間充質(zhì)或雙雜合上皮/間充質(zhì)表型[11]。其中雙雜合上皮/間充質(zhì)表型的CTC成簇能力高、存活時間長且有較強的成瘤能力[12]。CTC先后通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-epithelial transition,MET)完成腫瘤的轉(zhuǎn)移和播散,EMT過程使CTC的侵襲能力增加并且促進(jìn)CTC的內(nèi)滲,有助于其在循環(huán)過程中存活[13]。MET這一過程使CTC的上皮特性和遷移能力喪失,從而在遠(yuǎn)處器官定植[14]。

2 CTC的檢測方法

因腫瘤患者外周血中CTC含量極低,每106～107個白細(xì)胞中可能只存在1個CTC,同時外周血中的大量血細(xì)胞還會干擾CTC的檢測,因此首先要通過富集提高檢測效率,繼而對富集的細(xì)胞進(jìn)行下一步的檢測和鑒定[15]。CTC的富集主要包括基于物理學(xué)特性和基于生物學(xué)特性的兩種富集方法,基于物理特性的富集方法是根據(jù)CTC與外周血細(xì)胞之間的物理特性差異進(jìn)行富集,包括尺寸[16]、電介性、慣性、密度及變形能力[17]等,但是這類方法的靈敏度和特異性較低[18]?；谏锾匦缘母患椒òò邢蛏掀ぜ?xì)胞黏附分子、細(xì)胞角蛋白等腫瘤細(xì)胞上的標(biāo)志物進(jìn)行的陽性選擇和靶向具有CD45等常見白細(xì)胞生物標(biāo)志物以去除其他血細(xì)胞的陰性選擇[19]。這種基于抗原-抗體識別的富集方法特異性較高,是分離富集CTC的常用方法。CTC體外檢測鑒定方法主要分為細(xì)胞計數(shù)法和核酸檢測法兩種,其中細(xì)胞計數(shù)法包括流式細(xì)胞技術(shù)、免疫熒光染色法[20]及免疫熒光原位雜交技術(shù)等,核酸檢測法包括聚合酶鏈反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等。此外,目前新興的CTC體內(nèi)檢測方法包括在體熒光流式細(xì)胞術(shù)和在體光聲流式細(xì)胞術(shù)等,它們實現(xiàn)了非侵入性的實時監(jiān)測CTC,是體內(nèi)定量和分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞的新技術(shù)[21]。由于CTC的稀缺性和異質(zhì)性,導(dǎo)致對CTC的檢測仍存在一定困難,未來發(fā)展更高靈敏度和特異性的檢測技術(shù)可以進(jìn)一步實現(xiàn)CTC的精準(zhǔn)捕獲。

3 CTC檢測在宮頸癌中的應(yīng)用

3.1 發(fā)現(xiàn)早期微轉(zhuǎn)移

CTC是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間重要的樞紐,保留著與原發(fā)腫瘤相似的生物學(xué)特性。研究表明CTC檢測可以輔助診斷腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。LAW等[22]研究了一種基于生物芯片的微流控裝置檢測宮頸癌患者體內(nèi)的CTC,在對術(shù)后患者進(jìn)行隨訪時觀察到患者外周血中人表皮生長因子受體2(HER2)的表達(dá),但此時沒有臨床表現(xiàn),肺部PET-CT掃描診斷也不明確。在初步診斷12個月時,才產(chǎn)生了宮頸癌轉(zhuǎn)移的組織學(xué)證據(jù)。因此,對患者進(jìn)行CTC檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。PAN等[23]研究了90例I-IIA期宮頸癌患者的CTC表型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)上皮型CTC占38.89%,間充質(zhì)型CTC占23.33%,混合型CTC占14.44%,除此之外,間充質(zhì)CTC在FIGO II期、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴血管受累的患者中更常見,因此,具有間充質(zhì)表型的CTC與I-IIA期宮頸癌的盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管浸潤密切相關(guān),檢測CTC表型有助于宮頸癌微轉(zhuǎn)移的早期診斷和病情評估。HR-HPV E6/E7是人乳頭瘤病毒的早期轉(zhuǎn)錄基因,可作為檢測宮頸癌患者外周血中CTC的獨特生物標(biāo)志物。WEISMANN等[24]對宮頸癌患者外周血中CTC的HR-HPV E6/E7致癌基因進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示表達(dá)HR-HPV E6/E7致癌基因的CTC是宮頸癌患者早期微轉(zhuǎn)移的特異性基因標(biāo)志,有助于提示早期微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

3.2 判斷患者預(yù)后情況

CTC的存在反映了腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能,而腫瘤轉(zhuǎn)移與患者較低的生存率相關(guān),因此對CTC計數(shù)有助于判斷患者的預(yù)后情況。DU等[25]選取了107例經(jīng)過放療或同步順鉑化療之后的宮頸癌患者,探究了CTC水平與無進(jìn)展生存期(PFS)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示其中有86名患者CTC陽性且中位PFS為43.1個月,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)每3.2 ml血液中檢測到≥1個CTC的患者的PFS短于未檢測到CTC的患者的PFS,多因素分析表明經(jīng)過放療或同步順鉑化療后的宮頸癌患者的CTC計數(shù)是預(yù)后評估的獨立預(yù)測因素。因此,宮頸癌患者經(jīng)過治療后體內(nèi)的CTC水平是獨立的預(yù)后指標(biāo)。鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)是宮頸癌診斷、預(yù)后評估過程中使用廣泛的腫瘤標(biāo)志物,SSC-Ag與CTC聯(lián)合檢測可以達(dá)到更好的預(yù)后評估效果。WEN等[26]研究了治療前CTC和SSC-Ag水平與晚期宮頸癌患者生存率之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,每3.2 ml血清中CTC水平<3個和每3.2 ml血清中CTC水平≥3個的患者兩年DFS率分別為71.3%和40.6%,因此得出治療前高水平的CTC與較差的DFS顯著相關(guān)的結(jié)論。此外,研究還表明CTC聯(lián)合SCC-Ag的檢測結(jié)果與局部晚期宮頸癌患者的DFS相關(guān),而且建立了一種CTC和SCC-Ag聯(lián)合應(yīng)用預(yù)測宮頸癌患者疾病進(jìn)展的風(fēng)險模型,該模型是計算每個病例的CTC評分和SCC-Ag評分之和得出新的聯(lián)合風(fēng)險評分,其預(yù)測患者疾病進(jìn)展的效能與單一生物標(biāo)志物的預(yù)測效能相比顯著提高,這一模型可能有助于改善宮頸癌患者的預(yù)后分層,以便準(zhǔn)確地判斷預(yù)后。

3.3 動態(tài)監(jiān)測疾病進(jìn)展及指導(dǎo)治療

監(jiān)測宮頸癌患者的疾病進(jìn)展和指導(dǎo)個性化治療是治療過程中關(guān)鍵的環(huán)節(jié),CTC的檢測不僅可以幫助監(jiān)測疾病進(jìn)展而且還有助于判斷藥物的療效。TEWARI等[27]通過動態(tài)監(jiān)測宮頸癌患者外周血CTC的水平進(jìn)而探究了貝伐單抗治療對晚期宮頸癌患者的療效。研究發(fā)現(xiàn),治療前外周血CTC的中位數(shù)為7CTC/7.5 ml全血,治療36天后外周血CTC中位數(shù)下降至4CTC/7.5 ml全血,這表明了CTC的檢測可以對治療過程中的宮頸癌患者進(jìn)行實時監(jiān)測和療效的動態(tài)評估。此外,CTC檢測還可以幫助選擇治療藥物,在接受順鉑-紫杉醇化療的治療前CTC較高的女性患者中,同步使用和不使用貝伐單抗的患者的中位PFS分別為14.6個月和6.4個月,所以治療前CTC數(shù)量較多且同時接受順鉑-紫杉醇化療和貝伐珠單抗治療的患者PFS顯著改善。因此,CTC的檢測不僅可以動態(tài)監(jiān)測患者疾病的進(jìn)展還有助于對治療藥物的選擇。此外,尋找一種靈敏度較高的檢測方法對實時動態(tài)監(jiān)測患者的疾病進(jìn)展是十分重要的。PFITZNER等[28]建立了一種基于HPV癌基因轉(zhuǎn)錄物的敏感測定法Digital-Direct-RT-PCR,它是將Ficoll分離、細(xì)胞固定和一步RT-PCR以低通量數(shù)字PCR形式結(jié)合,使得可以直接分析和檢測單個CTC而不需要分離RNA。該方法可以在高背景的HPV陰性細(xì)胞中分離出數(shù)量少的HPV16/18-E6表達(dá)的細(xì)胞,這種靈敏度較高的檢測方法可以更好地實現(xiàn)對宮頸癌患者體內(nèi)的CTC水平進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測,從而實現(xiàn)對患者的個性化治療。

4 小結(jié)

宮頸癌作為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著女性的生殖健康和生活質(zhì)量,早期發(fā)現(xiàn)和診斷是患者良好預(yù)后的關(guān)鍵。目前臨床上檢測和診斷宮頸癌的主要方法包括電子計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)等影像學(xué)檢查,薄層液基細(xì)胞檢測(TCT)、組織活檢等病理學(xué)檢查,但是缺少與宮頸癌相關(guān)的高靈敏度和高特異性的腫瘤標(biāo)志物。液體活檢作為一種新興的檢測技術(shù),它包括CTC、循環(huán)腫瘤DNA和外泌體等檢測。其中CTC是液體活檢的基石之一,其檢測具有微創(chuàng)、實時、便捷、靈敏的優(yōu)點,是一種十分有前景的生物標(biāo)志物。CTC已被證明與肺癌[29]、乳腺癌[30]、結(jié)直腸癌[31]及胰腺癌[32]等其他許多實體腫瘤的早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后評估相關(guān),雖然CTC的檢測在婦科惡性腫瘤方面仍處于探索階段,但是現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血中CTC的檢測也具有豐富的臨床應(yīng)用價值,包括在早期診斷微轉(zhuǎn)移、判斷患者的預(yù)后情況、動態(tài)監(jiān)測和評估患者的療效等方面。未來將CTC的體外培養(yǎng)和CTC的靶向治療與宮頸癌相結(jié)合,可能會使CTC在宮頸癌的診治中具有更加廣泛的應(yīng)用前景。