高 遠(yuǎn) 李 冀 韓東衛(wèi) 周夢(mèng)丹

(1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,貴陽(yáng),550025; 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040; 3 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科,貴陽(yáng),550001)

“冬病夏治”方源于張璐《張氏醫(yī)通》中“冷哮方”,中國(guó)針灸學(xué)會(huì)制定的《“冬病夏治穴位貼敷”療法臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見(jiàn)(草案)》指出:該方以白芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛、生姜為基本處方,現(xiàn)代臨床在此基礎(chǔ)上進(jìn)行加減[1]。該方以白芥子、延胡索為君藥,其中白芥子作用尤其特殊。元代朱震亨曰:“痰在脅下,非白芥子不能達(dá)?！眳前矘I(yè)在《理瀹駢文》中強(qiáng)調(diào)“白芥子外敷,雖熱勿揭,正是拔動(dòng)病根”,可見(jiàn)白芥子深入、長(zhǎng)效的獨(dú)特作用。透皮試驗(yàn)表明,白芥子能夠有效促進(jìn)方中其他藥物經(jīng)皮滲透,起到透皮吸收促進(jìn)劑的作用[2-3]。以上古代醫(yī)家的經(jīng)驗(yàn)、現(xiàn)代研究均提示,該方中白芥子不但有藥理作用,還可能有一定的附加藥物作用。而白芥子的獨(dú)特作用是否會(huì)影響方中其他藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),起到整體增效作用,需要對(duì)方中主要藥物的分布情況進(jìn)一步研究。

中藥經(jīng)皮吸收后,還需要經(jīng)過(guò)體內(nèi)分布、代謝、排泄的過(guò)程,且一直處于動(dòng)態(tài)變化中,產(chǎn)生綜合性治療作用[4]。藥代動(dòng)力學(xué)-藥效動(dòng)力學(xué)(Pharmacokinetics-pharmacodynamics,PK-PD)模型是結(jié)合藥物體內(nèi)行為和藥效作用,同時(shí)闡述劑量、時(shí)間、效應(yīng)三者之間關(guān)系的體內(nèi)研究方法[5-6]。本文以PK-PD數(shù)學(xué)擬合的方式,將“肺俞”穴皮下部位建立為抽象“房室模型”,描述該部位藥效隨著劑量變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律。通過(guò)構(gòu)建虛擬的PK-PD“房室”,比較白芥子配伍前后,方中君藥延胡索主要成分在穴位局部的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,探討其配伍的獨(dú)特作用,為探索經(jīng)典方劑立法的科學(xué)內(nèi)涵,找尋外用復(fù)方配伍規(guī)律提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 新西蘭家兔24只,14～21周齡,體質(zhì)量1.5～2.0 kg,雌雄各半,購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SYXK(黑)2021-005,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn),審批號(hào):2021042201],飼養(yǎng)條件為溫度20～25 ℃、濕度(45±5)%、12 h光照,飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模,取材前禁食24 h。

1.1.2 藥物 白芥子飲片、延胡索飲片、甘遂飲片、細(xì)辛飲片、生姜飲片購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,經(jīng)鑒定為地道藥材,粉碎為細(xì)粉,臨用前配制。

1.1.3 試劑與儀器 弗氏完全佐劑(Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):SLCC73365);戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich公司,美國(guó),批號(hào):貨號(hào):F200550);兔IgE酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司,貨號(hào):SP10179);液相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀(沃特世科技有限公司,美國(guó),型號(hào):UPLC-TOD型H-Class e2695);色譜柱(沃特世科技有限公司,美國(guó),型號(hào):AC.UPLC HSS T3 2.1 mm×75 mm 1.8 μm);雙通道微透析注射泵(CMA公司,瑞士,型號(hào):CMA 402 Syringe Pump);4 mm微透析探針(CMA公司,瑞士,型號(hào):CMA20Elite);雙通道灌注器(CMA公司,瑞士,型號(hào):CMA 1.0 mL);全功能酶標(biāo)儀(伯騰儀器有限公司,美國(guó),型號(hào):Synergy H1);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf股份公司,德國(guó),型號(hào):5424R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 以1.2 mL/kg劑量注射10%卵蛋白溶液,作為首次致敏,14 d后置于一密閉容器內(nèi),1%卵蛋白、弗氏完全佐劑生理鹽水溶液霧化激發(fā)至出現(xiàn)腹肌抽搐、煩躁、唇鼻發(fā)紺、二便失禁等現(xiàn)象,連續(xù)7 d則造模完成。隨機(jī)分為延胡索單方組、缺白芥子組、全方組,每組8只。

1.2.2 穴位貼敷干預(yù)方法 按處方比例取白芥子、細(xì)辛、甘遂、延胡索、麻黃、黃芩(2∶2∶1∶2∶1∶1)的藥材細(xì)粉共10 g,混合均勻,姜汁調(diào)增加黏性,成2 cm×2 cm大小的穴位貼,取家兔背部“肺俞”穴位(所選穴位為《張氏醫(yī)通》記載),于模型家兔背部第3胸椎棘突下旁開(kāi)1.5 cm處貼敷給藥。延胡索單方組給予處方劑量延胡索(0.22 g)進(jìn)行穴位貼敷;全方組按照處方穴位貼敷給藥;缺白芥子組按照處方排除白芥子進(jìn)行穴位貼敷給藥。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)延胡索乙素關(guān)節(jié)腔微透析采集方法的建立:CMA20微透析探針植入模型家兔背部“肺俞”穴皮下,2 μL/min流速,持續(xù)收集30 min的透析液作為該時(shí)間點(diǎn)的到的樣本。于給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14 h(14 h內(nèi)透析探針具有良好的回收率)收集透析液,得到的透析液加入150 μL氯仿溶液,離心取下層溶液120 μL,蒸干氯仿后用甲醇50 μL復(fù)溶待檢測(cè)。2)延胡索乙素超高效液相色譜法的建立:a.色譜條件,色譜柱ACQUITY UPLC HSS(2.1 mm×75 mm 1.8 μm);流動(dòng)相甲醇-0.1%甲酸水(62∶38三乙醇胺至pH=6);體積流量0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;進(jìn)樣體積2 μL。b.質(zhì)譜條件,離子源為電噴霧離子;毛細(xì)管電壓2.8 kV;去溶劑氣溫度350 ℃;氮?dú)饬魉?50 L/h;撞擊能量40 eV;母離子→子離子對(duì)質(zhì)荷比(m/z)356.59→191.44。c.線性范圍測(cè)定,精密稱取延胡索乙素對(duì)照品2.5 mg,置于25 mL容量瓶中,甲醇定容,得到對(duì)照品母液,甲醇稀釋制備成100,200,400,1 000,2 000,10 000 ng/mL系列對(duì)照品溶液。d.專屬性試驗(yàn),制備空白透析液,微孔濾膜過(guò)濾。e.準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn),精密稱取100、400、10 000 ng/mL對(duì)照品溶液,平行進(jìn)樣6次。f.加樣會(huì)收率試驗(yàn),精密稱取延胡索乙素對(duì)照品,配制成100、400、10 000 ng/mL溶液,每個(gè)質(zhì)量濃度3份,測(cè)得平均加樣回收率。3)藥效學(xué)樣本采集及檢測(cè):2%的戊巴比妥鈉麻醉模型動(dòng)物,左側(cè)頸靜脈,插管后分別于給藥后0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14 h(與PK-PD取樣時(shí)間相對(duì)應(yīng))頸靜脈處采血1 mL,每次采血后及時(shí)補(bǔ)充1 mL生理鹽水和1 mL肝素鈉。以3 000 r/min(離心半徑60 cm)離心血樣20 min,收集上清液,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定IgE含量。

1.3 PK-PD模型擬合及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,組間比較采用兩兩配對(duì)t檢驗(yàn)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WinNonlin 5.2軟件進(jìn)行智能化分析,以赤池信息量準(zhǔn)則(Akaike Information Criterion,AIC)值越小、殘差平方和值越小、擬合度值越大則模型擬合越好的原則判斷房室模型。以延胡索乙素濃度為藥動(dòng)學(xué)指標(biāo),為PK-PD數(shù)學(xué)模型提供驅(qū)動(dòng)因素PK input,以IgE的抑制率為PK-PD模型提供計(jì)算藥效替代指標(biāo)PD endpoint,繪制“濃度-時(shí)間-效應(yīng)”三維曲線圖。

WinNonlin 5.2軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù),測(cè)定達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、藥峰濃度(Cmax)、藥時(shí)曲線下面積(AUC0-t)、平均滯留時(shí)間。

得到的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),以時(shí)間-效應(yīng)室濃度繪制到時(shí)間-PK關(guān)系;得到的藥效學(xué)參數(shù),以時(shí)間-效應(yīng)繪制時(shí)間-PD關(guān)系,進(jìn)行PK-PD模型擬合,獲得效應(yīng)室藥物濃度、對(duì)應(yīng)時(shí)間、藥效三者(C-t-E)關(guān)系圖、抑制率-藥物濃度的逆時(shí)針曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 延胡索乙素測(cè)定方法建立的結(jié)果 得到回歸方程Y=9 567.4X-5 422.4(R=0.999 87),在1～100 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;色譜峰型良好,出峰位置無(wú)干擾,專屬性良好;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分別為1.57%、1.05%、0.95%,表明儀器精密度良好;平均加樣回收率為98.59%,RSD為1.22%。

2.2 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果 結(jié)果最匹配的藥動(dòng)學(xué)模型為血管外給藥的一房室模型。與缺白芥子組比較,全方組達(dá)峰時(shí)間(Tmax)更短(P<0.01),藥峰濃度(Cmax)更高(P<0.01)、AUC0-t增大(P<0.01)、平均滯留時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)。見(jiàn)表1。與缺白芥子組比較,全方組藥物在血液中出現(xiàn)更早,消退更緩慢。見(jiàn)圖1。

表1 穴位給藥后各組延胡索乙素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖1 白芥子配伍前后模型家兔體內(nèi)藥-時(shí)關(guān)系圖

2.3 藥效學(xué)結(jié)果 與延胡索單方組比較0～0.5 h無(wú)差異,1～3 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),4～14 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與缺白芥子組比較,全方組0～1 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,1～3 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),4～14 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。藥物與效應(yīng)擬合度較好,參數(shù)見(jiàn)表3。

表2 穴位給藥后各組血清中IgE相對(duì)表達(dá)量

表3 穴位給藥后各組延胡索乙素的PK-PD參數(shù)

2.4 PK-PD模型擬合結(jié)果 從濃度-時(shí)間-效應(yīng)三維曲線圖來(lái)看,延胡索單方組、缺白芥子組,藥物濃度-效價(jià)重合度顯著高于全方組;從抑制率-濃度曲線圖來(lái)看,全方組的逆時(shí)針趨勢(shì)顯著高于延胡索單方組、缺白芥子組。見(jiàn)圖2。

圖2 白芥子配伍前后濃度-時(shí)間-效應(yīng)三維曲線圖、抑制率-濃度曲線圖

2.5 小結(jié) 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果表明,白芥子配伍可以增加延胡索乙素吸收,提高生物利用度。分析原因,可能與白芥子配伍后,改變了延胡索乙素體內(nèi)吸收、分布有關(guān)。

藥效學(xué)結(jié)果表明,白芥子配伍后對(duì)IgE抑制作用更明顯。分析原因,可能是白芥子配伍后,改善了延胡索乙素體內(nèi)過(guò)程,進(jìn)而增加療效。

PK-PD模型擬合結(jié)果表明,白芥子配伍后藥物濃度與藥效時(shí)間上并不是嚴(yán)格一一對(duì)應(yīng)的。穴位處藥物濃度下降期間,藥效仍能夠保持較高的水平甚至逐漸達(dá)到效應(yīng)峰值。這一趨勢(shì)表明,白芥子配伍后存在一定藥效滯后現(xiàn)象,藥物作用的效應(yīng)室不實(shí)際存在,經(jīng)PK-PD數(shù)學(xué)模型形成抽象的虛擬效應(yīng)室。

PK-PD模型擬合結(jié)果的抑制率-濃度曲線圖趨勢(shì)表明,各組均屬于逆時(shí)針曲線,藥效滯后于藥物濃度變化,從效應(yīng)室到靶向部位的傳遞屬于階段過(guò)程。白芥子配伍后的逆時(shí)針趨勢(shì)更明顯,(虛擬的)效應(yīng)室濃度與(局部的)關(guān)節(jié)腔濃度是完全不重合的兩條逆時(shí)針曲線,結(jié)合參數(shù)Ke0值可以發(fā)現(xiàn)(白芥子配伍后,Ke0降低):白芥子配伍后,延胡索乙素在效應(yīng)室和靶器官之間平衡速度降低,從效應(yīng)室的消除速度降低,更加長(zhǎng)時(shí)間滯留在(虛擬的)效應(yīng)室、作用于穴位,更長(zhǎng)時(shí)間刺激穴位,產(chǎn)生持久的藥效作用,推測(cè)這是白芥子配伍后藥效得到放大的原因。

3 討論

一直以來(lái),經(jīng)典方劑立法意圖、組方規(guī)律的科學(xué)內(nèi)涵應(yīng)該如何體現(xiàn),都是中藥復(fù)方現(xiàn)代化研究的焦點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題[7-10]?！岸∠闹巍狈阶鳛閼?yīng)用至今的外用經(jīng)典方劑,必有其深刻的科學(xué)內(nèi)涵需要挖掘。現(xiàn)代醫(yī)家從藥性理論、治法功效進(jìn)行分析,認(rèn)為該方辛溫助陽(yáng)、散寒止痛,適合外寒侵襲引發(fā)的哮喘[11-12]。但是僅從配伍關(guān)系、臨床功效進(jìn)行分析,并不全面。清代·張璐在創(chuàng)立此方時(shí)便認(rèn)識(shí)到“該方涂后麻痹痛、切勿輕易便去”,可見(jiàn)此方在臨床使用時(shí)需要長(zhǎng)時(shí)間用藥,使其緩緩發(fā)揮藥效。本研究發(fā)現(xiàn),這種長(zhǎng)時(shí)間用藥的緩慢、滯后效果與白芥子的使用有一定相關(guān)性,能幫助方中延胡索有效成分滯留穴位部位時(shí)間更長(zhǎng)、持續(xù)發(fā)揮藥效,在方劑中起到藥效、改善藥物穴位皮下分布的雙重作用。

目前,中藥復(fù)方配伍規(guī)律的研究主要從化學(xué)組成、藥理學(xué)方面進(jìn)行研究,近年來(lái)已經(jīng)有研究者從藥物動(dòng)力學(xué)角度對(duì)經(jīng)典方劑進(jìn)行重新認(rèn)識(shí)。倪建新等[13]研究左金丸的配伍規(guī)律發(fā)現(xiàn),吳茱萸配伍后,黃連中主要成分小檗堿半衰期延長(zhǎng),達(dá)峰時(shí)間Tmax、峰濃度、AUC等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)都呈現(xiàn)生物利用度優(yōu)勢(shì)。王天明等[14]研究發(fā)現(xiàn),甘草和冰片配伍使用可增加甘草苷AUC0-∞、延長(zhǎng)t1/2、縮短達(dá)峰時(shí)間Tmax。李燕等[16]發(fā)現(xiàn),附子總生物堿與大黃蒽醌配伍后,附子總生物堿的指標(biāo)性成分在模型大鼠體內(nèi)的總?cè)胙扛?、代謝更快。米雅慧等[17]發(fā)現(xiàn)川芎天麻配伍后,川芎中川芎嗪、阿魏酸在大鼠腦內(nèi)吸收程度增加,作用時(shí)間延長(zhǎng),消除速度降低,腦內(nèi)蓄積量顯著增加。李蕓霞和彭成[18]對(duì)現(xiàn)有的中藥附子復(fù)方研究進(jìn)行整理后,認(rèn)為附子在不同處方中藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有明顯差異,對(duì)于配伍后附子毒性研究有指導(dǎo)意義。

本研究在以上藥動(dòng)學(xué)研究基礎(chǔ)上,結(jié)合PK-PD模型,對(duì)經(jīng)典方劑配伍的科學(xué)性進(jìn)行探索。PK-PD模型能夠?qū)K和PD整合一體,完成藥量和效應(yīng)之間的轉(zhuǎn)換,將釋藥體系看成一個(gè)抽象的整體,用數(shù)學(xué)方式模擬藥物體內(nèi)吸收-積累-起效的全過(guò)程[19-20]。而中藥復(fù)方的整體性特征,恰恰可以視為一種釋藥體系,相當(dāng)于現(xiàn)代藥劑學(xué)概念中的給藥系統(tǒng)[21-22]。特別對(duì)于穴位部位這種解剖學(xué)難以定位的部位,采用PK-PD數(shù)學(xué)模型擬合的建立虛擬的藥動(dòng)學(xué)“房室”,可以幫助我們更好地闡述藥物在穴位部位分布、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝的過(guò)程。因此,以藥動(dòng)學(xué)研究為基礎(chǔ),結(jié)合PK-PD數(shù)學(xué)模型,比較配伍前后的變化,闡明穴位用藥配伍的科學(xué)內(nèi)涵是一種新探索,也是追溯中藥復(fù)方配伍協(xié)同作用、找尋中藥經(jīng)典方劑遣方用藥規(guī)律的新思路。

利益沖突聲明:無(wú)。