竇科峰，張 玄，陶開山

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710032)

異種移植是將動物源性的活細(xì)胞、組織、器官以移植、接種或注射的方式植入人體內(nèi)的過程。作為解決器官短缺問題的潛在途徑之一，異種移植因豬源性異種抗原αGal、Sda和Neu5Gc的發(fā)現(xiàn)和鑒定[1]以及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的進(jìn)步得到了快速發(fā)展[2]。許多豬到非人靈長類動物(non-human primate，NHP)的臨床前研究已證實，移植豬器官的受體能夠獲得長期存活，其中腎移植最長存活時間超過2年[3]，心臟移植最長存活近1年[4]。經(jīng)過基因改造的豬器官在抑制異種移植超急性排斥、急性排斥、凝血紊亂、炎癥反應(yīng)等方面都有顯著效果[1]，如何進(jìn)一步選擇最佳基因編輯組合，優(yōu)化免疫抑制方案控制排斥和感染，利用輔助用藥控制炎癥和凝血障礙等是當(dāng)前亟需解決的問題[5]。以腦死亡患者為受體的亞臨床試驗說明異種腎臟[6]、心臟移植早期移植物能夠有效發(fā)揮生理功能，并未見排斥反應(yīng)，其臨床應(yīng)用有可行性[7]。而2例異種心臟移植的臨床試點(diǎn)研究說明，異種心臟能夠發(fā)揮早期替代作用，但仍然存在后期無法控制的排斥問題[8]。本文現(xiàn)就異種移植涉及的器官短缺、發(fā)展簡史及前沿、存在的主要問題、國內(nèi)發(fā)展動態(tài)等方面進(jìn)行論述，旨在為學(xué)科建設(shè)提供指導(dǎo)。

1 全球器官短缺難題

器官移植是人類改變傳統(tǒng)治療方式、挽救各種器官衰竭患者生命的一種新的醫(yī)療模式，為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了革命性的變化。近年來，隨著外科手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步和免疫抑制藥物的發(fā)展，器官移植手術(shù)技術(shù)不斷成熟，移植患者生存率和移植物存活率均不斷提高。在我國，腎移植患者術(shù)后1年和3年的生存率分別達(dá)到97.7%和96.1%，肝移植患者術(shù)后1年和5年的生存率分別達(dá)到83.7%和68.9%，心臟移植患者術(shù)后1年和5年的生存率分別達(dá)到85.1%和75.2%[9]。目前，器官短缺已成為該領(lǐng)域的世界性難題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計，全球每年約有200萬人需要器官移植，僅約10%的患者能夠等到合適的移植器官。如2022年，美國登記等待器官移植患者106 849例，完成器官移植患者42 887例，器官供需比約為1∶3[10]。同年，我國登記等待器官移植患者135 450名，完成器官移植患者20 225名，器官供需比約為1∶7[9]。如何克服器官短缺是未來移植領(lǐng)域發(fā)展必須面臨的難題。

2 異種移植發(fā)展簡史

1682年，人類歷史上嘗試了第一次異種移植，一名俄羅斯貴族在戰(zhàn)斗中失去部分頭皮和頭骨，醫(yī)生用一塊狗頭骨成功修復(fù)頭骨缺陷，但俄羅斯教會認(rèn)為，人頭上有狗骨頭不能是基督徒，威脅要將這位貴族逐出教會。這個敬畏上帝的人，選擇把狗骨頭碎片取出，他認(rèn)為信仰比生命更重要。因此，第一次異種移植是不被宗教認(rèn)可的。1838年，人類歷史上進(jìn)行了第1例豬到人的角膜移植。20世紀(jì)初，人們分別嘗試將兔、綿羊、豬、黑猩猩器官移植到人身上，但因無法避免“超急性排斥反應(yīng)”，各項試驗均以失敗告終。20世紀(jì)60～90年代，人們嘗試將黑猩猩和狒狒肝、腎、心移植給人類，由于使用了免疫抑制劑，受體存活時間從2 h到幾周到9個月不等，異種移植獲得了初步成功。20世紀(jì)90年代后，豬取代NHP，成為首選異種移植器官來源。為了促進(jìn)異種移植發(fā)展，給讀者提供跨越物種障礙的器官和組織移植領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)，異種移植?？疿enotransplantation在1994年創(chuàng)刊。1998年，國際異種移植協(xié)會成立，旨在促進(jìn)異種移植成為一種安全、道德和有效的治療方式。2002年，世界首個α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶敲除(GGTA1-knockout，GTKO)豬誕生，成功克服超急性排斥反應(yīng)，異種移植發(fā)展進(jìn)入快車道。2012年，新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9的出現(xiàn)使供體豬的基因編輯過程更快速、更簡單、更精準(zhǔn)，并且，基因編輯豬的培育周期顯著縮短、培育成本大幅降低。進(jìn)入21世紀(jì)，異種移植發(fā)展正式走向了基因編輯豬的時代，異種移植的NHP試驗不斷取得突破，異種移植被科學(xué)界寄予厚望。

3 異種移植發(fā)展前沿

異種移植是最具潛力解決器官短缺問題的途徑之一，也是移植領(lǐng)域的主要發(fā)展方向之一[11]。近年來，異種移植研究取得了一系列重大突破性進(jìn)展，被預(yù)測會掀起下一次的醫(yī)學(xué)革命。①臨床前試驗：2021年，“2-基因”編輯豬-猴腎移植受體猴存活557 d[12]。2022年，“7-基因”編輯豬-猴原位心臟移植受體猴存活264 d[4]。2023年，“4-基因”編輯豬-猴原位輔助性肝移植受體猴存活34 d[13]。2022年，GTKO豬-猴坐骨神經(jīng)替換橈神經(jīng)移植獲得成功，受體猴手臂恢復(fù)運(yùn)動功能[14]。2023年，GTKO豬-猴肺動脈瓣移植獲得成功，實現(xiàn)置換瓣膜的生長和自我修復(fù)。②亞臨床試驗：2021年，美國兩家研究機(jī)構(gòu)同時開展基因編輯豬-腦死亡患者腎移植獲得成功，觀察期內(nèi)(54 h[6]和74 h[7])移植豬腎功能均良好。2023年，GTKO豬-腦死亡患者腎移植取得新進(jìn)展，1周[15]和2個月的觀察期內(nèi)，移植豬腎未見排斥現(xiàn)象，并能正常發(fā)揮功能。2022年，“10-基因”編輯豬-腦死亡患者心臟移植亦成功開展，72 h觀察期內(nèi)移植心臟功能正常。③臨床試驗：2022年，國際首例基因編輯豬-人原位心臟移植成功開展，患者最終存活了2個月，移植終點(diǎn)心臟出現(xiàn)排斥，心室壁肥大，心室體積縮小，懷疑死于豬巨細(xì)胞病毒感染[8]。2023年，同樣采用“10-基因”編輯豬作為供體，世界第2例基因編輯豬-人原位心臟移植相繼開展。術(shù)后患者可自主呼吸，心臟功能良好，沒有使用任何輔助設(shè)備，并開始恢復(fù)肌力。最新報道，患者移植心臟出現(xiàn)排斥，于術(shù)后41 d死亡，具體死因仍待分析。此外，2023年，美國已注冊了國際首個單臂Ⅰ期基因編輯豬腎移植的臨床試驗，計劃利用10-基因編輯豬為20名腎衰患者進(jìn)行臨床腎移植。

4 異種移植存在的主要問題

豬器官移植應(yīng)用于臨床面臨著幾大挑戰(zhàn)[5]：①免疫與技術(shù)挑戰(zhàn)[16]：預(yù)防超急性排斥反應(yīng)和急性排斥反應(yīng)是異種移植獲得成功的關(guān)鍵。目前，αGal抗原的敲除已基本解決了異種器官移植的超急性排斥反應(yīng)問題。同時，Sda和Neu5Gc抗原的敲除進(jìn)一步減弱了體液性排斥反應(yīng)的程度。然而，基因編輯可能并不總是像預(yù)期的那樣有益，Neu5Gc抗原表達(dá)缺失似乎暴露了另一種聚糖(被稱為“第4種異種抗原”)，該聚糖在NHP中具有抗原性，但在人類中沒有[17]。NHP抗體對第4種異種抗原的反應(yīng)已被證明是有問題的，豬到NHP模型可以說不再具有豬到人模型的代表性。然而，對于臨床試驗，刪除3種異種抗原的表達(dá)將是有利的，因為人類沒有針對這些豬細(xì)胞的抗體。此外，預(yù)防補(bǔ)體介導(dǎo)的毒性反應(yīng)、控制過度激活的炎癥反應(yīng)、改善凝血功能失調(diào)、調(diào)節(jié)圍術(shù)期的移植物功能障礙等是目前臨床前試驗中面臨的問題。有證據(jù)表明，通過轉(zhuǎn)入一種或多種人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(如CD46和CD55)[18]和一種或多種人凝血調(diào)節(jié)蛋白(如TBM和EPCR)，可以進(jìn)一步保護(hù)人體免受先天免疫反應(yīng)的影響。此外，轉(zhuǎn)入抗炎蛋白(如HO-1和A20)和抗巨噬細(xì)胞蛋白CD47也可能是有益的[18]。②生理學(xué)挑戰(zhàn)[19-20]：克服移植物的血流動力學(xué)和生理學(xué)方面與人的差異是異種移植面臨的第二個障礙。豬的血流動力學(xué)與人有差異，且豬的器官移植入人體會受到人體微環(huán)境影響，如異種心臟移植后移植物在受體內(nèi)過度生長，目前可采用生長激素受體敲除的方式克服此問題；異種腎移植和肝移植后會出現(xiàn)生理兼容差異，豬源紅細(xì)胞生成素和豬肝合成的多種蛋白能否完全替代人源仍是未知的問題，需要進(jìn)一步探索等。此外，供-受體來源的組織因子釋放，會啟動凝血級聯(lián)途徑，而移植豬肝合成的凝血因子等存在種間分子不兼容，導(dǎo)致纖溶-凝血系統(tǒng)失衡，經(jīng)炎癥反應(yīng)放大，移植物實質(zhì)發(fā)生出血和形成廣泛的微血栓，并引發(fā)消耗性凝血障礙。值得注意的是，凝血紊亂在心[21]、腎[22]移植時，病理程度相對較輕，而在肝[16]、肺[23]移植時表現(xiàn)非常典型，會嚴(yán)重影響移植物功能和長期存活。因此，對于異種肝移植而言，控制炎癥反應(yīng)，并積極改善凝血紊亂問題顯得尤為重要。③感染的挑戰(zhàn)：跨物種感染是異種移植不得不預(yù)防的問題。盡管豬和人的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，跨物種感染的風(fēng)險相對于NHP要低，但仍然要預(yù)防豬源性細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲等對受者造成的感染以及隨之帶來的社會性感染風(fēng)險?，F(xiàn)有的無指定病原體級飼養(yǎng)環(huán)境聯(lián)合供體豬的剖宮產(chǎn)，能隔絕大部分的細(xì)菌、病毒、寄生蟲等。最受關(guān)注的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)內(nèi)嵌于豬基因組，需通過基因敲除的方式去除，目前已有PERV敲除聯(lián)合多基因編輯豬(“13-基因”編輯豬)的異種心臟、肝臟和腎臟移植臨床前試驗開展[24]。④社會與倫理挑戰(zhàn)：包括社會的認(rèn)可度、相關(guān)的法規(guī)、分配制度與公正性、動物的權(quán)利和知情同意等。最近的一項異種移植接受度的定性調(diào)查顯示，絕大部分普通人群是能接受異種移植作為治療手段的，特別是等待器官移植的患者，接受率超70%[25]。移植人群及公眾的擔(dān)憂因素包括人畜共患病的傳播、移植功能低下、身份的改變、社會污名、宗教信仰、動物倫理等。

5 國內(nèi)異種移植發(fā)展現(xiàn)狀

在異種移植研究領(lǐng)域，世界首例GTKO豬[26-27]、首例PERV敲除豬[2]，均出自我國科學(xué)家之手，我國的供體豬基因編輯水平和繁育能力已達(dá)到國際領(lǐng)先或先進(jìn)水平[28]。目前，我國的異種移植研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)遍布全國，總數(shù)超過30余家[29]。其中，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京大學(xué)、吉林大學(xué)、中南大學(xué)、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院等單位在基因編輯豬的培育方面取得了重大進(jìn)展[29]?？哲娷娽t(yī)大學(xué)[30]、華中科技大學(xué)、中南大學(xué)、中山大學(xué)、海南醫(yī)學(xué)院、首都醫(yī)科大學(xué)、浙江大學(xué)、深圳大學(xué)、四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院等單位在異種器官移植的NHP試驗方面取得了重大突破?？哲娷娽t(yī)大學(xué)完成了國內(nèi)首例GTKO豬-猴異種肝移植研究[30-31]；國際首例PERV敲除多基因編輯豬-猴異種肝、心和腎移植，并兩次突破肝移植受體存活世界紀(jì)錄；國際首例多基因編輯豬-猴多器官多組織聯(lián)合移植(肝腎聯(lián)合移植、心、皮膚、神經(jīng)、角膜和椎間盤移植等)。在此基礎(chǔ)上，還進(jìn)一步完成了國內(nèi)首例多基因編輯豬-猴的特重度燒傷患者皮膚移植，并取得滿意臨床療效。同時，首都醫(yī)科大學(xué)、中山大學(xué)、四川省人民醫(yī)院和中南大學(xué)亦分別開展異種心、肝和腎移植的NHP試驗。中南大學(xué)、深圳大學(xué)、空軍軍醫(yī)大學(xué)也陸續(xù)在開展豬胰島、皮膚移植研究。中南大學(xué)2013—2017年成功將新生豬的胰島細(xì)胞移植給10位患1型糖尿病的患者，這些患者病情得到明顯改善，移植綜合評分高于日本同類研究。目前，國內(nèi)常規(guī)免疫抑制劑方案的豬-猴異種腎移植，最長存活時間已成功突破2個月。此外，全球異種移植臨床研究國際研討會已經(jīng)兩次在我國召開，會議共同起草了針對WHO所有成員國的臨床異種移植研究規(guī)范《長沙宣言》[32]。同時，為推進(jìn)國內(nèi)異種移植臨床研究的安全、順利開展，規(guī)范異種移植臨床研究行為，根據(jù)相關(guān)法律和規(guī)范，中華醫(yī)學(xué)會器官移植學(xué)分會異種移植學(xué)組，從總則、項目申請與審查、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、倫理要求、生物安全、項目管理、供體要求、受者選擇、項目實施、追蹤隨訪等方面，也制定了我國的異種移植臨床研究指導(dǎo)意見[33-34]。

6 結(jié)束語

現(xiàn)在，異種移植已經(jīng)跨越完成了“原初探索”“基礎(chǔ)理論體系構(gòu)建”“異種抗原及免疫調(diào)節(jié)基因功能鑒定”與“豬-非人靈長類異種移植”四個階段，開始進(jìn)入第五階段(豬-人異種移植)。近年來，全球異種移植正蓬勃發(fā)展，市場規(guī)模呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢，預(yù)測2032年將達(dá)到260億美元，異種移植的未來市場需求和發(fā)展空間將十分巨大。美國現(xiàn)有多家大型醫(yī)藥公司正在該領(lǐng)域進(jìn)行長期投入，包括eGenesis、Makana Therapeutics、United Therapeutics等。并且，歐美國家也已經(jīng)逐步開展了異種器官移植的臨床試點(diǎn)研究。我國在異種移植領(lǐng)域正面臨著巨大的契機(jī)和挑戰(zhàn)，我們應(yīng)加強(qiáng)投入和政策引導(dǎo)，鼓勵相關(guān)企業(yè)加入，重視異種移植研究工作，完善醫(yī)療級大動物繁育設(shè)施建設(shè)，搶占行業(yè)技術(shù)制高點(diǎn)。同時，加強(qiáng)政府監(jiān)管和倫理論證，推動制定相應(yīng)政策和行為規(guī)范。異種移植是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，涉及醫(yī)學(xué)、動物學(xué)、畜牧學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、倫理、法律、心理學(xué)等，因此，應(yīng)鼓勵多學(xué)科交叉融合發(fā)展。異種移植走向臨床將是人類醫(yī)學(xué)發(fā)展從理念到應(yīng)用的一次重大突破，將帶動生物醫(yī)療新技術(shù)的發(fā)展，并催生新的生物、技術(shù)產(chǎn)業(yè)的崛起，我國應(yīng)從戰(zhàn)略層面布局，推進(jìn)器官捐獻(xiàn)和異種移植同步發(fā)展，為守衛(wèi)國民健康做出努力。