王彥芳，張瀟劍，賈巍力，毛珍珍，石 文，聶 耶，宋文杰

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，陜西 西安 710032；2西安醫(yī)學(xué)院研究生院，陜西 西安 710021)

原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)的腫瘤中發(fā)病率位居第六，死亡率排第三，分為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝內(nèi)膽管癌以及混合性癌，其中HCC約占90%。據(jù)預(yù)估，截至2025年，受到肝癌困擾的患者數(shù)量每年將新增超過(guò)100萬(wàn)[1]。雖然治療HCC手段很多，但是HCC發(fā)病隱匿，臨床診斷發(fā)現(xiàn)往往以中晚期為主，致死率高，5年生存率非常低[2]。隨著這些年癌癥系統(tǒng)性免疫療法快速發(fā)展，如免疫檢查點(diǎn)阻斷劑、酪氨酸激酶抑制劑和單克隆抗體等，給HCC患者帶來(lái)了新的希望，然而HCC分子發(fā)病機(jī)制因不同的遺傳毒性損傷和病因而導(dǎo)致免疫反應(yīng)多樣性及差異性，使得大部分患者對(duì)化療和放療具有耐藥性[3]。因此，深入闡明HCC免疫微環(huán)境調(diào)控機(jī)制，對(duì)HCC治療具有重大臨床意義。

一般而言，肝癌發(fā)生過(guò)程涉及多個(gè)步驟、多種因素，包括許多遺傳或表觀遺傳的變化，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。免疫微環(huán)境參與了癌癥的轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移等所有階段。越來(lái)越多的研究顯示具有復(fù)雜構(gòu)造的人類(lèi)惡性腫瘤受到多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)體腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中的免疫細(xì)胞通過(guò)吸附和聚集，活化抗腫瘤T細(xì)胞，監(jiān)視并清除腫瘤細(xì)胞，也可通過(guò)活化巨噬細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，構(gòu)建抑制免疫表達(dá)的微環(huán)境，并且還會(huì)因?yàn)槟[瘤類(lèi)型、分型及個(gè)體不同導(dǎo)致明顯的差異性[4]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)TME對(duì)腫瘤的療效差別及耐藥性有巨大影響。癌癥免疫治療的療效依賴于產(chǎn)生有效和持久的適應(yīng)性免疫抗腫瘤反應(yīng)[5]。然而，由于腫瘤免疫逃逸和缺乏準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物，客觀反應(yīng)率仍然很低，在20%～40%之間[3]。此外，由于T細(xì)胞活化增強(qiáng)，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致治療中斷，從而發(fā)生與免疫相關(guān)的不良事件。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的免疫途徑，以改善免疫療法的反應(yīng)和癌癥患者的預(yù)后。對(duì)TME進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(tertiary lymphoid structures，TLS)是一種由組織細(xì)胞聚集的結(jié)構(gòu)，與次級(jí)淋巴器官(secondary lymphoid organs，SLO)類(lèi)似，而且可能對(duì)HCC的預(yù)后及治療具有重要的調(diào)控作用。越來(lái)越多的證據(jù)也表明，在腫瘤中具有抗腫瘤免疫反應(yīng)的TLS結(jié)構(gòu)，將成為可以產(chǎn)生免疫反應(yīng)的地方中樞[6]。本文就目前HCC研究現(xiàn)狀，提出了TME與HCC的關(guān)系，引出了TLS，進(jìn)一步回顧了近些年來(lái)TLS在腫瘤中的研究進(jìn)展，闡述了TLS對(duì)HCC預(yù)后的兩面性、TLS作為臨床免疫治療的潛在靶器官是如何通過(guò)調(diào)節(jié)TLS的形成來(lái)影響HCC預(yù)后以及提高免疫治療效果的，希望為日后的研究提供新思路。

1 TLS相關(guān)研究

1.1 TLS概述

TLS是一種新生的異位淋巴組織，又被稱為異位淋巴結(jié)構(gòu)，更有人稱之為三級(jí)淋巴器官及誘導(dǎo)淋巴器官等，其存在于長(zhǎng)期慢性感染及腫瘤組織中，例如持續(xù)性病原體感染、自身免疫性疾病、同種異體排斥反應(yīng)和各種癌癥。細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能類(lèi)似于SLO，具有啟動(dòng)免疫應(yīng)答的能力。已有研究證實(shí)，在某些腫瘤中如黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等，TLS對(duì)于其預(yù)后有著積極的作用，而在免疫系統(tǒng)性疾病例如橋本氏甲狀腺炎、狼瘡腎炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，與其預(yù)后差成正相關(guān)[7]。

1.2 TLS與SLO

TLS在結(jié)構(gòu)組成方面與SLO極為相似，其基礎(chǔ)細(xì)胞組成包括T細(xì)胞、B細(xì)胞及其他基質(zhì)細(xì)胞。成熟的TLS包括T細(xì)胞區(qū)和B細(xì)胞區(qū)。T細(xì)胞區(qū)包含具有Th1、細(xì)胞毒性或記憶表型的活化T細(xì)胞，參與抗原提呈的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)和成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞；B細(xì)胞區(qū)中的生發(fā)中心(germinal center，GC)那里可以檢測(cè)到記憶B細(xì)胞和漿細(xì)胞。其中T細(xì)胞區(qū)域包裹GC。并且，在整個(gè)TLS中散在分布高內(nèi)皮微靜脈(high endothelial venules，HEV)、DC溶酶體相關(guān)膜蛋白和DC[8]。

TLS和SLO在功能上也是極為相似的，主要體現(xiàn)在編碼淋巴細(xì)胞趨化因子和淋巴毒素(lymphotoxin，LT)的基因表達(dá)上。GC區(qū)中能夠介導(dǎo)B細(xì)胞分化、T細(xì)胞超突變、寡克隆擴(kuò)增以及最終的抗體產(chǎn)生[9]。有研究更是在敲除SLO小鼠中發(fā)現(xiàn)TLS可以取代SLO產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[10]。

盡管TLS和SLO有著極為相似的功能，但二者仍然存在不同。在形態(tài)學(xué)上，TLS缺乏包膜，存在于各種非淋巴組織中，所以它可以是淋巴細(xì)胞聚集體，也可以是更具組織性的結(jié)構(gòu)，并且它們之間的區(qū)別也沒(méi)有一個(gè)清晰的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[11]。在免疫應(yīng)答過(guò)程中，TLS直接暴露于炎性環(huán)境，接受刺激抗原和細(xì)胞因子的作用，快速產(chǎn)生免疫應(yīng)答的同時(shí)也可能發(fā)生過(guò)量淋巴細(xì)胞活化，進(jìn)而產(chǎn)生“炎性因子風(fēng)暴”，這也有可能是某些自身免疫系統(tǒng)疾病的致病因素之一[12]。在形成方面，SLO是在人體胚胎時(shí)期由淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用而形成的，不同于初級(jí)及次級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)，TLS不是在胚胎時(shí)期形成的，其在正常情況下是不存在的，主要在慢性炎癥(如持續(xù)性病原體感染、自身免疫性疾病、同種異體排斥和癌癥)部位誘導(dǎo)下形成，由免疫細(xì)胞聚合形成離散的結(jié)構(gòu)化組織。它們存在時(shí)間短暫，具有可塑性，主要與損傷有關(guān)，能夠在抗原清除和組織修復(fù)后而分解[10]。這也是兩者最根本的不同之處。

TLS和SLO也是緊密相連的，研究表明淋巴組織或淋巴樣組織之間是連續(xù)的。免疫應(yīng)答來(lái)自具有良好組織結(jié)構(gòu)的SLO，到非包膜的非淋巴樣組織，如結(jié)腸中的派爾氏結(jié)和預(yù)先存在的淋巴濾泡等結(jié)構(gòu)，再到出生后在感染或癌癥條件下可能發(fā)生的具有可塑性的、暫時(shí)性的TLS[13]。機(jī)體通過(guò)先天性和適應(yīng)性的免疫應(yīng)答來(lái)抗腫瘤免疫反應(yīng)以消除癌細(xì)胞，從而達(dá)到生理性康復(fù)。

1.3 TLS的形成機(jī)制

TLS是由HEV、帶有濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞(follicular dendritic cell，F(xiàn)DC)的B細(xì)胞濾泡、GC和淋巴管構(gòu)成了組織程度不同的非包膜結(jié)構(gòu)，且TLSs的結(jié)構(gòu)、功能和形成在不同的組織和各種疾病之間會(huì)有所不同[14]。淋巴新生被認(rèn)為是TLS形成的起始。TLS的形成過(guò)程與SLO的免疫應(yīng)答過(guò)程存在多方面的重疊。

與SLO形成不同，TLS可以獨(dú)立于淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞形成，由不同于其他淋巴結(jié)構(gòu)形成的誘導(dǎo)因子的信號(hào)產(chǎn)生，例如，它們可以在RORtγ-和Id2-缺陷小鼠中形成[15]。

與程序化SLO和孤立淋巴濾泡的形成類(lèi)似，TLS的形成是一個(gè)多步驟的過(guò)程。首先，局部成纖維細(xì)胞的重編程在TLS的形成中起著至關(guān)重要的作用[16]。在炎癥的刺激下，局部成纖維細(xì)胞獲得了淋巴細(xì)胞特性，表達(dá)大量的趨化因子(如CCL19、CCL21、CXCL13和黏附分子ICAM-1和VCAM-1)，但它的信號(hào)啟動(dòng)通過(guò)不同的途徑發(fā)生，提供激活信號(hào)的細(xì)胞也因環(huán)境而異，這種功能主要?dú)w因于髓系細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞以及先天淋巴細(xì)胞[17]。緊接著在不同細(xì)胞來(lái)源的IL-17和IL-22協(xié)助下，驅(qū)動(dòng)成纖維細(xì)胞啟動(dòng)，并進(jìn)一步膨脹擴(kuò)張[18]。然而，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子并不足以驅(qū)動(dòng)TLS的新生，還需要招募多個(gè)造血細(xì)胞來(lái)促進(jìn)這一過(guò)程。同時(shí)，在抗原刺激下，TLS中髓系細(xì)胞和B細(xì)胞充當(dāng)抗原遞呈細(xì)胞[19]。因此，趨化因子的獲得和抗原呈遞都可能是驅(qū)動(dòng)TLS形成的關(guān)鍵，但這些功能不一定重疊。在SLO的形成和成熟中，LT β受體(LT β receptor，LTβR)信號(hào)通路是必需的。而在TLS的新生中，LTβR的刺激似乎并不是必需的，而在維持組織中淋巴結(jié)(lymph node，LN)成纖維細(xì)胞是必需的[18]。

在TLS進(jìn)一步成熟過(guò)程中，HEV的形成至關(guān)重要。TLS中的初始淋巴細(xì)胞簇由活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞與髓細(xì)胞共同形成，而原始的淋巴細(xì)胞則需要通過(guò)HEV表達(dá)外周淋巴結(jié)血管地址素配體CD62L以及CCR7(CCL21和CCL19的受體)進(jìn)入TLS[14]。與LN類(lèi)似，HEV的形成似乎依賴于LTα1β2，而與LTβR相關(guān)性仍有待進(jìn)一步的研究[20]。

TLS成熟的最后一個(gè)標(biāo)志是B細(xì)胞濾泡內(nèi)FDC的形成，然而TLS中的FDC祖細(xì)胞尚不清楚，有報(bào)道表明FDC的形成需要SLO中的LTβR和TNFR1信號(hào)，其中LTα1β2對(duì)于TLS中FDC的生成非常重要，能夠允許GC反應(yīng)和抗原呈遞[21]，如果將激活的局部基質(zhì)細(xì)胞與遷移的免疫細(xì)胞相遇，將會(huì)分化為FDC。盡管對(duì)SLO與TLS的研究已經(jīng)很多了，然而驅(qū)動(dòng)腫瘤中TLS形成的機(jī)制仍幾乎未知。

2 TLS對(duì)HCC患者預(yù)后的影響

大量的研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥中，一部分癌癥的預(yù)后與TLS的存在呈正相關(guān)，而在一些癌癥中則表現(xiàn)為較差的預(yù)后，其中較差的預(yù)后主要與TLS的成分、位置等有關(guān)。在不同類(lèi)型腫瘤的間質(zhì)、浸潤(rùn)邊緣和/或核心中均可發(fā)現(xiàn)TLS[22]。那么在肝癌中，TLS在不同的位置是如何影響預(yù)后的？HCC是一種炎癥驅(qū)動(dòng)型癌癥，其特征為肝硬化結(jié)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)肝癌間質(zhì)中存在大量TLS，這將增加術(shù)后2年晚期復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，有人認(rèn)為它們可能作為肝癌祖細(xì)胞龕位[23]。在肝癌組織中TLS的密度低于癌旁組織，且瘤內(nèi)的成熟TLS比不成熟TLS更能夠預(yù)測(cè)肝癌患者較低的早期復(fù)發(fā)率，然而癌旁組織中的TLS則對(duì)早期和晚期復(fù)發(fā)沒(méi)有預(yù)后價(jià)值。

在我們的研究團(tuán)隊(duì)中，根據(jù)HE染色結(jié)果，將空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院和癌癥基因組圖譜肝癌患者分為T(mén)LS+組和TLS-組，分別研究了其對(duì)HCC患者預(yù)后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)TLS是HCC早期復(fù)發(fā)的低風(fēng)險(xiǎn)因素，而對(duì)晚期復(fù)發(fā)無(wú)影響[24]。因此，正常情況下在腫瘤間質(zhì)中的TLS能夠促進(jìn)腫瘤形成、激發(fā)炎癥狀態(tài)，而腫瘤內(nèi)TLS則真正反映了持續(xù)的、有效的抗腫瘤免疫[12]。

綜上所述，TLS可能在肝細(xì)胞癌的不同區(qū)域中具有雙重預(yù)后作用。在肝癌間質(zhì)中的TLS提高了晚期復(fù)發(fā)率，而腫瘤內(nèi)成熟的TLS則降低早期復(fù)發(fā)率，提示良好的預(yù)后作用，在癌旁組織中的TLS則對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后無(wú)明顯的價(jià)值。

3 TLS對(duì)免疫治療的影響

免疫檢查點(diǎn)的出現(xiàn)為腫瘤患者迎來(lái)了福音，然而并不是所有患者均有較好的免疫反應(yīng)。因此，迫切需要確定一個(gè)可以對(duì)免疫反應(yīng)敏感的腫瘤標(biāo)志物。在接受抗PD-1治療的腫瘤患者中，臨床反應(yīng)的一個(gè)重要前提是腫瘤部位存在足量的抗腫瘤T細(xì)胞和PD-1配體，在進(jìn)行抗PD-1治療時(shí)，被抑制的細(xì)胞重新激活成為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)一步殺死惡性細(xì)胞[25]。腫瘤突變負(fù)荷也是作為評(píng)估免疫治療反應(yīng)的另一個(gè)指標(biāo)。然而，這些標(biāo)記都不能完全預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫療法的反應(yīng)。在對(duì)非小細(xì)胞型肺癌抗PD-1治療的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)治療有反應(yīng)的患者體內(nèi)富集TLS[26]。而且在各種疫苗試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，給予惡性腫瘤治療性疫苗接種后，可以刺激TLS形成，同時(shí)產(chǎn)生大量T淋巴細(xì)胞，說(shuō)明TLS可能是誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的主要成分[27]。根據(jù)以上的研究結(jié)果可以推測(cè)，腫瘤中TLS的誘導(dǎo)可能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的招募和腫瘤控制；而作為各種免疫細(xì)胞的聚集地，TLS對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的控制，給免疫治療反應(yīng)的評(píng)估帶來(lái)新的契機(jī)。例如，最近的兩項(xiàng)研究表明，對(duì)免疫治療有反應(yīng)的黑色素瘤患者中TLS的密度高于那些無(wú)反應(yīng)的患者[28]。

鑒于TLS的抗腫瘤免疫的積極效果，最近出現(xiàn)了一系列老鼠模型的報(bào)告，研究如何誘導(dǎo)TLS新生。例如，使用血管靶向肽將LIGHT靶向腫瘤血管，從而使大量T淋巴細(xì)胞涌入血管，增強(qiáng)抗PD-1和抗CTLA4免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效[29]。再如，誘導(dǎo)HEV和基質(zhì)的形成，進(jìn)一步促進(jìn)抗腫瘤免疫細(xì)胞的聚集，從而導(dǎo)致腫瘤破壞[30]。這一新興技術(shù)未來(lái)可能被用于在免疫低的腫瘤和免疫高的腫瘤中誘導(dǎo)TLS，與抑制炎癥環(huán)境的治療藥物和/或免疫檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合使用，進(jìn)一步改進(jìn)某些患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)差的情況。

4 結(jié)束語(yǔ)

HCC作為一個(gè)炎癥驅(qū)動(dòng)型癌癥，在慢性炎癥刺激后，局部產(chǎn)生免疫細(xì)胞的非包膜性團(tuán)塊聚集，最終在各種趨化因子的作用下形成TLS，而TLS可能在肝細(xì)胞癌的不同區(qū)域中具有雙重預(yù)后作用。在肝癌間質(zhì)中的TLS提高了晚期復(fù)發(fā)率，而腫瘤內(nèi)成熟的TLS則降低早期復(fù)發(fā)率，提示良好的預(yù)后作用，在癌旁組織中的TLS則對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后無(wú)明顯的價(jià)值。

根據(jù)TLS的抗腫瘤免疫反應(yīng)的特征，將為HCC誘導(dǎo)良好的淋巴樣新生環(huán)境，從而有效促進(jìn)局部T細(xì)胞反應(yīng)和腫瘤消退。且有研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行免疫治療后有反應(yīng)的患者TLS密度比無(wú)反應(yīng)的患者高，可能在提高免疫治療的敏感性方面TLS也體現(xiàn)出了優(yōu)越性。因此，在將來(lái)的腫瘤治療中，我們可以試著通過(guò)各種方法誘導(dǎo)產(chǎn)生TLS，進(jìn)而提高免疫療效，尤其是對(duì)免疫力差的患者。所以隨著對(duì)HCC中的TLS研究的日益深入，免疫療法新靶點(diǎn)的出現(xiàn)會(huì)給肝癌患者帶來(lái)新的曙光。我們不僅可以通過(guò)檢測(cè)TLS來(lái)實(shí)現(xiàn)肝癌的早期診斷，還能提高肝癌患者的生存率，這將會(huì)是抗癌戰(zhàn)役的重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

由于TLS測(cè)定方法不同，耗時(shí)長(zhǎng)，主觀性強(qiáng)，難以用于臨床實(shí)踐，同時(shí)缺乏可重復(fù)和標(biāo)準(zhǔn)化的TLS識(shí)別方法。目前，TLS鑒定方法只能通過(guò)組織活檢進(jìn)行，然而，隨著全球公開(kāi)數(shù)據(jù)和人工智能的發(fā)展，使TLS識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)化成為可能，這是臨床實(shí)踐中對(duì)抗癌癥的一個(gè)有力武器。在將來(lái)對(duì)TLS的研究中，我們還可以尋找相關(guān)的標(biāo)志物，從外周組織(如血液、消化液，甚至排泄物)中識(shí)別某種特征，將減少患者損傷，提高檢測(cè)效率。