李順欣，郭姝羽，陳宇翔，郭振宇，賈雙赫，李海剛

1.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 口腔學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219

2.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219

3.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410219

三叉神經(jīng)痛是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，好發(fā)于中老年人，女性患病率高于男性[1]。主要癥狀為頭面部廣泛劇烈性疼痛，多發(fā)生于三叉神經(jīng)一個(gè)或多個(gè)分支處。三叉神經(jīng)痛分為原發(fā)性三叉神經(jīng)痛和繼發(fā)性三叉神經(jīng)痛。原發(fā)性三叉神經(jīng)痛尚未呈現(xiàn)出明顯的神經(jīng)系統(tǒng)體征，起病時(shí)檢查表明無器質(zhì)性及功能性病變[2]，其發(fā)生率約為0.052 2%[3]。原發(fā)性三叉神經(jīng)痛大鼠與正常大鼠相比：三叉神經(jīng)節(jié)中降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）及其受體表達(dá)升高，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及其磷酸化、炎性反應(yīng)增強(qiáng)等[4-5]。

目前治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛主要以藥物為主，抗癲癇藥物卡馬西平為其首選，初始有效率可達(dá)80%[6]。但長(zhǎng)期服用該藥物存在頭暈、皮疹、共濟(jì)失調(diào)等不良反應(yīng)，且具有快速耐受性[7]。采用手術(shù)方法治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛具有一定的療效，但該方法一定程度上無法改善某些患者疼痛程度，還可能發(fā)生復(fù)視、聽力減弱、漿液性腦膜炎等并發(fā)癥[8]。且2種方法治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛仍有超過50%的患者存在疼痛復(fù)發(fā)的現(xiàn)象[9]。復(fù)方中藥在治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛方面表現(xiàn)出較好的療效，具有更高的安全性和更低的復(fù)發(fā)率，存在良好的應(yīng)用價(jià)值。復(fù)方藜芍片由白芍、蒺藜、葛根、鉤藤、生丹參、珍珠母、白芷、白菊花、蔓荊子、薄荷10味中藥聯(lián)合制成，具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜等功效[10]。本研究探討復(fù)方藜芍片對(duì)大鼠原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重（200±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，每日12 h交替照明，飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本研究所有操作和步驟均通過長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核（批件號(hào)IACUC-20220309-02）。

1.1.2 主要儀器和試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Von Frey疼痛測(cè)試棒（美國(guó)DanMic Global公司）；PCR儀（北京東林昌盛生物科技有限公司）；BioTek酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）?？R西平片（批號(hào)H11O22279，諾華制藥）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA Kit（批號(hào)KE10002）、大鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA Kit（批號(hào)KE00021）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0012，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CGRP Rabbit pAb（批號(hào)A5542，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010，德國(guó)Merck Millipore公司）；磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶抗體（批號(hào)AF00879，湖南艾方生物科技有限公司）；HRPconjugated山羊抗小鼠IgG（批號(hào)GB23302）、HRPconjugated山羊抗兔IgG（批號(hào)GB23303）、山羊抗小鼠二抗（批號(hào)G1214-100UL）均購自Servicebio。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 復(fù)方藜芍片由10味中藥組成，將其熬制、合并提取液，并濃縮后得85 mL水提液（含藥材143 g，1 680 mg/mL），每100克體質(zhì)量大鼠ig給藥1 mL。中劑量組在此基礎(chǔ)上稀釋2倍即840 mg/kg，低劑量組依次稀釋即420 mg/kg[10]。

1.2.2 建模方法 術(shù)前禁食8 h，采用ip 0.4%戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉大鼠。備皮消毒，沿右側(cè)觸須墊部上緣處行約1 cm切口，分離筋膜、神經(jīng)，于眶下神經(jīng)處輕微結(jié)扎2次，每次相隔約2 mm[11]。待大鼠蘇醒并在安靜環(huán)境中穩(wěn)定30 min后，刺激術(shù)側(cè)觸須墊，大鼠出現(xiàn)躲避、攻擊、搔抓面部等陽性反應(yīng)1項(xiàng)或多項(xiàng)時(shí)的最小刺激值即機(jī)械痛敏閾值（MWT），若MWT顯著低于術(shù)前則可認(rèn)定造模成功[12]。

1.2.3 分組及給藥 60只原發(fā)性三叉神經(jīng)痛大鼠隨機(jī)分為5組，各組12只。模型組ig同等劑量生理鹽水；卡馬西平組根據(jù)大鼠體質(zhì)量ig 20 mg/kg的0.1 mL/kg卡馬西平溶液；復(fù)方藜芍片低、中、高劑量組分別按照體質(zhì)量ig 420、840、1 680 mg/kg復(fù)方藜芍片溶液，每日1次，持續(xù)給藥28 d。

1.2.4 MWT 使用Von Frey毛刷在建模前1 d、當(dāng)天及術(shù)后每天規(guī)定時(shí)間內(nèi)刺激大鼠術(shù)側(cè)胡須墊區(qū)，從最低的刺激力（0.008 g）開始逐漸增大，每個(gè)刺激力以30～60 s的間隔重復(fù)檢測(cè)6次，直至大鼠出現(xiàn)1項(xiàng)或多項(xiàng)陽性反應(yīng)，則認(rèn)為該刺激實(shí)驗(yàn)為陽性，即該閾值為有效刺激閾值。此時(shí)出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最小刺激力為術(shù)側(cè)面部MWT[12]。

1.2.5 ELISA檢測(cè)血清中TNF-α和IL-1β炎性因子水平 術(shù)后第29天麻醉，各組大鼠于腹主動(dòng)脈處采血，3 000 r/min離心15 min，抽取上層血清；按照試劑盒說明書的操作順序，進(jìn)行各個(gè)孔吸光度（A）值的測(cè)定。

1.2.6 q-PCR檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)中TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平變化 術(shù)后第29天，每組隨機(jī)抽取6只大鼠麻醉，取出術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)；在研磨組織樣本中加入Trizol提取總RNA；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，獲得溶解曲線，并利用溶解曲線計(jì)算出擴(kuò)增的特異性，基于Ct值，對(duì)照GAPDH引物序列，運(yùn)用2-ΔΔCt方法得出大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平。引物由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of each primer

1.2.7 Western blotting檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP表達(dá) 術(shù)后第29天，麻醉每組剩余的6只大鼠（q-PCR每組隨機(jī)抽取6只大鼠后），取出術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)，于液氮內(nèi)冷凍；稱重后將其放入勻漿器中，隨后加入含有PMSF的裂解液，以獲得其中的蛋白；注入5×Loading buffer，置于沸水中煮10 min，放置于-80 ℃冰箱內(nèi)；采用SDS-PAGE電泳技術(shù)，使蛋白從凝膠基質(zhì)轉(zhuǎn)移至合成膜支持物上，并與PVDF膜相結(jié)合，形成印跡；將PVDF膜放入含有TBST的抗體孵育盒中，4 ℃過夜，棄去液體；加入TBST適當(dāng)稀釋的一抗（1∶1 000），4 ℃過夜，棄去液體；加入TBST稀釋的二抗（1∶2 000），室溫孵育60 min。ECL曝光成像，采用Image J對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析并計(jì)算出CGRP蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 免疫組化檢測(cè)大腦紋狀體中p-p38 MAPK水平 術(shù)后第29天麻醉，取術(shù)側(cè)大腦紋狀體組織于4%多聚甲醛中；使用PBS緩沖液清洗組織，放入固定液中浸泡；取出組織并依次放入不同濃度的乙醇中脫水、二甲苯溶液中透明，石蠟包埋制成切片；將切片浸入pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐抗原修復(fù)8 min；切片放入0.01 mol/L PBS溶液中晃動(dòng)洗滌3 min×3；切片浸入3% H2O2×10 min中阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加5%羊血清，37 ℃封閉20 min；切片上滴入適當(dāng)稀釋的一抗（1∶100），置于濕盒內(nèi)，4 ℃冰箱過夜；滴加二抗，置于溫箱中30 min；使用DAB進(jìn)行顯色，室溫孵育5 min；浸于蘇木素溶液中復(fù)染3 min，PBS返藍(lán)。脫水透明，中性樹膠封片、顯微鏡下觀察。使用Image J軟件對(duì)切片圖像進(jìn)行累計(jì)光密度（IOD）分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MWT變化

術(shù)后當(dāng)天各組大鼠術(shù)側(cè)MWT與術(shù)前相比均顯著下降（P＜0.05），大鼠原發(fā)性三叉神經(jīng)痛模型造模成功。與模型組相比，給藥后第3天開始，卡馬西平組MWT顯著增加（P＜0.05、0.01），并持續(xù)至給藥終期，第28天卡馬西平組MWT值為14.17；給藥后第9～11天開始，復(fù)方藜芍片中、高劑量組MWT均明顯上升（P＜0.05）；與卡馬西平組相比，給藥第17～19天開始，復(fù)方藜芍片中、高劑量組MWT均顯著上升（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠術(shù)側(cè)面部MWT變化（，n=12）Fig.1 Changes in MWT on surgical side of rats in each group (,n=12)

2.2 血清中TNF-α和IL-1β水平變化

與模型組相比，卡馬西平組、復(fù)方藜芍片中、高劑量組血清中TNF-α、IL-1β水平明顯下降（P＜0.01），見圖2。

圖2 血清中TNF-α和IL-1β水平變化（，n=12）Fig.2 Comparison on TNF-α and IL-1β in serum level(,n=12)

2.3 三叉神經(jīng)節(jié)中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)水平變化

如圖3所示，與模型組相比，卡馬西平組、復(fù)方藜芍片中、高劑量組三叉神經(jīng)節(jié)中TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平顯著性降低（P＜0.01）。

圖3 術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)中TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)（，n=6）Fig.3 Expression of TNF-α and IL-1β mRNA in surgical trigeminal ganglion (,n=6)

2.4 三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP表達(dá)變化

與模型組相比，卡馬西平組和復(fù)方藜芍片各組三叉神經(jīng)節(jié)CGRP表達(dá)均明顯降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 術(shù)側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP的表達(dá)（，n=6）Fig.4 Expression of CGRP in surgical trigeminal ganglion(,n=6)

2.5 大腦紋狀體中p-p38 MAPK表達(dá)變化

如圖5所示，大腦紋狀體細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核中，p-p38 MAPK陽性表達(dá)為黃色或棕黃色染色。如圖6所示，模型組陽性染色顯著，p-p38 MAPK抗體明顯表達(dá)；與模型組相比，復(fù)方藜芍片中、高劑量組p-p38 MAPK表達(dá)顯著性下降（P＜0.01）。

圖5 紋狀體中p-p38MAPK表達(dá)（×40）Fig.5 Expression of p-p38 MAPK expression in the striatum (×40)

圖6 紋狀體中p-p38 MAPK表達(dá)（，n=12）Fig.6 Expression of p-p38 MAPK expression in the striatum(,n=12)

3 討論

三叉神經(jīng)痛是最常見的腦神經(jīng)疾病，疼痛發(fā)作具有區(qū)域性、單側(cè)性、劇烈性、頻率高度特異性以及間歇性等特點(diǎn)，其間隔從幾秒至幾年不等，但隨著時(shí)間的推移將逐漸縮短[13]。復(fù)方藜芍片由10味中藥聯(lián)合組成，諸藥配合具有活血化瘀、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、平肝潛陽、解痙的作用。復(fù)方藜芍片在臨床中應(yīng)用多年，能有效減輕偏頭痛的疼痛程度和發(fā)作頻率，且高達(dá)79.7%的有效率和較低的不良反應(yīng)率[14]，彰顯了復(fù)方藜芍片較好的治療效果。

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。病理生理學(xué)假說認(rèn)為，原發(fā)性三叉神經(jīng)痛是由于腦干附近的三叉神經(jīng)感覺根被血管近端壓迫所導(dǎo)致。神經(jīng)根的進(jìn)入?yún)^(qū)被認(rèn)為是易發(fā)生脫髓鞘的脆弱區(qū)域，而血管壓迫可能啟動(dòng)局灶性脫髓鞘和再髓鞘化過程[15-16]。臨床研究表明，原發(fā)性三叉神經(jīng)痛與癥狀側(cè)神經(jīng)受血管壓迫并伴有形態(tài)學(xué)改變存在一定的關(guān)聯(lián)性，而在無癥狀側(cè)少見[17]。故本實(shí)驗(yàn)采用慢性壓迫性損傷眶下神經(jīng)法建立大鼠原發(fā)性三叉神經(jīng)痛模型，模擬臨床三叉神經(jīng)受壓迫而引起痛覺超敏的表現(xiàn)，并定時(shí)測(cè)定術(shù)側(cè)大鼠MWT。研究發(fā)現(xiàn)：建模前1 d，各組大鼠MWT處于較高水平且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模型組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠面部疼痛加劇，導(dǎo)致機(jī)械痛閾急劇下降。而建模后第3天開始，卡馬西平組大鼠MWT與模型組相比顯著性上升。復(fù)方藜芍片中、高劑量治療后，大鼠的MWT升高，說明復(fù)方藜芍片中、高劑量可以改善大鼠原發(fā)性三叉神經(jīng)痛病理癥狀。

張學(xué)智等[18]研究發(fā)現(xiàn)，三叉神經(jīng)痛患者部分髓鞘受壓迫后變薄，并在三叉神經(jīng)病變中產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。炎性細(xì)胞大量聚集于神經(jīng)組織以及炎癥因子過度表達(dá)，可影響神經(jīng)病理性疼痛的疼痛程度[19]。TNF-α是炎癥反應(yīng)的起始因子，主要由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌，存在于中樞系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中。TNF-α具有極強(qiáng)的炎癥作用，可通過促進(jìn)Th1細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6等促炎因子，抑制IL-10等抗炎因子的釋放，加劇神經(jīng)組織的敏感性，并激活炎癥細(xì)胞，參與神經(jīng)性疼痛的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致患者出現(xiàn)疼痛難忍和痛覺過敏的現(xiàn)象[20-21]。IL-1β是一種強(qiáng)效的促炎細(xì)胞因子，主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，也可通過自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)自身的釋放。IL-1β可促進(jìn)5-羥色胺、P物質(zhì)等釋放，與致痛物質(zhì)共同作用，使得疼痛長(zhǎng)期存在[22]。大量炎癥介質(zhì)的釋放會(huì)觸發(fā)并維持中樞敏化，提升興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和降低抑制性突觸傳遞，產(chǎn)生痛覺過敏，并進(jìn)一步促進(jìn)外周敏化[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與卡馬西平組相比，模型組大鼠血清和三叉神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1β表達(dá)顯著性上升，提示炎癥因子在原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。復(fù)方藜芍片中、高劑量治療后大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平以及三叉神經(jīng)節(jié)中TNF-α、IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，提示復(fù)方藜芍片可通過抑制過度表達(dá)的炎癥因子，對(duì)原發(fā)性三叉神經(jīng)痛大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

三叉神經(jīng)末梢中含有多種免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，當(dāng)受到致病因素刺激后，此類細(xì)胞通過大量分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子[24]，造成神經(jīng)細(xì)胞炎性損傷，還能誘導(dǎo)脊髓后角釋放致痛炎性介質(zhì)CGRP等[25]，產(chǎn)生痛覺過敏。研究表明，三叉神經(jīng)痛模型大鼠血清中CGRP濃度明顯上升，說明CGRP與三叉神經(jīng)痛密切相關(guān)[26]。CGRP是一種具有傳遞痛覺信息和強(qiáng)烈舒張血管的神經(jīng)肽，其介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥并與相關(guān)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子相互作用，參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[27]。研究表明，CGRP在向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)痛覺和痛覺過敏的過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[28]。CGRP通過誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞以及三叉神經(jīng)細(xì)胞中P2X3、p38 MAPK等的表達(dá)水平，促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)過敏持續(xù)存在，起到傷害性遞質(zhì)的作用，同時(shí)通過促炎引起外周敏化，誘導(dǎo)疼痛產(chǎn)生[29]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，通過復(fù)方藜芍片治療后三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP表達(dá)含量顯著降低，表明復(fù)方藜芍片可能通過下調(diào)三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP水平，達(dá)到降低痛覺傳遞和痛覺增敏的效果。

p38 MAPK為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，主要分布于胞漿中，被應(yīng)激因素如炎癥因子、機(jī)械損傷等刺激激活后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，其通過誘導(dǎo)多種胞內(nèi)反應(yīng)參與神經(jīng)性疼痛和其他慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展[5]。當(dāng)p38 MAPK信號(hào)通路被激活后，炎癥因子的生成增多，p38 MAPK表達(dá)量顯著上升并發(fā)生磷酸化生成p-p38 MAPK[30]，主要表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及紋狀體中特有的斑片狀結(jié)構(gòu)。p-p38 MAPK過度表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重、神經(jīng)細(xì)胞壞死、組織水腫等負(fù)性損傷。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與模型組相比，復(fù)方藜芍片中、高劑量治療后大鼠大腦組織紋狀體中p-p38MAPK陽性表達(dá)顯著性降低。

綜上所述，復(fù)方藜芍片對(duì)原發(fā)性三叉神經(jīng)痛具有一定的治療效果，可顯著提升MWT，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)，降低CGRP和p-p38MAPK表達(dá)水平，為臨床上治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛提供科學(xué)參考和理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突