吳東霖，張鼎，秦紅玲，李姿，晏楊，胡躍強*

1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000

2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530001

3.成都市青白江區(qū)人民醫(yī)院，四川 成都 610500

阿爾茨海默病是神經(jīng)系統(tǒng)的一種進行性、退行性病變，以認知功能障礙、精神及行為異常為主要特征。阿爾茨海默病占所有癡呆類型的60%～80%，隨著人口老年化加劇，發(fā)病率逐年攀高，給社會及經(jīng)濟帶來重大負擔[1-2]。而其發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)主流治療藥物僅能部分改善癥狀，對預后和進展無逆轉(zhuǎn)延緩作用，而針對現(xiàn)知發(fā)病機制的Aβ形成抑制劑，Tau聚集抑制劑等在研藥物均未得到根本性突破，提示針對單一靶點、單一因素療效欠佳[3-5]。由于中藥具有多成分、多靶點的優(yōu)勢，現(xiàn)得到研究人員們廣泛關注[6]。

阿爾茨海默病屬于中醫(yī)學“癡呆”“呆病”范疇，《靈樞·經(jīng)脈》云：“人始生先成精，精成而腦髓生”，其病位在腦，核心病機為腎虛髓減，腎虛貫穿癡呆發(fā)病的始終，故溫補腎陽是逆轉(zhuǎn)病機的關鍵。蛇床子性辛、苦、溫，歸腎經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，言“主男子陰痿……癲癇，久服輕身”，內(nèi)服可溫腎壯陽，現(xiàn)代藥理研究表明，其主要藥效物質(zhì)為香豆素類及揮發(fā)油等，其提取物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)都具有顯著的影響[7]，本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術[8]探尋其治療阿爾茨海默病的作用機制，為后續(xù)臨床治療方案提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛇床子活性成分及靶點篩選

運用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“蛇床子”為關鍵詞檢索其活性成分，選取口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的活性成分，同時考慮到蛇床子的主要化學成分存在揮發(fā)油，查閱文獻報道[7]進行藥物活性成分的補充，加入化學成分蛇床子素。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫預測活性成分靶點，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點名稱標準化處理并去重。

1.2 疾病靶點收集

通過GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞獲取相關疾病靶點，將各數(shù)據(jù)庫結果合并去重后，與蛇床子潛在靶點取交集，獲取共同靶點。

1.3 蛇床子治療阿爾茨海默病的“成分-靶點”網(wǎng)絡圖構建及核心活性成分篩選

將“蛇床子-阿爾茨海默病”的共同靶點信息及活性成分導入Cytoscape軟件中進行可視化處理構建“成分-靶點”網(wǎng)絡，通過Network Analyzer插件進行網(wǎng)絡分析，根據(jù)degree值進行排序，取排名前5位的活性成分作為蛇床子核心活性成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖構建與分析

將共同靶點信息導入STRING數(shù)據(jù)庫中，設定物種為“Homo sapiens”，去除游離節(jié)點，生成PPI網(wǎng)絡圖，將網(wǎng)絡圖文件導入Cytoscape軟件使用Cyto NCA插件進行網(wǎng)絡分析，根據(jù)degree值、中介值（BC）、緊密值（CC）篩選核心靶點并進行可視化。

1.5 基因本體（GO）功能分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

使用R語言，調(diào)用ClusterProfiler等函數(shù)包對蛇床子與阿爾茨海默病共同靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，按照矯正后的P值進行排序，并將得到的結果通過柱狀圖及弦圖進行可視化展示。

1.6 分子對接驗證

在PPI網(wǎng)絡中選取排名為前5位的關鍵靶點和蛇床子中前5位的核心成分進行分子對接，借助pubchem數(shù)據(jù)庫下載活性成分2D結構，使用Chem3D以最小自由能優(yōu)化轉(zhuǎn)換成最優(yōu)3D結構，通過AutoDock Tools將活性成分轉(zhuǎn)換成pdbqt文件，在PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白3D結構，Pymol軟件對蛋白質(zhì)受體預處理后，保存為pdbqt文件，最后用AutoDock Vina軟件進行分子對接，將各結合能結果通過熱圖展示，并選擇結合能最低的4個模型用Pymol軟件進行結構展示。

2 結果

2.1 蛇床子活性成分和潛在靶點預測

檢索數(shù)據(jù)庫并通過查詢相關文獻后共得到蛇床子主要成分20個，見表1。利用TCMSP平臺預測有效成分對應靶點，合并去重并經(jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫標準化注釋后得到對應靶點62個。

表1 蛇床子活性成分Table 1 Main active components of Cnidii Fructus

2.2 蛇床子防治阿爾茨海默病的潛在作用靶點

檢索GeneCards、OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫，分別得到阿爾茨海默病相關靶點數(shù)為13 564、144、3 397個，合并去重后共得到14 197個。運用Rx4.2.2軟件Venn包，將藥物靶點與疾病靶點導入后，共得到56個共同作用交集靶點，見圖1。

圖1 蛇床子治療阿爾茨海默病的交集靶點Venn圖Fig.1 Venn diagram of intersection target of Cnidii Fructus for Alzheimer’s disease

2.3 “成分-靶點”網(wǎng)絡圖構建及蛇床子核心活性成分篩選

將“蛇床子-阿爾茨海默病”共同靶點及其對應的藥物活性成分導入Cytoscape 3.7.1，并繪制“成分-靶點”網(wǎng)絡圖，見圖2，該網(wǎng)絡有75個節(jié)點、185條邊。通過Network analyzer分析網(wǎng)絡后按degree值排序，排名前5位的成分作為蛇床子的核心活性成分，分別是β-谷甾醇、豆甾醇、鄰-異戊酰基二氫山芹醇、O-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床子素。

圖2 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡Fig.2 “Active ingredient-common target” network

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選

將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫中，得到如圖3所示的靶點蛋白PPI網(wǎng)絡，使用Cytoscape對網(wǎng)絡圖進行核心靶點的分析，該網(wǎng)絡共有51個節(jié)點和270條邊，借助CytoNCA插件分析各節(jié)點得到degree、BC、CC，進行2次篩選，以同時大于每項2倍均值為篩選條件，最終得到靶點蛋白共7個（圖4），其中degree值排名前5位的即為核心靶點，分別為B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、雌激素受體α（ESR1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）、半胱氨酸蛋白水解酶3（CASP3），見表2。

圖3 核心靶點基因PPI網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network of the core intersection targets

圖4 關鍵靶點篩選過程Fig.4 Screening process on key targets

表2 核心靶點Table 2 Key targets

2.5 GO功能分析

使用R語言進行GO富集分析，共得到相關條目共1 228條，其中生物過程（BP）1 014條，主要涉及乙酰膽堿反應、對異種刺激的反應、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶-調(diào)節(jié)G蛋白-偶聯(lián)受體信號通路、乙酰膽堿受體信號通路等；細胞組分（CC）78條，主要作用于突觸后膜、突觸前膜組成部分、突觸膜、突觸前膜的內(nèi)在成分、突觸前膜等；分子功能（MF）136條，主要涉及G蛋白-偶聯(lián)胺受體活性、G蛋白-偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、乙酰膽堿受體活性、核受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與的凋亡信號通路等。分別選取BP、CC、MF的前10個條目借助柱狀圖展示，見圖5。提示蛇床子可通過調(diào)控多種生物學過程對阿爾茨海默病發(fā)揮治療作用。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 Go function enrichment analysis

2.6 KEGG通路富集分析

進行KEGG富集分析，共得到90條通路，將前30條結果進行可視化展示，見圖6。結果顯示，蛇床子治療阿爾茨海默病的靶點所富集的通路主要包括神經(jīng)活性配體-受體的相互作用、鈣信號通路、p53信號通路、多種細胞凋亡通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、白細胞介素（IL）-17信號通路等，推測這些通路為蛇床子發(fā)揮治療作用的關鍵通路。

2.7 分子對接結果

為證明藥物活性成分與疾病靶點蛋白間的結合活性，選取蛇床子治療阿爾茨海默病得分前5位的核心成分β-谷甾醇、豆甾醇、鄰-異戊?；渖角鄞肌-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床子素與核心靶點Bcl-2 ESR1、PTGS2、GSK3B、CASP3分別進行分子對接，見圖7。將對接結合能最小的4組組合進行三維結構成像，見圖8。結果提示，化合物與受體蛋白之間形成多個氫鍵以提高結合的穩(wěn)定性。一般認為，結合能≤-5.0 kcal/mol（1 cal＝4.2 J）時結合較穩(wěn)固，結合能≤-7.0 kcal/mol時結合非常穩(wěn)固[9-10]。對接結果顯示，受體與配體之間的結合能均≤-5.0 kcal/mol，可見蛇床子核心成分與關鍵靶點蛋白間的結合性良好，預測結果具備一定可靠性，而結合能≤-7.0 kcal/mol共有10組，大多集中于GSK3B、PTGS2、Bcl-2與核心活性成分O-乙酰二氫歐山芹酯、鄰-異戊酰基二氫山芹醇、蛇床子素的結合。

圖7 核心化合物與關鍵受體蛋白分子對接結合能熱圖Fig.7 Affinity heat map of molecular docking results

圖8 主要活性成分與核心靶點蛋白分子對接模式圖Fig.8 Docking model diagram of key compounds and core target protein molecules

3 討論

阿爾茨海默病發(fā)病復雜，發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)已知的機制假說包括Aβ異常堆積、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應激、神經(jīng)炎性反應等[11]，其機制復雜，目前對于該疾病的治療仍存在一定的限制和挑戰(zhàn)。近年來，中醫(yī)藥治療阿爾茨海默病取得了顯著效果且在臨床上的應用也越加廣泛，體現(xiàn)了中醫(yī)藥的優(yōu)勢[12]?！夺t(yī)學心悟》云：“腎主智，腎虛則智不足”，阿爾茨海默病病機為本虛標實，根據(jù)病機證候分析，張學凱等[13]認為阿爾茨海默病存在證候級聯(lián)，即“啟動于腎虛，進展于痰、瘀、火，惡化于虛極毒盛”，其中腎虛是啟動因子并貫穿疾病發(fā)展始終，因此選方用藥常不離補腎。蛇床子作為一種補虛藥，具有溫腎壯陽之功，現(xiàn)代藥理學研究已證實，其對于神經(jīng)系統(tǒng)方面改善學習記憶功能的作用是確切的[14]，然而其成分復雜，具有多成分、多靶點的特征，目前關于蛇床子治療阿爾茨海默病的作用機制研究較少，尚不明確。中藥由于自身成分的復雜性，傳統(tǒng)功效分析方法難以適應，因此本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法對蛇床子治療阿爾茨海默病的活性成分、靶點、通路等進行預測。

基于藥物成分分析結果，蛇床子治療阿爾茨海默病的核心活性成分為β-谷甾醇、豆甾醇、鄰-異戊酰基二氫山芹醇、O-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床子素。其中蛇床子素作為蛇床子的主要活性成分之一，在體外和體內(nèi)對阿爾茨海默病都能發(fā)揮強大的神經(jīng)保護作用。Li等[15]發(fā)現(xiàn)蛇床子素可通過上調(diào)MicroRNA-9并在體外抑制Notch信號通路，減少Aβ蛋白的產(chǎn)生挽救海馬神經(jīng)元的功能損傷，顯著恢復阿爾茨海默病小鼠認知功能；也可通過調(diào)控P13K/Akt/GSK3β信號通路，降低小鼠腦內(nèi)Tau蛋白ser202位點的過度磷酸化，從而減輕海馬CA3區(qū)的病理性損傷改善阿爾茨海默病小鼠的認知學習能力[16]。β-谷甾醇、豆甾醇都屬于植物甾醇，具有抗炎、抗氧化等作用[17]。β-谷甾醇在體內(nèi)外有顯著的膽堿酯酶抑制作用和自由基清除能力，從而顯著改善阿爾茨海默病引起的記憶行為障礙[18]；同時其也可較容易穿過血腦屏障，抑制Tau蛋白聚集[19]。王星燁等[20]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可能抑制IL-17-p53信號通路，減輕神經(jīng)炎癥并抑制細胞凋亡，進而改善阿爾茨海默病模型小鼠的認知功能。而豆甾醇可激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）的表達水平，減輕抑制阿爾茨海默病過程中氧化應激反應從而減輕神經(jīng)退行性變[21]。鄰-異戊?；渖角鄞?、O-乙酰二氫歐山芹酯屬于香豆素類物質(zhì)，香豆素類物質(zhì)在抗炎、神經(jīng)保護都有很好的治療效果[22]，有研究指出香豆素類物質(zhì)可通過抑制小鼠海馬半球中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）相關的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路起到神經(jīng)保護作用?？梢钥闯鲞@些藥物核心化合物都是通過多種途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用，雖然存在結構的差異，但是作用卻是相似的，可能是作用的通路相似但靶點有異，從而發(fā)揮協(xié)同作用。

通過PPI網(wǎng)絡分析，蛇床子治療阿爾茨海默病的作用靶點主要為Bcl-2、ESR1、PTGS2、GSK3B、CASP3等。Bcl-2是一種主要位于線粒體中的抗凋亡蛋白[23]，主要通過控制線粒體膜離子的通透性以及相關凋亡因子的釋放，在線粒體凋亡通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用。細胞凋亡是細胞按照特定基因程序結束自身的過程，其誘發(fā)的神經(jīng)元丟失是阿爾茨海默病的病理特征之一。CASP3是凋亡通路中的下游死亡執(zhí)行蛋白酶，被認為是一切細胞凋亡信號傳導的共同通路，在凋亡級聯(lián)反應中起樞紐作用。通過對阿爾茨海默病病例觀察，CASP3在突觸處選擇性富集，同時活性CASP3表達水平顯著增加，與患者進行性突出變性最終導致的突觸喪失密切相關[24]。而Bcl-2可以作用于CASP3的上游，同時也是與CASP3相結合產(chǎn)生效應的直接底物，在阿爾茨海默病的發(fā)展中，Bcl-2可抑制CASP3的活性，阻止Tau蛋白的聚集減緩阿爾茨海默病疾病進展，也可直接穩(wěn)定微管，保護神經(jīng)元骨架的穩(wěn)定性[25-26]。這些研究提示蛇床子可能通過調(diào)控細胞凋亡通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。ESR1屬于雌激素受體之一，通過對雌激素受體的調(diào)控可調(diào)節(jié)雌激素的表達。據(jù)報道，女性阿爾茨海默病的風險較男性更高，性別可作為患病的獨立危險因素[27]，這提示可能與雌激素變化相關?，F(xiàn)已證明雌激素可通過下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥細胞因子，同時也可以對抗阿爾茨海默病中Aβ或過度磷酸化的Tau蛋白相關的線粒體功能障礙，從而對包括阿爾茨海默病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病具有神經(jīng)保護作用[28-29]。PTGS2是前列腺素合成的關鍵酶，在機體的炎癥和免疫功能中發(fā)揮關鍵作用。流行病學指出由于應用非甾體類抗炎藥的緣故，類風濕關節(jié)炎和阿爾茨海默病的共患率很低[30]。PTGS2特異性抑制劑羅非昔布的應用可以參與APP代謝的調(diào)節(jié)，抑制β-分泌酶和γ-分泌酶的活性，減少Aβ蛋白異常沉積和老年斑的形成，起到延緩阿爾茨海默病發(fā)生和發(fā)展的作用[31]。腦部的慢性炎癥作為阿爾茨海默病的一項重要病理特征，PTGS2的失調(diào)會明顯影響β-淀粉樣蛋白前體蛋白的異常裂解，β-淀粉樣斑塊中Aβ的聚集和沉積以及過度磷酸化的Tau蛋白所形成的神經(jīng)元纖維纏結。大量研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β在阿爾茨海默病患者的大腦中過度活躍[32]，在體內(nèi)外的動物阿爾茨海默病模型中，已觀察到該激酶的失調(diào)會影響Aβ蛋白和Tau蛋白代謝以及毒性，同時GSK-3β的活性也與記憶、神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)炎癥密切相關，近年來已作為阿爾茨海默病治療新方法的可能靶標。

GO富集分析提示，潛在治療靶點主要富集在對異種刺激的反應、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶-調(diào)節(jié)G蛋白-偶聯(lián)受體信號通路等過程，這些生物過程與機體的炎癥反應和細胞凋亡相關，與KEGG富集出的PI3K/Akt信號通路、p53信號通路和細胞凋亡信號通路相吻合。此外KEGG還提示蛇床子治療阿爾茨海默病的作用機制可能與鈣信號通路等相關。核心蛋白與核心活性成分分子對接結合能均≤-5.0 kcal/mol，表示蛇床子核心化合物與核心受體蛋白之間有良好的結合活性，可以起到治療阿爾茨海默病的作用；核心化合物與核心蛋白之間有較強結合活性，結合能≤-7.0 kcal/mol的結果集中于GSK3B、PTGS2、Bcl-2與關鍵活性成分O-乙酰二氫歐山芹酯、鄰-異戊?；渖角鄞?、蛇床子素的組合中，表明蛇床子治療阿爾茨海默病可能與GSK3B、PTGS2、Bcl-2的相關性更密切，而作為受體蛋白GSK3B、Bcl-2與O-乙酰二氫歐山芹酯、鄰-異戊酰基二氫山芹醇、蛇床子素的結合能更低，提示蛇床子通過發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎可能是O-乙酰二氫歐山芹酯、鄰-異戊?；渖角鄞?、蛇床子素，同時對GSK3B、Bcl-2的調(diào)節(jié)在治療阿爾茨海默病中發(fā)揮重要作用?？梢酝茰y蛇床子活性成分可能通過調(diào)控PI3K/Akt/GSK-3β/p53信號通路，或Bcl-2/Caspase 3信號通路發(fā)揮治療作用。

綜上所述，蛇床子中核心成分β-谷甾醇、豆甾醇、鄰-異戊酰基二氫山芹醇、O-乙酰二氫歐山芹酯、蛇床子素等可能通過PI3K/Akt信號通路、p53信號通路和細胞凋亡等多種信號通路，作用于Bcl-2、ESR1、PTGS2、GSK3B、CASP3等靶點發(fā)揮作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突