王彥林

中國福利會國際和平婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（上海 200030）

近10 余年，伴隨醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速進(jìn)步，尤其是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)與宮內(nèi)操作技術(shù)的飛躍式發(fā)展，一批新技術(shù)應(yīng)用于圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)臨床，改變了產(chǎn)前診斷與胎兒醫(yī)學(xué)的面貌。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）、染色體微陣列（chromosomal micro-array，CMA）、外顯組測序（exome sequencing，ES）等遺傳學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用，高分辨影像學(xué)技術(shù)在胎兒疾病診斷中的應(yīng)用，胎兒宮內(nèi)治療技術(shù)以及產(chǎn)房外科治療（ex-utero intrapartum treatment，EXIT）技術(shù)日新月異，將既往的縱向?qū)W科鏈胎兒-新生兒-兒科理念推向整合，宮內(nèi)兒科學(xué)應(yīng)運(yùn)而生[1]。圍產(chǎn)醫(yī)療的重心不斷向母胎雙重關(guān)注方向轉(zhuǎn)移。

NIPT 是過去10 余年里產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的重大突破。NIPT 大幅提升了唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的靈敏度和特異度，在臨床得到廣泛應(yīng)用。低深度基因組測序技術(shù)的特點(diǎn)賦予了NIPT 唐氏綜合征篩查以外的更多潛力，但是也給結(jié)果解讀和臨床處理帶來了極大的復(fù)雜性。一方面，NIPT 在未來必將應(yīng)用于更為廣泛的領(lǐng)域；另一方面，臨床上關(guān)于NIPT 的許多應(yīng)用存在許多相對模糊的區(qū)域。NIPT 依然面臨許多實(shí)際問題和困惑，需要更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)加以厘清，以導(dǎo)向更為科學(xué)的臨床實(shí)踐。

1 高齡及合并多種高危因素雙胎妊娠的NIPT選擇

NIPT 目前已作為低危雙胎人群非整倍體一線篩查方案[2]。然而迄今為止，對于什么是雙胎妊娠的“高齡”及“高危人群”則并無界定。通常對于單胎，基于非整倍體發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，將分娩時(shí)≥35 歲定義為高齡人群，而對于雙胎，既往將32 歲作為高齡的界限[3]。NIPT 的出現(xiàn)模糊了“高齡”作為產(chǎn)前診斷指征的界限，而基于輔助生育技術(shù)的二代、三代試管雙胎，以及“高齡”雙胎，雖然一直是業(yè)界共識需要后續(xù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷的人群，但是這些人群也是最希望規(guī)避侵入性操作風(fēng)險(xiǎn)的孕婦。雖然羊水CMA 和ES 能夠獲得比NIPT 更多信息，但是產(chǎn)前診斷也必須考慮風(fēng)險(xiǎn)的必要性。對于“高危”或者“高齡”孕婦，CMA 與ES 相比NIPT 所能獲得邊際效應(yīng)需要充分的臨床研究證據(jù)，以評價(jià)這部分孕婦承受侵入性檢測風(fēng)險(xiǎn)接受產(chǎn)前診斷是否確實(shí)有益。

2 雙胎之一早期消失的NIPT最佳時(shí)機(jī)

輔助生殖技術(shù)是雙胎的重要來源之一。伴隨輔助生殖技術(shù)的推廣，雙胎之一早期消失發(fā)生率達(dá)到了15%～30%[4]，成為NIPT假陽性、假陰性以及重抽血率增加的重要因素之一。這一情況臨床常見，因此諸多研究團(tuán)隊(duì)都在試圖攻克這一難題。然而，當(dāng)前沒有足夠的數(shù)據(jù)來全面評估消失雙胎NIPT的表現(xiàn)。通常的臨床共識是一胎消失后8周進(jìn)行NIPT檢測。筆者與張靜瀾博士團(tuán)隊(duì)[5]之前針對不同孕周不同絨毛膜性減胎人群的研究發(fā)現(xiàn)，通過胎兒特異性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的數(shù)量和等位基因分?jǐn)?shù)不但可以檢測卵子捐贈、污染和雙胞胎完整的葡萄胎等復(fù)雜妊娠，同時(shí)發(fā)現(xiàn)約80%(7/9)未發(fā)育雙胎的游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）在減胎7周后下降，而67%(6/9)的幸存胎兒cffDNA 在減胎2 天內(nèi)立即增加。8 周是否是合適的雙胎之一消失后的NIPT檢測時(shí)間，是否需要等待更長時(shí)間以提高NIPT檢測的準(zhǔn)確性，尚缺乏足夠的證據(jù)。

3 NIPT異常結(jié)果對妊娠合并惡性腫瘤的提示作用

外周血游離DNA 不但包括來自胎兒的DNA，也可能包括來自惡性腫瘤細(xì)胞的DNA。因此，在妊娠患者基于NIPT的胎兒風(fēng)險(xiǎn)評估中，也可以檢測到源自母體腫瘤的DNA 序列。多條染色體非整倍體（multiple chromosome aneuploidies，MCAs）是NIPT檢測失敗或者結(jié)果異常的最常見原因之一，也是提示隱匿性母體惡性腫瘤最常報(bào)告的NIPT異常。2015年，Bianchi等[6]總結(jié)了125 426例NIPT檢測隊(duì)列，其中共報(bào)道了39例MCAs結(jié)果，發(fā)生概率為萬分之3。其中7例確診為妊娠合并惡性腫瘤。國內(nèi)學(xué)者針對193萬例NIPT檢測的回顧性研究中共發(fā)現(xiàn)639例MCAs的孕婦，其發(fā)生比例與Bianchi團(tuán)隊(duì)報(bào)道一致，并從中診斷了41例妊娠合并惡性腫瘤患者[7]。

現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，NIPT檢測發(fā)現(xiàn)的MCAs與妊娠合并惡性腫瘤存在相關(guān)性。當(dāng)NIPT成為針對唐氏綜合征的一線篩查方法之后，勢必需要更有效的方法對孕婦是否合并惡性腫瘤進(jìn)行評估。上述國內(nèi)學(xué)者的研究分析了所有MCAs孕婦的CNV數(shù)據(jù)，以CNV區(qū)域在整個(gè)基因組中的占比（fraction of CNV，F(xiàn)CNV）為標(biāo)志物對MCAs孕婦罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分級，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FCNV 對MCAs 孕婦的惡性腫瘤陽性預(yù)測值可以達(dá)到30%；如進(jìn)一步結(jié)合血漿生化腫瘤標(biāo)志物后，陽性預(yù)測值可達(dá)到75%。但是，這一模型在臨床實(shí)際應(yīng)用的效果究竟如何尚無評價(jià)數(shù)據(jù)。NIPT檢測到的惡性腫瘤中構(gòu)成比較高的是淋巴瘤、乳腺癌和消化道腫瘤，超聲、磁共振成像和內(nèi)鏡等影像學(xué)技術(shù)在后續(xù)診斷中的作用非常重要。但是，目前對這類孕婦的臨床綜合評價(jià)尚無可參考的規(guī)范，也缺乏系統(tǒng)的評估體系。其中尤為重要的是，當(dāng)報(bào)告孕婦存在合并惡性腫瘤高風(fēng)險(xiǎn)后，將對其帶來極大的心理壓力，使之產(chǎn)生焦慮、抑郁等情緒，影響母嬰安全。在缺乏系統(tǒng)性評價(jià)體系的情況下，報(bào)告此類風(fēng)險(xiǎn)，將帶來很大的倫理問題。

4 性染色體異常的倫理思考

雖然NIPT 的目標(biāo)疾病是唐氏綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征，但是性染色體異常從一開始就以附加報(bào)告的形式出現(xiàn)。性染色體異常種類多，并且嵌合的發(fā)生率高，其在染色體非整倍體中構(gòu)成比最高。但是與唐氏綜合征等疾病不同，性染色體異常大多并不屬于嚴(yán)重致殘致畸的疾病。Turner綜合征和Klinefelter綜合征以影響生育為主要表現(xiàn)，而47,XXX綜合征則可能不產(chǎn)生任何臨床可見的表型。此外，性染色體異常由于存在嵌合、X染色體失活等因素，其表型變異多，異質(zhì)性很大。

產(chǎn)前診斷往往以終止嚴(yán)重發(fā)育異常胎兒的妊娠為最終目的，出于倫理考量，對于性染色體異常的NIPT結(jié)果是否報(bào)告存在較多爭議。許多國家并不將性染色體列入NIPT篩查范圍。歐洲人類遺傳學(xué)會和美國人類遺傳學(xué)會聯(lián)合聲明，反對NIPT對性染色體進(jìn)行篩查[8]。國際產(chǎn)前診斷學(xué)會、澳大利亞和新西蘭皇家婦產(chǎn)科學(xué)院聲明，性染色體篩查需在知情同意下有選擇的進(jìn)行。

不可否認(rèn)的現(xiàn)狀是，在我們現(xiàn)有NIPT陽性報(bào)告中，診室的空間及時(shí)間資源有將近一半被這一類報(bào)告占據(jù)。因此，我們所面對的問題并非是否報(bào)道性染色體異常結(jié)果（在目前的現(xiàn)實(shí)情況下討論這一問題是不切實(shí)際的），而是怎樣在遺傳咨詢的過程中提供科學(xué)的決策依據(jù)。以宮內(nèi)兒科學(xué)的理念處理這一問題，需要咨詢醫(yī)師在面對孕婦的同時(shí)，也為尚未出生的胎兒負(fù)責(zé)。實(shí)際上，在真實(shí)世界中只有25%的Klinefelter綜合征患者因一系列問題就診[9]，這是否意味著許多性染色體異常的胎兒出生后并不會面臨實(shí)際的問題？通過顯微外科和輔助生育等手段，一些Klinefelter 綜合征的患者也能獲得生育能力。因此對于這類患者，亟需大樣本的縱向研究或橫斷面研究回答在現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)介入的情況下，他們在性功能、生育、學(xué)業(yè)、就業(yè)等方面的真實(shí)情況，而非籠統(tǒng)地以“不能生育”進(jìn)行總結(jié)。這些都是正確處理性染色體異常的NIPT 結(jié)果、提供科學(xué)遺傳咨詢意見、進(jìn)行充分知情選擇的必備功課。

5 單基因疾病無創(chuàng)產(chǎn)前篩查真正應(yīng)用于臨床的困境

雖然NIPT 從唐氏綜合征擴(kuò)展到包括基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）等一系列異常，但是其所針對的依然是染色體結(jié)構(gòu)異常和微缺失、微重復(fù)綜合征。由于NIPT 低深度NGS 的特點(diǎn)以及cffDNA 在孕婦外周血中的低濃度，傳統(tǒng)的NIPT 技術(shù)難以對胎兒單基因疾病進(jìn)行篩查。針對胎兒單基因遺傳病的無創(chuàng)檢測目前主要遵循兩種策略。

一種是針對胎兒與母親的差異序列進(jìn)行檢測，即胎兒的基因變異為新發(fā)變異，或者為遺傳自父親的變異。這一情況下由于排除了母親同源序列的位點(diǎn)干擾，適當(dāng)加深測序深度，采用針對性的數(shù)據(jù)解讀程序，就能對胎兒是否攜帶某個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行檢測。2011年英國國家醫(yī)療體系（UK National Health Service,NHS）首次批準(zhǔn)NIPT用于胎兒性別確定以及Rh陰性孕婦胎兒Rh血型的臨床鑒定[10-14]。2012年NHS批準(zhǔn)NIPT用于FGFR3基因變異導(dǎo)致的軟骨發(fā)育不全和致死性發(fā)育不良[15]。2014年，NHS批準(zhǔn)基于NGS的NIPT技術(shù)進(jìn)行多個(gè)基因的父源或顯性新發(fā)變異檢測[16]。貝勒醫(yī)學(xué)院于2021年發(fā)表一項(xiàng)基于NGS技術(shù)、包含25種顯性單基因病、30個(gè)基因檢測的前瞻性研究，共納入2 208名孕婦，結(jié)果顯示陽性率高達(dá)5.7%，在有隨訪結(jié)局的65 例中沒有發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性案例[17]。2022年復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院徐晨明教授團(tuán)隊(duì)采用協(xié)調(diào)等位基因感知靶標(biāo)富集測序（coordinative allele-aware target enrichment sequencing，COATE-seq）同時(shí)進(jìn)行拷貝數(shù)變異和顯性單基因病檢測，在入組的1 129名孕婦中，檢測到54例胎兒非整倍體、8例微缺失/微重復(fù)和8例單基因變異，靈敏度為100%，特異度為99.3%[18]。

去年11月，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志同期發(fā)表了兩篇通訊[19-20]，分別介紹了采用深度家系外顯組測序和高分辨率無創(chuàng)胎兒外顯組篩查的方法，深度家系外顯組測序能夠在完成攜帶者篩查的同時(shí)，準(zhǔn)確檢出胎兒與母親的差異位點(diǎn)，而高分辨外顯組篩查方法也可以實(shí)現(xiàn)對各胎齡胎兒新發(fā)變異的準(zhǔn)確檢出。

不同于差異性序列分析，對于母親攜帶相同致病變異的胎兒（如常染色體隱性遺傳病或者X 連鎖隱性遺傳?。捎跈z測分辨率的問題，目前無法通過直接測量方法對胎兒的基因型做出判斷?；趧┝渴Ш庥?jì)算胎兒的單倍型是主要的技術(shù)手段。劑量失衡計(jì)算方法主要包括相對變異劑量（relative mutation dosage，RMD）計(jì)算和相對單倍型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）計(jì)算兩種。RHDO在多種疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中被報(bào)道，但是這種方法需要先證者的樣本來確定父母的單倍型，因此僅限于再發(fā)預(yù)防。然而，有先證者的家庭一般傾向于高估風(fēng)險(xiǎn)，更愿意選擇產(chǎn)前診斷。目前很多研究的目標(biāo)是開發(fā)無先證者的 RHDO，長度長測序等技術(shù)可能在此領(lǐng)域產(chǎn)生突破。此外，增加胎兒DNA 濃度結(jié)合靶向測序的方法，也可能是另一條路徑。前述高分辨率無創(chuàng)胎兒外顯組篩查的研究顯示，在cffDNA占比超過20%時(shí)，可以檢測出胎兒是否攜帶母系遺傳的變異。

6 非cffDNA來源的NIPT新方法臨床應(yīng)用的潛力

臨床目前采用的NIPT 基于cffDNA 的低深度NGS，不區(qū)分來自胎兒的DNA與來自母親的DNA，因此有其方法學(xué)上的局限。有學(xué)者在探索采用其他來源的胎兒遺傳物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)類似基于cffDNA 的NIPT功能，并且獲得cffDNA所不包含的信息。其中，基于細(xì)胞的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（cell-based NIPT,cbNIPT）是研究較多的一種方法。在妊娠期間需要常規(guī)進(jìn)行宮頸細(xì)胞篩查。宮頸細(xì)胞檢查時(shí)采集宮頸黏液，可以采用特殊的方式富集出高純度的滋養(yǎng)層細(xì)胞（trophoblast retrieval and isolation from the cervix,TRIC）。TRIC 來自于胎盤，對于胎兒基因組有高度代表性。有研究發(fā)現(xiàn)，通過TRIC，早在妊娠5周即可檢測常見的三體，還可檢測三倍體、缺失、重復(fù)、不平衡結(jié)構(gòu)重排、鑲嵌、罕見常染色體三體性、局限性胎盤嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)及單基因疾病等[21]。與cffDNA不同，基于TRIC的檢測還能獲得與胎盤功能和產(chǎn)科并發(fā)癥相關(guān)的信息。有研究認(rèn)為，與胎盤形成相關(guān)的妊娠晚期并發(fā)癥會影響TRIC細(xì)胞數(shù)，從而可能通過TRIC細(xì)胞數(shù)的變化對妊娠晚期并發(fā)癥作出預(yù)測。由于TRIC獲得較為容易，同時(shí)擁有cffDNA所不包含的信息，因此有可能成為未來NIPT發(fā)展的另一條路徑。

7 結(jié)語

NIPT 技術(shù)的進(jìn)化和多元化，如增加測序深度、采用外顯組測序或目標(biāo)片段捕獲測序方法、利用非cffDNA來源的胎兒信息進(jìn)行檢測等，都將使得NIPT邁進(jìn)更好的十年。而這只是胎兒醫(yī)學(xué)發(fā)展之一斑，近年興起的宮內(nèi)兒科學(xué)錨定的目標(biāo)是從篩查診斷為主，發(fā)展為篩查、診治并重。產(chǎn)前診斷不再以終止妊娠為目的，開展合適的治療和干預(yù)措施、改善預(yù)后、挽救胎兒成為了與診斷緊密伴隨的目標(biāo)。本刊同期組稿的幾篇文章，分別從我國胎兒鏡配置和使用的現(xiàn)狀、重癥胎兒膈疝的宮內(nèi)治療、宮內(nèi)心臟介入手術(shù)等多個(gè)不同的角度，探討了胎兒疾病的宮內(nèi)治療。未來的圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)必然更依賴于多學(xué)科交叉與協(xié)作，而在此過程中更需不斷發(fā)展新技術(shù)，解決臨床問題。如同NIPT在過去十年來所取得的成就一般，在新的十年里，以NIPT為代表的篩查技術(shù)，與更多前沿宮內(nèi)治療技術(shù)相結(jié)合，將能為醫(yī)治胎兒帶來新的希望和可能。