庫得來提·阿不都克力木 ,董紅賓,多力昆·吾甫爾

自20世紀(jì)80年代第一次提出“組織工程”的概念后,因其打破外科“用創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”的傳統(tǒng)觀念,開創(chuàng)了通過“生物支架、干細(xì)胞、生長因子”結(jié)合修復(fù)創(chuàng)傷的新模式,從而受到生命科學(xué)界廣泛關(guān)注[1]。這種新型模式通過在體外用預(yù)先構(gòu)建一個有生物活性的植入體,并將其植入體內(nèi)以修復(fù)組織缺損及缺損處的生理功能。殼聚糖優(yōu)良的生物相容性、黏膜黏附性、生物降解性、形成三維多孔結(jié)構(gòu)的能力,無毒性,易于處理和低成本優(yōu)點(diǎn)等,使得殼聚糖成為一種合適的生物材料,并且在組織工程中具有巨大的應(yīng)用潛力[2]。

1 水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠概述

水凝膠作為一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物,高密度的親水基團(tuán)可以保留大量的水或生物流體。并且其柔軟和通透性優(yōu)良的特點(diǎn)與細(xì)胞外基質(zhì)相似,能為細(xì)胞提供一個運(yùn)輸營養(yǎng)和細(xì)胞增殖的平臺,最大程度地減少對細(xì)胞組織的損害[3]。此外,水凝膠還具有良好的孔隙率,能夠裝載和釋放各種藥物,對于纖維化和壞死的組織具有清創(chuàng)和脫屑的能力。同時,水凝膠的特性隨著缺損形態(tài)的不同而改變,決定了其在組織工程技術(shù)中廣泛的應(yīng)用前景[4]。Finklea等[5]研究人員成功地將人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)封裝在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-纖維蛋白原微球水凝膠中,實(shí)現(xiàn)了對hiPSCs向功能性心肌細(xì)胞的引導(dǎo)和分化。值得一提的是,在分化的第8天,這些細(xì)胞已經(jīng)具有了自發(fā)性的收縮,這將為心臟組織的再生和修復(fù)提供新的思路和方法。除此之外,水凝膠還廣泛用于神經(jīng)組織工程中。Grimaudo等[6]報(bào)道了一種基于N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺(PHPMA)的水凝膠,該水凝膠用纖連蛋白Arg-Gly-Asp(RGD)進(jìn)行功能化,模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境以繞過神經(jīng)創(chuàng)傷后瘢痕愈合過程,并在體內(nèi)大鼠脊髓中促進(jìn)組織再生和支持軸突生長的能力,為神經(jīng)創(chuàng)傷后的治療提供了新的方向和希望。在抗腫瘤治療方面,Lee等[7]設(shè)計(jì)了一種基于PEG聚合物凝膠的簡單合成方法,將氨基甲酸酯鍵引入維生素E-PEG-維生素E共聚物的嵌段鍵中。這種方法形成的凝膠在體內(nèi)穩(wěn)定性較高,可以持續(xù)釋放蛋白質(zhì)達(dá)到17周以上,用于提供持續(xù)抗癌免疫的癌癥預(yù)防疫苗中。水凝膠以其獨(dú)特的條件敏感性、柔軟通透性、藥物載荷和釋放能力在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了更多的希望與可能。

殼聚糖(chitosan,CS)是由隨機(jī)排列的β-(1,4)糖苷鍵連接D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖單元組成的線性多糖,其具有良好的抗菌性能與生物相容性,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的陽離子堿性多糖[8]。殼聚糖是通過對甲殼素進(jìn)行脫乙?；@得的,而甲殼素是一種大量存在于甲殼類動物外骨骼及真菌細(xì)胞壁上的結(jié)構(gòu)多糖,其自然來源比較豐富。此外,殼聚糖的反應(yīng)性還可以通過取代其官能團(tuán)來改變自身結(jié)構(gòu),從而可以與其他生物材料進(jìn)行合成或結(jié)合,形成生物復(fù)合材料。這些修飾使CS的特性得以調(diào)節(jié),例如溶解度、生物降解性和機(jī)械性能等[9]。與此同時,CS的脫乙酰程度(degrees of deacetylation,DD%)也會影響到其復(fù)合材料的生物相容性。對殼聚糖/β-甘油磷酸鹽水凝膠與降低DD%的殼聚糖的研究表明[10],低程度的脫乙酰提高了體外間充質(zhì)干細(xì)胞(multipotent stromal cells,MSCs)的細(xì)胞活力,并明顯減少了材料植入Wistar大鼠皮下后的白細(xì)胞浸潤。

溫敏水凝膠是一種溫度敏感的水凝膠材料,其物理狀態(tài)會隨著環(huán)境溫度的變化而發(fā)生改變,從而導(dǎo)致溶膠-凝膠狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。當(dāng)受到溫度刺激時,這種具有溫度敏感性的高分子聚合物會從分散的膠束狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹旅艿娜S網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而使凝膠形成并保持穩(wěn)定的形態(tài)。當(dāng)殼聚糖溫敏水凝膠置入缺損后,在殼聚糖自身抗菌能力、生物相容性等特性的協(xié)同作用下,可以促進(jìn)組織缺損的修復(fù)。與常規(guī)水凝膠相比,溫敏水凝膠因其能隨溫度發(fā)生自身狀態(tài)的變化而適應(yīng)機(jī)體缺損的形態(tài),在藥物緩釋載體、血管神經(jīng)再生、組織工程等方面具有顯著的優(yōu)勢[11]。

2 常見CS溫敏水凝膠

2.1 殼聚糖/甘油磷酸鈉溫敏凝膠

殼聚糖/甘油磷酸鈉(CS/GP)溫敏水凝膠是由殼聚糖和甘油磷酸鈉兩種天然高分子材料交聯(lián)形成的溫敏型水凝膠。這種水凝膠的特點(diǎn)是其在室溫下可以保持液態(tài),同時隨著溫度升高,高于生理溫度(37 ℃)時,水凝膠由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)。通過利用β-甘油磷酸鹽用作殼聚糖溫度敏感水凝膠的催化劑,并在適合的pH和生理溫度下將殼聚糖溶液中的流體轉(zhuǎn)化為凝膠相。這一變化的相關(guān)機(jī)制為:①殼聚糖鏈之間的氫鍵靜電相互作用和疏水鍵相互作用;②殼聚糖的加入增加了離子強(qiáng)度,從而減少了殼聚糖鏈之間的靜電排斥;③殼聚糖中的氨基反作用力和甘油磷酸中的磷酸基之間發(fā)生靜電吸引[12]。在Rahmanian-Devin等[13]的研究中發(fā)現(xiàn),β-甘油磷酸鹽被認(rèn)為是人骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)基中的成骨因子,可導(dǎo)致骨髓干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化。

2.2 殼聚糖/膠原水凝膠

膠原蛋白是機(jī)體中主要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,其功能是為反作用力提供機(jī)械支持,以抵抗最終的反復(fù)塑性形變。同時,膠原蛋白種類和纖維方向決定了組織中不同的細(xì)胞類型[14]。此外,膠原蛋白是動物體內(nèi)中最豐富的蛋白質(zhì),其中富含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等活性氨基酸。從生物學(xué)角度來看,膠原蛋白具有生物相容性和降解性突出、抗原性低等特點(diǎn)[15]。殼聚糖中添加的膠原蛋白可以獲得類似于天然骨骼的仿生結(jié)構(gòu),增加鈣和硫酸鹽糖胺聚糖的產(chǎn)生,并具有成骨和軟骨形成的潛力。這會使殼聚糖/膠原凝膠材料的機(jī)械性能得到了改善,同時顯示出更高的耐酶降解性[16]。

2.3 殼聚糖/羥基丁基水凝膠

羥基丁基CS(hydroxybutyl chitosan,Hbcs)是最重要的CS醚之一,通過醚化反應(yīng)將羥基丁基與CS骨架的羥基和氨基偶聯(lián)而合成。Hbcs在水溶液中具有較低的臨界溶液溫度,約為19 ℃,且可在60 s內(nèi)形成凝膠,是一種很有潛力的熱敏聚合物[17]。Hbcs水凝膠具有良好的生物相容性和降解性,植入機(jī)體幾周后會分解成無毒性的高度多孔結(jié)構(gòu),類似于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞的黏附與增殖。Dang等[18]評估了不同配方的Hbcs水凝膠作為可注射干細(xì)胞載體的潛力,用于輸送治療藥物,以促進(jìn)退化椎間盤的生物學(xué)重建。目前,基于Hbcs的水凝膠在組織工程領(lǐng)域備受關(guān)注。其應(yīng)用涉及多個方面,其中最重要的是應(yīng)用Hbcs水凝膠來模擬細(xì)胞外基質(zhì)的三維環(huán)境,從而實(shí)現(xiàn)血管化的組織結(jié)構(gòu)和器官的逐層構(gòu)建[19]。除此之外,基于Hbcs的水凝膠還廣泛應(yīng)用于術(shù)后防粘連、傷口敷料、動脈栓塞劑、組織工程支架、藥物傳遞和細(xì)胞治療等領(lǐng)域,并且在臨床實(shí)踐中效果顯著。

3 殼聚糖溫敏水凝膠在組織工程中的應(yīng)用

3.1 骨組織工程中的應(yīng)用

3.1.1 頜面骨組織工程

作為頜面部的重要組成部分,頜骨在維持口頜系統(tǒng)的穩(wěn)定性、咀嚼功能和面部外觀方面具有關(guān)鍵作用。先天性異常、藥物使用、局部炎癥、牙周炎、創(chuàng)傷性損傷、惡性腫瘤和拔牙等原因都可能導(dǎo)致頜面部骨缺損[20]。為了恢復(fù)骨缺損,臨床上常采用骨移植來恢復(fù)骨缺損,無論是自體骨移植還是異體骨移植都存在相應(yīng)的缺陷。自體骨移植植骨區(qū)吸收且供區(qū)骨量不足、供區(qū)受創(chuàng)、感覺異常、功能受損、感染等問題,限制自體骨移植在臨床上的應(yīng)用[21]。而對于異體骨移植來說,也需要面對相應(yīng)的免疫排斥、組織相容、疾病交叉?zhèn)鞑?以及材料生物學(xué)或力學(xué)性能等方面潛在的問題。溫敏水凝膠的良好物理性質(zhì)和合適的生物降解性已被證明是一種有價(jià)值的骨替代材料,骨組織基質(zhì)中的糖胺聚糖結(jié)構(gòu)與殼聚糖分子結(jié)構(gòu)相似,有利于成骨細(xì)胞的附著、生長、增殖和分化[22]。

Wu等[23]將小胞外囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)添加到殼聚糖/β-甘油磷酸酯水凝膠(CS/β-GP)復(fù)合材料中,制備sEV/CS/β-GP水凝膠用于修復(fù)大鼠的顱骨缺陷。sEV是從細(xì)胞釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的外泌體和微囊泡。sEV在保護(hù)其內(nèi)容物(mRNA、miRNA和蛋白質(zhì))免受降解以及將其內(nèi)容物遞送到細(xì)胞功能所需的受體細(xì)胞方面具有重要作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),sEV/CS/β-GP水凝膠植入受體區(qū)后,sEVs從水凝膠中成功釋放,同時水凝膠的熱敏性提高了骨愈合能力,促進(jìn)了顱骨缺損的修復(fù)。此外,sEV/CS/β-GP水凝膠還能夠促進(jìn)血管生成和骨形成,從而為骨組織再生提供了良好的基質(zhì)和支持。

在Pankongadisak等[24]的研究中,將絲膠蛋白(silk sericin,SS)加入CS/β-GP水凝膠后,可以明顯減少水凝膠的凝固時間并且加速水凝膠凝固的同時,還能釋放出更多的酚類化合物,提高水凝膠恢復(fù)功能性骨組織的潛力。與此同時,根據(jù)近期研究證實(shí)生物活性玻璃納米顆粒(bioactive glass nanoparticles,nBG)在骨組織工程技術(shù)中具有廣泛的應(yīng)用前景。Moreira等[25]制備了殼聚糖/明膠/生物活性玻璃納米復(fù)合水凝膠(CH/GE/nBG hydrogels)并研究了該水凝膠對骨細(xì)胞再生效率的影響,發(fā)現(xiàn)該水凝膠促骨再生潛力優(yōu)良,對骨細(xì)胞及組織沒有明顯毒性,生物相容性良好,為組織工程技術(shù)修復(fù)頜面骨缺損奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3.1.2 牙周骨組織工程

在修復(fù)牙周骨缺損方面,殼聚糖不僅可以作為組織工程支架和控制遞送載體,還具有良好的抗菌性能,對細(xì)菌或真菌具有殺菌作用[25]。重要的是,在室溫條件下,溫敏型水凝膠可以保持液體狀態(tài),更有利于針對性地應(yīng)用于通常難以觸及的深牙周袋。在Zang等[26]的研究中,他們將具有骨成骨細(xì)胞分化和牙周組織愈合的潛力的BMP-7生長因子(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)與奧硝唑(ornidazole,ORN)加載于CS/β-GP水凝膠,并且置入于比格犬的Ⅲ度根分叉病變中,術(shù)后發(fā)現(xiàn)所有水凝膠都形成了高度多孔的結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)利于營養(yǎng)物質(zhì)的均勻分布及細(xì)胞的黏附增殖,促進(jìn)牙周組織中血管和骨組織的再生。同時BMP-7以穩(wěn)定和持續(xù)的方式從CS/β-GP水凝膠中釋放,刺激著成骨細(xì)胞增殖和分化,ORN又確保了水凝膠的抗菌性能,這些將使得根分叉病變附近有大量骨組織及牙骨質(zhì)再生,并且周圍還有會有豐富的膠原纖維形成。這些實(shí)驗(yàn)也證明了殼聚糖溫敏水凝膠通過成為組織工程支架及藥物緩釋系統(tǒng)在牙周再生工程的優(yōu)勢及應(yīng)用潛力。

3.2 軟組織工程中的應(yīng)用

近年來,隨著對殼聚糖及殼聚糖溫敏水凝膠及其衍生物的進(jìn)一步了解,殼聚糖也越來越多的應(yīng)用于軟組織工程之中,例如牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生、牙周軟組織再生及頜面部血管神經(jīng)再生等。對于牙髓再生來說,由于牙髓系統(tǒng)是一種高度血管化和神經(jīng)組織支配的復(fù)雜結(jié)構(gòu),因此牙本質(zhì)-牙髓再生一直被認(rèn)為是一個巨大的挑戰(zhàn)[27]。根據(jù)Wu等[28]的最新研究報(bào)告,使用殼聚糖/β-甘油磷酸鹽(CS/β-GP)水凝膠作為緩沖系統(tǒng)負(fù)載具有促進(jìn)牙本質(zhì)再生的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并探討了其對牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cell,DPSC)的影響。研究發(fā)現(xiàn)CS/β-GP水凝膠對DPSC無細(xì)胞毒性,它還具有促進(jìn)DPSC擴(kuò)散、利于細(xì)胞分布的特點(diǎn)。同時,從后期礦化活性檢測及牙源性標(biāo)志物的表達(dá)觀察,VEGF/CS/β-GP水凝膠可以持續(xù)釋放VEGF,并有助于DPSCs的牙源性分化及血管源性分化。因此,VEGF/CS/β-GP水凝膠可能成為牙髓及血管再生組織工程中具有潛力載體材料。另一方面,對于殼聚糖水凝膠的抗齲應(yīng)用,在Ruan等[29]進(jìn)行的一項(xiàng)研究中,通過將脫乙?；?5%殼聚糖與從重組DNA技術(shù)獲得的純化釉原蛋白rP172混合制備釉原蛋白-殼聚糖水凝膠(amelogenin-chitosan,CS-AMEL)作再為礦化劑用于再礦化侵襲性病變或類似齲齒病變的人類牙釉質(zhì)。結(jié)果表明,CS-AMEL水凝膠有效地在具有侵襲性類齲病變表面形成了有組織的牙釉質(zhì)狀晶體層。它還可以通過再生有組織的晶體來修復(fù)早期病變,并減少病變的深度。

殼聚糖溫敏水凝膠單獨(dú)載藥或與生長因子協(xié)同使用,為牙周軟組織再生治療提供了可行有效的新方案。Huang等[30]將具有良好抗菌性的氧化鋅納米顆粒(ZnO-NPs)負(fù)載于CS/β-GP溫敏水凝膠之中,發(fā)現(xiàn)ZnO-NPs/CS/β-GP水凝膠對鈦種植體周圍的牙齦卟啉單胞菌生物膜有明顯的抑制作用。同時,抗菌水凝膠可以吸收植體周圍組織滲出物,抑制生物膜形成,有利于恢復(fù)種植體周圍軟組織水平。Ammar等[31]通過將牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)置入凍干血小板濃縮物(freeze-dried platelet concentrate,FDPC)加入CS/β-GP溫敏水凝膠進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)2周后觀察PDLSC的活力。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),在水凝膠中加入FDPC后可以顯著提高了PDLSC的活力,并且與體外標(biāo)準(zhǔn)基培養(yǎng)的PDLSC細(xì)胞活力相當(dāng)。

神經(jīng)再生組織工程領(lǐng)域正在密切關(guān)注一種新興治療方案,該方案利用口腔環(huán)境中易獲得的口腔間質(zhì)干細(xì)胞,通過引導(dǎo)其定向分化來修復(fù)相關(guān)神經(jīng)組織缺損。Cai等[32]使用殼聚糖溫敏水凝膠(CS/β-GP)作為培養(yǎng)支架,通過在水凝膠中嵌入表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管內(nèi)皮生長因子等生長因子及二甲雙胍對人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(human gingival mesenchymal stem cells,hGMSCs)進(jìn)行分化培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn),hGMSCs在負(fù)載二甲雙胍的殼聚糖溫敏水凝膠及生長因子的誘導(dǎo)下,表現(xiàn)出了功能性神經(jīng)元樣的分化潛力,并探究了hGMSC最合適的生長和神經(jīng)分化條件,為溫敏水凝膠聯(lián)合hGMSCs實(shí)現(xiàn)神經(jīng)再生提供依據(jù)。

4 結(jié) 語

作為一種具有獨(dú)特特性和在生物醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的生物聚合物,殼聚糖及其衍生物一直受到各學(xué)科的廣泛關(guān)注。目前,研究中主要是通過將殼聚糖與其他天然或合成聚合物進(jìn)行結(jié)合,從而改善其生物相容性及物理化學(xué)性能,降低其生物降解速率。同時,將生物活性因子、藥物或種子細(xì)胞與CS溫敏水凝膠復(fù)合誘導(dǎo)組織。重要的是,根據(jù)體內(nèi)及體外研究結(jié)果表明,溫敏水凝膠支架大多數(shù)不但沒有細(xì)胞毒性,而且還能促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞的附著增殖,有利于機(jī)體組織的修復(fù)。

盡管在目前的臨床實(shí)踐中,CS溫敏水凝膠是一種可能的骨缺損修復(fù)替代材料,但是仍存在一些局限性:①由于機(jī)體內(nèi)器官和組織的復(fù)雜性,由單一聚合物制成的殼聚糖水凝膠并不總能滿足所有要求。②用于骨再生的殼聚糖基材料的表征尚未得到標(biāo)準(zhǔn)化。雖然有許多關(guān)于殼聚糖支架作為潛在骨再生材料的研究,但使用的表征方法各不相同,這使得無法正確比較不同研究的結(jié)果并對材料的潛力得出最終結(jié)論。③如何控制水凝膠緩釋系統(tǒng)對釋放生物活性因子或藥物的釋放速度及釋放效能,以及如何降低分子材料自身可能引發(fā)的潛在炎癥反應(yīng)對組織再生修復(fù)的不良影響等問題仍待解決。因此,未來殼聚糖溫敏水凝膠的研究重點(diǎn)可能會在優(yōu)化殼聚糖表征的同時,能與多種生物活性因子相結(jié)合,獲得具有“智能”控制載體釋放及多層次修復(fù)組織缺損能力的新型CS溫敏水凝膠。

綜上所述,隨著對殼聚糖溫敏水凝膠的研究不斷深入和材料科學(xué)的不斷發(fā)展,相信未來殼聚糖溫敏水凝膠將能夠?yàn)榭谇唤M織再生領(lǐng)域提供更為多樣化和精準(zhǔn)化的治療方案。