夏丹陽 徐超 文曉陽 康國章 王黎明

摘要：本研究以小麥品系ＫＤ５２７ 及其經ＥＭＳ 誘變創(chuàng)制出的類病斑型早衰突變體ｌｍｐａ１ 和兩者的雜交Ｆ１、Ｆ２ 群體為材料，分析其類病斑發(fā)生動態(tài)、農藝及產量性狀，并進行相關光合指標測定與組織化學染色鑒定，以期分析ｌｍｐａ１ 發(fā)生類病斑早衰的生理生化機制。 結果表明，ＫＤ５２７ 能正常完成生長成熟過程，而ｌｍｐａ１在生長前期表現正常，挑旗后葉片受光誘導而發(fā)生類病斑反應，出現黃褐色類病斑，且隨生育期延長，類病斑逐漸蔓延至葉鞘、莖稈和穗部，引發(fā)整株早衰直至干枯死亡，導致其產量降低；類病斑發(fā)生期間，ｌｍｐａ１ 葉片凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率顯著低于ＫＤ５２７（Ｐ<０.０１），胞間ＣＯ２ 濃度顯著高于ＫＤ５２７（Ｐ<０.０１）；總葉綠素量含量明顯低于ＫＤ５２７，且二者之間的差異隨類病斑發(fā)生程度的增加而增大；類病斑發(fā)生初期，ｌｍｐａ１ 的葉片過氧化氫（Ｈ２Ｏ２）含量及過氧化氫酶（ＣＡＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、過氧化物酶（ＰＯＤ）活性均較ＫＤ５２７高，隨著類病斑擴散，其ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性急劇下降，Ｈ２Ｏ２ 含量急劇增加；組織化學染色分析表明類病斑發(fā)生部位出現細胞死亡。 本結論為類病斑早衰基因Ｌｍｐａ１ 調控小麥早衰發(fā)生的生理生化機制研究奠定了理論基礎。

關鍵詞：小麥；類病斑型早衰；突變體ｌｍｐａ１；生理生化；光誘導

中圖分類號：Ｓ５１２.０１文獻標識號：Ａ文章編號：１００１－４９４２（２０２４）０１－００５８－０８

衰老是作物器官發(fā)育的最后一個進程，這個時期葉片中積累的碳水化合物和礦物質向植物其他生長相對旺盛的部位分解運輸。 植物衰老受內部基因調控和外部環(huán)境因素等的影響，在發(fā)育生物學上具有非常重要的意義[１] 。 早衰是指作物的生理生化過程提早結束，導致作物有效生長發(fā)育時間縮短，是造成作物產量和品質下降的重要原因[２－４] 。 對小麥而言，衰老過程伴隨其灌漿期，小麥籽粒產量的７０％來自于開花后光合器官所生產的干物質，過早衰老會限制其灌漿質量，影響小麥產量，是制約小麥高產穩(wěn)產的重要因素[４] 。目前關于植物早衰的假說有基因調控假說、激素失衡假說、自由基損失學說和糖誘導假說等[５－６] ，但對于植物早衰機制的研究仍不夠全面和深入。因此，發(fā)掘小麥早衰突變體并對其開展生物學特性研究，對于深入了解小麥早衰的發(fā)生機制和選育高產、穩(wěn)產新品種具有非常重要的意義。

植物類病斑突變體能夠在無病原體侵染的情況下自發(fā)產生類似病變的壞死性斑點，且病斑會逐步擴散至葉鞘、莖稈甚至整株，影響籽粒灌漿質量，最終影響產量和品質[７－８] 。 目前在擬南芥[９] 、水稻[１０] 、谷子[１１] 、小麥[１２] 等作物中均有報道，其中水稻相關方面的研究最為深入。 小麥類病斑突變體的研究起步較晚，目前，主要涉及類病斑突變體的基因定位和遺傳調控等方面，尚未有基因克隆的相關報道。 Ｌｉ 等[１３] 將源于自然突變體Ｎｉｎｇ７８４０ 的類病斑基因ｌｍ 定位到２ＢＬ 染色體上；２０１６ 年，Ｗａｎｇ 等[１４] 將自然突變體ｌｍ３ 的類病斑基因定位在３ＢＬ 染色體上，楊佳秀等[１５] 將類病斑突變基因Ｌｍ３ 定位在３ＢＬ 染色體上；隨后，ｌｍ４[１６] 、Ｌｍ５[１７] 也通過ＢＳＲ－ｓｅｑ 等方法被精細定位；Ｚｈａｎｇ 等[１８] 將來自親本Ｎ０７２１６ 的類病斑顯性基因ＴａＳｐｌ１ 定位于３ＤＳ 染色體上，并發(fā)現該基因同時受ＴａＳｐｌ１－ｉ１ 和ＴａＳｐｌ１－ｉ２ 顯性基因抑制。類病斑早衰突變體是一類特殊的類病斑突變體，在自發(fā)形成壞死性病斑的同時又伴有植株早衰現象，而在眾多類病斑突變體中發(fā)生早衰現象的僅占極少數[１９] 。 Ｋｏｎｇ 等[２０] 在小麥突變體庫中鑒定了首個類病斑型早衰突變體ｌｍｐａ１，并將其早衰基因初步定位在５ＡＬ 染色體上。 但關于該突變體引起小麥早衰發(fā)生的相關生理生化機制尚未見報道，為此本研究對該突變體的衰老發(fā)生及不同衰老程度的生物學特性進行觀察和分析，以期解析小麥類病斑型早衰的生理生化機制。

１ 材料與方法

１.１ 試驗材料與概況

本試驗以小麥新品系ＫＤ５２７、類病斑早衰突變體ｌｍｐａ１（從ＫＤ５２７ 的ＥＭＳ 突變體庫中篩選獲得的穩(wěn)定遺傳的早衰突變體）及二者的雜交Ｆ１、Ｆ２ 群體為材料。 所有供試材料均由河南科技大學小麥種質創(chuàng)新組提供，于２０２１ 年１０ 月２９ 日種植于河南科技大學開元校區(qū)農場試驗田。 行長１.２ ｍ，行寬０.２５ ｍ，株距１０ ｃｍ。 水肥管理同大田其他材料。

１.２ 試驗設計

２０２２ 年４ 月６ 日，在類病斑發(fā)生初期，隨機選取突變體ｌｍｐａ１ 植株上尚未出現斑點的旗葉，用錫箔紙包住葉片的一部分（約３ ｃｍ）進行黑暗遮光處理；待葉片其他部位均出現類病斑后，取下錫箔紙恢復光照，觀察記錄葉片遮光處理及恢復光照后該部位的類病斑發(fā)生情況。 重復３ 次。

１.３ 測定項目及方法

１.３.１ 農藝及產量性狀測定 灌漿后期，分別隨機選取突變體ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 及其雜交Ｆ１、Ｆ２ 分離群體各２０ 株，調查株高、穗粒數、千粒重、穗長、單株產量、旗葉長等性狀。

１.３.２ 葉綠素含量測定 在ｌｍｐａ１ 類病斑發(fā)生前１ ｄ 及發(fā)病５、１０、１５、２０、２５ ｄ 共６ 個時期，分別隨機選?。?株ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 的旗葉采樣，剪碎研磨后稱?。?１ ｇ，丙酮浸泡后暗處理２４ ｈ，使用分光光度法測定葉綠素含量（ＳＰＡＤ）[２１] 。

１.３.３ 光合參數測定 在ｌｍｐａ１ 發(fā)病１５ ｄ 時，隨機選取長勢一致的ＫＤ５２７ 與ｌｍｐａ１ 單株，用便攜式光合儀ＬＩ－６４００ＸＴ 測定旗葉凈光合速率（Ｐｎ）、氣孔導度（Ｇｓ）、蒸騰速率（Ｔｒ）和胞間ＣＯ２ 濃度（Ｃｉ）。

１.３.４ Ｈ２Ｏ２ 含量及相關酶活性測定 分別剪取ｌｍｐａ１ 發(fā)?。?、６、１２、１８、２４ ｄ 的旗葉，以ＫＤ５２７ 為對照，參考Ｙｉｎ 等[２４] 的方法，分別進行Ｈ２Ｏ２ 含量和過氧化氫酶（ＣＡＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、過氧化物酶（ＰＯＤ）活性測定。 相關試劑盒采用北京索萊寶科技有限公司產品，所有操作均按試劑盒說明書進行。

１.３.５ 組織化學染色 ?。欤恚穑幔?發(fā)?。保?ｄ 和同時期ＫＤ５２７ 的旗葉，參考Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ 等[２２] 的方法使用二氨基聯苯胺（ＤＡＢ）染色法檢測葉片中過氧化氫（Ｈ２Ｏ２）積累量。 試劑盒來自北京索萊寶科技有限公司，觀察葉片是否出現紅褐色斑點并拍照記錄。 參照Ｋｏｎｇ 等[２３] 的方法，使用伊文思藍（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ， ＥＢ）染色法觀察葉片上細胞死亡情況并拍照記錄。

１.４ 數據處理與分析

試驗數據用ＳＰＳＳ ２５.０ 軟件進行處理、統(tǒng)計分析和顯著性檢驗。

２ 結果與分析

２.１ ｌｍｐａ１ 類病斑早衰發(fā)生動態(tài)觀察

對ＫＤ５２７ 和突變體ｌｍｐａ１ 進行全生育期生長發(fā)育動態(tài)觀察發(fā)現，ＫＤ５２７ 全生育期未出現早衰現象。 由圖１ 可以看出，突變體ｌｍｐａ１ 在苗期表現正常；挑旗后整株葉片開始隨機出現黃褐色類病斑，隨著生育期延長，斑點擴大、數量增多，但是斑點在葉片上出現的位置、大小及強度是隨機的；抽穗后類病斑迅速蔓延到所有葉片，甚至葉鞘、莖稈、穗部的穎殼及麥芒，直至灌漿中后期，突變體ｌｍｐａ１ 整株嚴重干枯至死亡。 表明突變體在挑旗前后開始出現早衰現象，灌漿中后期完全枯死。

２.２ ＫＤ５２７、ｌｍｐａ１ 及其Ｆ１、Ｆ２ 群體的農藝及產量性狀分析

從表１ 中看出，ｌｍｐａ１ 與ＫＤ５２７ 的穗長、旗葉長無顯著差異；ＫＤ５２７ 的穗粒數、千粒重、單株產量分別為６１.８ 粒和４９.３１、２７.３６ ｇ，ｌｍｐａ１ 的分別為５５.９ 粒和３９.９１、２２.６２ ｇ，三者較ＫＤ５２７ 分別顯著下降９.５％、１９.１％、１７.３％。 表明，ｌｍｐａ１ 類病斑發(fā)生導致ｌｍｐａ１ 植株在灌漿末期干枯死亡，生育期縮短，直接影響其籽粒發(fā)育和灌漿質量。

在對ＫＤ５２７、ｌｍｐａ１ 進行農藝學鑒定基礎上，對其雜交Ｆ１、Ｆ２ 群體的農藝性狀進行鑒定（表１）。 發(fā)現Ｆ１ 群體單株全部出現類病斑而發(fā)生早衰，千粒重、單株產量較ＫＤ５２７ 分別顯著降低１７.３％、１４.４％；Ｆ２ 分離群體中，有早衰和正常兩種表型，其中早衰植株的穗長、旗葉長與正常植株相比無顯著差異，穗長與ＫＤ５２７ 相比也無顯著差異，但其余性狀顯著降低，其中千粒重、單株產量分別為４０.３５、２２.８５ ｇ，較正常植株和ＫＤ５２７ 分別顯著下降１８.６％、１４.８％和１８.２％、１６.５％。 說明突變體ｌｍｐａ１ 的早衰特性在后代群體中具有很強的遺傳效應。

２.３ ｌｍｐａ１ 對光照的響應

于孕穗期對ｌｍｐａ１ 尚未發(fā)生類病斑的葉片進行１２ ｄ 的錫箔紙遮光處理，取下錫箔紙后發(fā)現遮光部位沒有類病斑出現（圖２ａ），而自然光照下的葉片其他部位逐漸出現褐色斑點；遮光結束取下錫箔紙恢復光照７ ｄ 后，原遮光部位也出現了斑點（圖２ｂ）。 這表明突變體ｌｍｐａ１ 類病斑的產生可能與光誘導有關。

２.４ ｌｍｐａ１ 葉片葉綠素含量分析

對ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 挑旗后的旗葉進行葉綠素含量測定，結果（圖３）表明，在類病斑發(fā)生前ｌｍｐａ１葉片中葉綠素ａ、ｂ及總葉綠素含量與ＫＤ５２７均無明顯差異；類病斑發(fā)生后，隨著類病斑擴散程度的加劇，突變體葉片中葉綠素含量下降明顯，類病斑發(fā)生１０ ｄ 后突變體葉片中葉綠素含量比ＫＤ５２７ 明顯增加。 表明類病斑的發(fā)生導致突變體ｌｍｐａ１ 葉片逐漸失綠，光合色素含量呈下降趨勢。

２.５ ｌｍｐａ１ 葉片光合參數分析

由表２ 可知，ＫＤ５２７ 葉片的Ｐｎ、Ｇｓ、Ｔｒ 均顯著高于突變體ｌｍｐａ１（Ｐ<０.０１），Ｃｉ 顯著低于ｌｍｐａ１（Ｐ<０.０１）。 說明ｌｍｐａ１ 的光合能力顯著低于ＫＤ５２７。 類病斑早衰突變體的植株衰老提前，擾亂了光合生理過程，影響植株光合能力，進而影響其產量。

２.６ ｌｍｐａ１ 葉片衰老相關參數分析

ｌｍｐａ１ 類病斑發(fā)生后，對ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 葉片抗氧化酶ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性和Ｈ２Ｏ２ 含量的測定結果（圖４）發(fā)現：類病斑剛出現時（１ ｄ），ｌｍｐａ１葉片酶活性和Ｈ２Ｏ２ 含量與ＫＤ５２７ 無明顯差異；類病斑發(fā)生６～１２ ｄ 內，ｌｍｐａ１ 葉片Ｈ２Ｏ２ 含量和ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性均高于ＫＤ５２７，表明發(fā)病初期，ｌｍｐａ１ 葉片活性氧含量增加的同時，體內清除自由基的能力增強；隨著病程延長與類病斑擴散程度加深，ｌｍｐａ１ 葉片ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性均明顯低于ＫＤ５２７，至發(fā)?。玻?ｄ 時，分別較ＫＤ５２７ 降低３４.４９％、３５.７１％、４９.５９％，而葉片Ｈ２Ｏ２ 含量則逐漸升高，且明顯高于ＫＤ５２７，至發(fā)?。玻?ｄ 時較ＫＤ５２７ 高６８.６２％。 說明突變體ｌｍｐａ１ 葉片活性氧清除系統(tǒng)嚴重受損，清除自由基的能力下降。Ｈ２Ｏ２ 的過度積累可能導致細胞死亡。

２.７ ｌｍｐａ１ 葉片組織化學染色鑒定

對ｌｍｐａ１ 發(fā)病１５ ｄ 的葉片與同時期ＫＤ５２７相同部位的葉片分別進行ＤＡＢ、ＥＢ 染色鑒定，結果（圖５）表明，ＫＤ５２７ 葉片未染上顏色；ｌｍｐａ１ 葉片的類病斑發(fā)生部位染色較深，表明葉片類病斑發(fā)生部位周圍積累了大量的Ｈ２Ｏ２，而活性氧大量積累是細胞死亡的一個重要標志，這就說明ｌｍ￣ｐａ１ 葉片已經發(fā)生了小面積的細胞壞死。

３ 討論

本研究結果表明，類病斑突變體ｌｍｐａ１ 的病斑在挑旗期出現，并隨著生育期延長逐漸變大，甚至遍布整株，與他人關于突變體發(fā)病時期、部位及斑點顏色的報道存在不同。 如突變體ｌｍｐａ１ 與ＬＦ２０１０ 的病斑都為黃褐色，但ＬＦ２０１０ 的病斑發(fā)生在三葉期，且為普通斑點不存在壞死癥狀[２５] ；類病斑基因ｌｍ４[１６] 所控制的突變體與ＨＬＰ[２６] 的病斑發(fā)生時間一致，但ＨＬＰ 與Ｉ３０[２７] 、ｗｓｌ[２８] 的病斑都為白色，與突變體ｌｍｐａ１ 病斑的顏色不同；Ｎｉｎｇ７８４０[１３] 的病斑顏色、發(fā)病時期與ｌｍｐａ１ 相近，但其發(fā)病范圍只在葉片，且病斑產生為氮依賴型。 這表明ｌｍｐａ１ 是與已報道的類病斑突變體不同的新型類病斑型早衰突變體材料。 水稻上突變體ｓｐｌ２８[２９] 、ＯｓＬＭＳ[３０] 等都出現葉片早衰現象，但在ｌｍｐａ１ 之前小麥上尚未報道過導致早衰的類病斑突變體。

突變體ｌｍｐａ１ 與其野生型ＫＤ５２７ 相比，株高、穗粒數、千粒重和單株產量均顯著降低，但穗長、旗葉長無顯著差異，原因可能是ｌｍｐａ１ 的類病斑突變發(fā)生較晚，且前期主要發(fā)生在下部葉，當斑點蔓延到上部葉及莖稈時植株的農藝性狀已基本發(fā)育完成，但灌漿期植株開始干枯，光合作用及籽粒灌漿受阻，表現為籽粒干癟，籽粒品質和產量受影響顯著。 Ｋｏｎｇ 等[２０] 的研究中將控制ｌｍｐａ１ 早衰的Ｌｍｐａ１ 基因定位到小麥的５ＡＬ 染色體上，這為探究小麥衰老過程及及其光合代謝等生理生化特性提供了良好的種質基礎，也為小麥早衰引起產量與品質降低等方面的研究提供了參考。

研究發(fā)現，強光條件下，植物葉片表面氣孔關閉，發(fā)生光呼吸，葉綠體中ＣＯ２ 含量減少，Ｏ２ 含量增加，葉綠體的氧化活性增強，導致葉綠體中產生大量活性氧，引起生物膜脂過氧化，從而加速植物衰老[３１－３３] 。 這表明光照在調節(jié)光呼吸和氧化還原的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。 有研究表明，類病斑突變體ｌｍ５[１７] 、ｌｍｍ４[３４] 、ｓｐｌ３４[３５] 等的病斑產生受光誘導。 本研究中ｌｍｐａ１ 類病斑的形成也與光誘導有關，且類病斑周圍出現過氧化氫積累和細胞死亡，這與前人研究[３６－３８] 的結果一致。 表明正常光照引發(fā)了ｌｍｐａ１ 植株內的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，過氧化氫大量積累導致細胞死亡，從而形成壞死性斑點。

對ｌｍｐａ１ 不同發(fā)病時期的生理生化指標的測定結果表明，在發(fā)病初期，突變體ｌｍｐａ１ 中活性氧清除機制未受到損傷，雖然體內活性氧含量增加，但ＣＡＴ、ＰＯＤ、ＳＯＤ 活性也均提高；隨著類病斑擴散及早衰進程推進，活性氧含量逐漸增加，而抗氧化酶活性大幅降低，可能是活性氧積累量超出防御機制的調控范圍，活性氧清除系統(tǒng)遭到破壞，過量的Ｈ２Ｏ２ 積累使膜脂過氧化，細胞膜被破壞，導致細胞死亡。 此外由于類病斑的面積不斷擴散，突變體ｌｍｐａ１ 因葉肉細胞減少而表現為綠色程度降低，光合色素含量降低，光合面積不斷減少，光合性能全面下降，導致籽粒干癟、產量降低、品質變劣。 本研究對ｌｍｐａ１ 早衰特性的生物學研究，可為類病斑早衰基因Ｌｍｐａ１ 調控類病斑早衰發(fā)生的生理生化機制解析奠定基礎。

另外，在本研究的基礎上，我們也在嘗試利用ＲＮＡ－Ｓｅｑ 與ＫＡＳＰ 等技術篩選與類病斑早衰基因Ｌｍｐａ１ 緊密連鎖的ＳＮＰ 標記，完成其精細定位，篩選并克隆早衰相關的可能候選基因，驗證其功能，并利用ＲＮＡ－Ｓｅｑ 技術進行不同時期的轉錄組測序分析，以期揭示Ｌｍｐａ１ 調控小麥早衰的分子機制。

４ 結論

突變體ｌｍｐａ１ 是一個具有類病斑表型并致使小麥衰老嚴重提前、籽粒產量和品質降低的特殊突變體。 本研究結果表明，突變體ｌｍｐａ１ 類病斑發(fā)生受光照誘導，在挑旗期自發(fā)產生黃褐色斑點，隨生育進程推進斑點擴散至整株，導致光合色素減少，光合效率降低，同化能力減弱，嚴重影響籽粒灌漿；同時，植株體內清除活性氧的保護機制被破壞，Ｈ２Ｏ２ 大量積累，死細胞增多，最終造成植株干枯早衰，產量顯著降低。 本研究結果可為突變基因Ｌｍｐａ１ 的基因功能及分子調控機制研究奠定一定的理論基礎。

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