袁瑋 陳蕾蕾 楊金玉 周慶新 裘紀(jì)瑩 趙雙枝 付恩君 趙國琰 陳相艷

摘要：針對(duì)我國缺乏適用于創(chuàng)傷弧菌檢測的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的現(xiàn)狀，本研究開展了創(chuàng)傷弧菌鑒定即用型定性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制和應(yīng)用工作。 首先構(gòu)建了創(chuàng)傷弧菌毒力基因ｖｖｈＡ 的重組質(zhì)粒，經(jīng)測序驗(yàn)證后制備成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品凍干粉，然后對(duì)其進(jìn)行ＰＣＲ 定性檢測及紫外分光光度計(jì)法定量分析。 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果表明，樣品間無顯著差異，均勻性良好，符合預(yù)期目標(biāo)；短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果表明，樣品能在４ ℃、３７ ℃條件下穩(wěn)定保存１４ 天；長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果表明，樣品能在－２０ ℃條件下穩(wěn)定保存至少１２ 個(gè)月。 研究結(jié)果表明，創(chuàng)傷弧菌質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性均符合國家定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求，為創(chuàng)傷弧菌的快速、高通量的定性鑒定分析提供了可靠的參考物質(zhì)。 將標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)用于魚類、貝類等１０ 份海鮮類食品樣品的檢測中，經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法驗(yàn)證，檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤。 本研究所研制的創(chuàng)傷弧菌質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品具有較好的商業(yè)應(yīng)用潛力，為其在食品檢測領(lǐng)域的推廣應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷弧菌；質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品；水產(chǎn)品；檢測

中圖分類號(hào)：Ｓ８５２.６１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：Ａ文章編號(hào)：１００１－４９４２（２０２４）０１－０１４７－０９

創(chuàng)傷弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）是一種革蘭氏陰性菌，主要特性為嗜鹽、喜溫，自然分布于世界各地沿海和河口水域[１－２] ，是一種人畜共患病原菌，容易感染魚、蝦、牡蠣、蛤、螃蟹等海產(chǎn)品，人類通過生食或食用未完全煮熟的海產(chǎn)品、破損皮膚直接接觸被其污染的海水或海產(chǎn)品而患病[３] 。 創(chuàng)傷弧菌與霍亂弧菌、副溶血弧菌并稱為人類三大致病弧菌[４] ，弧菌感染病例具有明顯的季節(jié)性，大多數(shù)發(fā)生在夏季和初秋氣溫較高的時(shí)期[５] 。隨著全球氣候變暖、海洋溫度升高等自然條件的變化，創(chuàng)傷弧菌的感染率也逐年增加。 在全世界范圍內(nèi)創(chuàng)傷弧菌感染的死亡率高達(dá)６０％，在美國約為３３％，使其成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和食品安全問題[６－７] 。 創(chuàng)傷弧菌感染的主要癥狀包括腸胃炎、原發(fā)創(chuàng)傷性感染、敗血癥和壞死性筋膜炎等，免疫力低下或患有糖尿病、肝臟疾病等慢性基礎(chǔ)病的患者屬于易感人群[８] 。 創(chuàng)傷弧菌傷口感染通常以腫脹、紅斑和劇烈疼痛為特征，潛伏期短，發(fā)病迅速，病變經(jīng)常演變?yōu)榭蓧乃赖哪遗莼虺錆M液體的大泡，最終引起多臟器衰竭[９] 。

創(chuàng)傷弧菌菌體產(chǎn)生的創(chuàng)傷弧菌外毒素通過特定的毒力機(jī)制引發(fā)疾病。 創(chuàng)傷弧菌毒力因子主要包括溶細(xì)胞素、鐵載體、金屬蛋白酶、莢膜多糖等[１０] ，由ｖｖｈＡ 基因編碼的創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素是唯一分泌到細(xì)胞外的外毒素，具有創(chuàng)傷弧菌種屬特異性，可作為鑒定創(chuàng)傷弧菌的指標(biāo)[１１] 。 當(dāng)前，對(duì)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行定量檢測主要通過平板計(jì)數(shù)、ＭＰＮ 法等傳統(tǒng)培養(yǎng)法，這些方法需要進(jìn)行過夜培養(yǎng)、選擇性平板分離、生化鑒定、血清學(xué)檢測等繁瑣的試驗(yàn)步驟，不僅耗時(shí)費(fèi)力，同時(shí)樣本中雜菌的過量繁殖也會(huì)對(duì)鑒別結(jié)果產(chǎn)生影響。 另外，由于水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌通常處于“活的且不可培養(yǎng)”的狀態(tài)[１２－１３] ，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法很難對(duì)該部分創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行有效鑒定，嚴(yán)重降低了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。 作為最危險(xiǎn)的食源性細(xì)菌之一，創(chuàng)傷弧菌造成了９５％的海鮮相關(guān)死亡，已成為一個(gè)主要的食品安全問題[１４] 。 隨著食品供應(yīng)鏈的全球化，創(chuàng)傷弧菌的定期監(jiān)測變得更加重要。

為了滿足當(dāng)下快速、高通量檢測的需求，分子生物學(xué)方法在食品微生物的檢測中得到了越來越廣泛的應(yīng)用，但相關(guān)的參考物質(zhì)相對(duì)匱乏。 食源性微生物檢測即用型標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，有助于解決目前國內(nèi)食品微生物檢測中存在的參考物質(zhì)不足的難題，使具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的標(biāo)準(zhǔn)樣品在相關(guān)領(lǐng)域得到更好的推廣和應(yīng)用，從而擺脫對(duì)國外標(biāo)準(zhǔn)樣品的依賴。 因此，建立創(chuàng)傷弧菌鑒定檢測即用型質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品用于其快速、高通量鑒定，對(duì)提高水產(chǎn)品的質(zhì)量安全、保證人類健康具有重要意義。

１ 材料與方法

１.１ 試驗(yàn)材料

１.１.１ 菌株來源 創(chuàng)傷弧菌（ＣＩＣＣ ２１６１５）來源于中國工業(yè)微生物保藏中心。

１.１.２ 主要試劑 瓊脂糖購自上海貝晶生物技術(shù)有限公司；ＰＮＣＣ 增菌液基礎(chǔ)培養(yǎng)基、ＰＮＣＣ 添加劑、ｍＣＰＣ 瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、多粘菌素Ｅ、多粘菌素Ｂ 購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；核酸染料ＧｅｌＳｔａｉｎ、Ｔｒａｎｓ １５０００ ｍａｒｋｅｒ、Ｔｒａｎｓ ２０００ ｍａｒｋ￣ｅｒ、質(zhì)粒大提試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；５０×ＴＡＥ 緩沖溶液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍｉｘ、瓊脂糖凝膠ＤＮＡ 回收試劑盒、ｐＬＢ 零背景快速克隆試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

１.１.３ 儀器和設(shè)備 ＺＨＷＹ－２００Ｈ 恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；ＳＷＣＪ－２Ｄ 雙人凈化工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ ＰＣＲ 儀、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００ 超微量分光光度計(jì)購自賽默飛世爾科技公司；ＪＹ６００Ｃ水平電泳儀、ＪＹ０４Ｓ－３Ｃ 凝膠成像系統(tǒng)購于北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

１.２ 試驗(yàn)方法

１.２.１ 重組質(zhì)粒的獲取與驗(yàn)證 創(chuàng)傷弧菌ｖｖｈＡ基因片段由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，獲得重組質(zhì)粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ，并保存于大腸埃希氏菌Ｔｏｐ１０ 菌株中。 依據(jù)ＧＢ ４７８９.４４—２０２０?食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)?[１５] 中創(chuàng)傷弧菌ＰＣＲ 檢測的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物（表１）。 以重組質(zhì)粒為模板，利用創(chuàng)傷弧菌鑒定引物，對(duì)目的基因進(jìn)行ＰＣＲ 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用瓊脂糖凝膠ＤＮＡ 回收試劑盒對(duì)ＰＣＲ 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，使用ｐＬＢ 零背景快速克隆試劑盒將ＰＣＲ 純化產(chǎn)物連接至ｐＬＢｓｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ 上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＤＨ５α 感受態(tài)細(xì)胞，置于３７ ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)１２ ｈ。 從平板上挑取單菌落，經(jīng)ＰＣＲ 反應(yīng)鑒定為陽性的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果與預(yù)期一致的，即為驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒。將攜帶正確重組質(zhì)粒的大腸埃希氏菌于－８０ ℃超低溫冰箱中甘油管保存。

１.２.２ 重組質(zhì)粒的提取 將攜帶重組質(zhì)粒的大腸埃希氏菌甘油管解凍，接入４ ｍＬ ＬＢ 液體培養(yǎng)基中，放入２００ ｒ/ ｍｉｎ 的振蕩搖床中３７ ℃培養(yǎng)１２ｈ，?。?ｍＬ 種子液轉(zhuǎn)接于２００ ｍＬ 的ＬＢ 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，獲取大量攜帶重組質(zhì)粒大腸埃希氏菌的培養(yǎng)液，利用細(xì)菌質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒。 瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒完整性，ＰＣＲ 驗(yàn)證目的基因，紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒的濃度和純度。

１.２.３ 重組質(zhì)粒的含量檢測 取重組質(zhì)粒樣品１μＬ，于ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００ 超微量分光光度計(jì)中檢測濃度，每管檢測兩次。

１.２.４ 重組質(zhì)粒的分裝 將大提的質(zhì)粒樣品混合至１ 管中，采用紫外分光光度計(jì)測定濃度，然后用無菌去離子水稀釋至２０ ｎｇ/ μＬ，每管１００ μＬ分裝至螺口凍存管中，貼上標(biāo)簽。

１.２.５ 重組質(zhì)粒的冷凍干燥 由于質(zhì)粒樣品較為穩(wěn)定，分裝后可直接凍干。 在－２５ ℃、真空度為５０ Ｐａ 條件下凍干２０ ｈ。

１.２.６ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性分析 按照隨機(jī)抽號(hào)系統(tǒng)抽取的號(hào)碼，抽取質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品１２ 管，用１００ μＬ 無菌水溶解質(zhì)粒凍干粉。 ?。?５μＬ 溶解的質(zhì)粒樣品作為ＰＣＲ 模板，按照１.２.１ 方法進(jìn)行基因定性檢測；取質(zhì)粒樣品２ μＬ，按照１.２.１方法瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒樣品的完整性；取質(zhì)粒樣品１ μＬ，采用紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行復(fù)溶質(zhì)粒樣品的定量試驗(yàn)，檢測樣品的濃度，每管測兩次，核酸含量＝核酸濃度×水化體積，核酸含量結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析法。

１.２.７ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性分析 穩(wěn)定性檢驗(yàn)方法同均勻性檢驗(yàn)，核酸含量結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析法。

短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)：采取兩種短期穩(wěn)定性試驗(yàn)。第一種模擬冰袋運(yùn)輸：在４ ℃條件下的短期儲(chǔ)存穩(wěn)定性試驗(yàn)，隨機(jī)取樣２１ 管置于４ ℃保溫箱，分別在第１、３、５、７、９、１１、１４ 天每天檢測３ 管，每管２ 個(gè)重復(fù)；第二種模擬高溫運(yùn)輸：在３７ ℃ 條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)，隨機(jī)取樣２１ 管置于３７ ℃保溫箱，分別在第１、３、５、７、９、１１、１４ 天時(shí)每天檢測３ 管，每管２ 個(gè)重復(fù)。

長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)：質(zhì)粒樣品經(jīng)冷凍干燥后，需要在－２０ ℃條件下長期冷凍保存。 為了測定質(zhì)粒樣品長期保存時(shí)間及其穩(wěn)定性，每次檢測時(shí)，從冷凍樣品中隨機(jī)取出３ 管樣品，每管重復(fù)２ 次。 抽樣時(shí)間點(diǎn)遵循先密后疏的原則，分別在第１、２、４、６、８、１０、１２ 個(gè)月共７ 個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽樣檢測。

１.２.８ 創(chuàng)傷弧菌質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在食品檢測中的應(yīng)用 食品樣本的前處理：將購買的食品樣本按照ＧＢ ４７８９.４４—２０２０ 要求處理，在無菌條件下，稱取鯽魚、偏口魚、銀鯧魚、鯉魚、鲅魚、黃花魚６ 種魚類樣品的表面組織、腸和腮各２５ ｇ，花蛤、海蠣子和生蠔３ 種貝類樣品內(nèi)容物各２５ ｇ，明蝦的頭足部組織２５ ｇ，分別放入含２２５ ｍＬ ＰＮＣＣ 增菌液的無菌均質(zhì)袋，用拍打式無菌均質(zhì)器拍打２ｍｉｎ 制成樣品勻液；將均質(zhì)袋放入培養(yǎng)箱３７ ℃培養(yǎng)１８ ｈ 獲得增菌液，取距液面１ ｃｍ 深處菌液１ｍＬ 放入離心管中，９ ０００ ｒ/ ｍｉｎ 離心３ ｍｉｎ，去上清；用１ ｍＬ ＰＢＳ 磷酸鹽緩沖液懸浮清洗后９ ０００ｒ/ ｍｉｎ 離心３ ｍｉｎ，去上清，重復(fù)２ 次；加入１ ｍＬ 無菌去離子水，煮沸１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ/ ｍｉｎ 離心５ｍｉｎ，吸取上清液。

ＰＣＲ 分析：將上清液用作ＰＣＲ 反應(yīng)的ＤＮＡ模板；隨機(jī)抽取１ 管創(chuàng)傷弧菌重組質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入１００ μＬ 無菌去離子水溶解，作為陽性對(duì)照；將大腸埃希氏菌ＣＩＣＣ １０００３ 基因組ＤＮＡ 凍干粉用３００ μＬ 無菌水溶解（終濃度為２０ ｎｇ/ μＬ）后作為陰性對(duì)照；無菌去離子水為空白對(duì)照，按照

１.２.１的方法進(jìn)行ＰＣＲ 分析。

創(chuàng)傷弧菌的分離驗(yàn)證：取檢測為陽性的食品樣本的增菌液，用接種環(huán)將其劃線接種于ＣＣ 平板和ｍＣＰＣ 平板，３７ ℃ 培養(yǎng)１８ ｈ，驗(yàn)證菌落形態(tài)是否符合創(chuàng)傷弧菌菌落形態(tài)特征，即圓形、扁平，

光照下透明但中心不透明的黃色或橘黃色菌落，直徑１～２ ｍｍ。

創(chuàng)傷弧菌的生化鑒定：按照ＧＢ ４７８９.４４—２０２０ 進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌的培養(yǎng)和生化特性鑒定。

１.３ 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用ＳＰＳＳ ２６.０ 軟件的ＡＮＯＶＡ 法進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)各處理組之間的差異性，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，Ｐ<０.０５ 表示差異顯著。

２ 結(jié)果與分析

２.１ 創(chuàng)傷弧菌重組質(zhì)粒的驗(yàn)證

以創(chuàng)傷弧菌重組質(zhì)粒為模板，對(duì)其進(jìn)行目的基因ＰＣＲ 擴(kuò)增驗(yàn)證，以大腸埃希氏菌ＣＩＣＣ １０００３為陰性對(duì)照，無菌去離子水為空白對(duì)照。 瓊脂糖凝膠電泳分析ＰＣＲ 擴(kuò)增結(jié)果（圖１Ａ）顯示，創(chuàng)傷弧菌重組質(zhì)粒ｖｖｈＡ 基因?yàn)殛栃?，條帶清晰，片段大小為５１９ ｂｐ，符合目的條帶大小，說明成功構(gòu)建了創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 重組質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜如圖１Ｂ 所示。

２.２ 創(chuàng)傷弧菌重組質(zhì)粒的濃度及純度分析

取重組質(zhì)粒１ μＬ，利用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ２０００ 測定其濃度和純度， 結(jié)果如表２ 所示， Ａ２６０/２８０、Ａ２６０/２３０ 均超過１.８，說明所提取的質(zhì)粒純度高，無蛋白質(zhì)和有機(jī)物污染；對(duì)其攜帶的基因進(jìn)行ＰＣＲ 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果（圖２Ａ）顯示，目的基因ｖｖｈＡ 條帶單一且片段大小符合預(yù)期，質(zhì)粒完整性分析（圖２Ｂ）顯示質(zhì)粒條帶完整，說明所制備的質(zhì)粒符合預(yù)期。

將４ 管大提的創(chuàng)傷弧菌重組質(zhì)粒樣品混合至１ 管中，采用紫外分光光度計(jì)測定濃度，然后用無菌去離子水稀釋至２０ ｎｇ/ μＬ，?。保埃?μＬ 分裝至２ｍＬ 螺口凍存管中，所有質(zhì)粒溶液分裝４５０ 管后，置于真空冷凍干燥機(jī)中按照冷凍程序真空冷凍干燥，獲得白色粉末狀的凍干質(zhì)粒樣品，設(shè)計(jì)創(chuàng)傷弧菌重組質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)簽紙，打印并貼在管外（圖３）。 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品置于－２０ ℃冰箱凍存。

２.３ 創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性分析

從４５０ 管質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品中隨機(jī)抽?。保?管進(jìn)行ＰＣＲ 定性試驗(yàn)，結(jié)果如圖４Ａ 所示，各管ＰＣＲ擴(kuò)增目的基因均為陽性，條帶單一且清晰，圖４Ｂ顯示質(zhì)粒完整無降解。 使用ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ ２０００ 超微量分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度、純度分析，對(duì)所測數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表３ 所示，在９５％的置信概率下，Ｆ 值小于Ｆ 臨界值，各管間質(zhì)粒含量無顯著性差異，表明質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性良好。

２.４ 創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性分析

溫度是運(yùn)輸過程中影響質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量的主要因素，因此設(shè)計(jì)不同溫度模擬質(zhì)粒樣品運(yùn)輸條件，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品目的基因陽性檢出、質(zhì)粒完整性及核酸含量變化確定其短期穩(wěn)定性（運(yùn)輸穩(wěn)定性）。 創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品分別在４ ℃和３７ ℃條件下保存１４ ｄ，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果（圖５、圖６）顯示第１ 天和第１４天目的基因均為陽性，電泳條帶單一，符合預(yù)期條帶大小，質(zhì)粒無降解；質(zhì)粒含量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖７ 所示，各時(shí)間點(diǎn)間無顯著性差異，表明質(zhì)粒含量無明顯變化，說明質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在上述條件下是穩(wěn)定的。 因此創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品可與冰袋（４ ℃）一起運(yùn)輸，也可在溫度較高（３７ ℃）且無降溫裝置條件下運(yùn)輸。

為了分析創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的長期穩(wěn)定性，在第１、２、４、６、８、１０、１２ 個(gè)月隨機(jī)抽?。?管樣品進(jìn)行定性和定量分析。創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在－２０ ℃條件下保存１２ 個(gè)月，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示第１ 個(gè)月和第１２ 個(gè)月目的基因均為陽性，電泳條帶單一，符合預(yù)期條帶大?。▓D８Ａ、Ｂ），質(zhì)粒無降解（圖８Ｃ、Ｄ）。

質(zhì)粒含量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖９ 所示，各時(shí)間點(diǎn)間無顯著性差異，表明質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在－２０ ℃ 條件下穩(wěn)定，說明創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品能在－２０ ℃條件下穩(wěn)定保存至少１２ 個(gè)月。

２.５ 創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在水產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用

為了驗(yàn)證創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在水產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用效果，將其作為陽性對(duì)照，參照ＧＢ ４７８９.４４—２０２０ 的方法，利用ＰＣＲ 對(duì)１０ 種水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌基因ｖｖｈＡ 進(jìn)行檢測，每種樣品取樣７ 次，每個(gè)樣品７ 個(gè)重復(fù)。結(jié)果如表４ 所示，在１０ 種水產(chǎn)品樣本中檢測出１例ｖｖｈＡ 基因陽性。 將陽性樣本的增菌液劃線至創(chuàng)傷弧菌鑒定平板ＣＣ 平板和ｍＣＰＣ 平板中，每種平板重復(fù)劃線３ 次，３７ ℃ 培養(yǎng)１８ ｈ，平板菌落為黃色、圓形且扁平（圖１０）。 挑取菌落按照ＧＢ４７８９.４４—２０２０ 要求進(jìn)行生化鑒定（圖１１、表５），驗(yàn)證此陽性樣本感染創(chuàng)傷弧菌。

３ 討論與結(jié)論

本研究構(gòu)建了創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 的重組質(zhì)粒ＰＵＣ－ＳＰ－ｖｖｈＡ，經(jīng)測序驗(yàn)證后，將質(zhì)粒樣品真空冷凍干燥制成創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品凍干粉。 對(duì)其進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性分析，檢測結(jié)果均為陽性且符合目的基因片段的大小，質(zhì)粒樣品無降解；均勻性分析定量檢測結(jié)果表明，質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品無管間差異，均勻性良好；穩(wěn)定性分析定量檢測結(jié)果表明，質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在低溫（４ ℃）或高溫（３７ ℃）下可穩(wěn)定保存１４ 天；在－２０ ℃下長期存儲(chǔ)１２ 個(gè)月，亦未觀測到不穩(wěn)定性。 將所研制的創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)用于１０ 種海鮮產(chǎn)品的檢測，檢出１ 份陽性樣本，經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)法和生化鑒定驗(yàn)證，證實(shí)陽性樣本確為創(chuàng)傷弧菌污染，表明質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠滿足水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌溶血素基因ｖｖｈＡ 的快速、精確檢測。 該研究填補(bǔ)了我國創(chuàng)傷弧菌鑒定即用型質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的空白，為創(chuàng)傷弧菌質(zhì)粒定性標(biāo)準(zhǔn)樣品在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究打下了良好的基礎(chǔ)。

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