陳國雯，王中一，邱山桐，尤 婷，岳 濤，蒲思思，張雨星，王桂榮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)是在懷孕母馬血清中發(fā)現(xiàn)的一種重要的糖蛋白激素[1]，由馬屬(Equus)動(dòng)物胎盤的尿囊絨毛膜細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟、排卵等多種功能[2]。臨床上，PMSG 常作為治療母畜靜止性發(fā)情、隱性發(fā)情、久配不孕等癥狀的獸用藥物。研究表明：PMSG 代謝可對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成不同程度的影響。KARABULUT 等[3]研究發(fā)現(xiàn)：過量或頻繁使用PMSG 時(shí)，肝臟、腎臟、卵巢、子宮等會(huì)出現(xiàn)損傷；LIN 等[4]研究發(fā)現(xiàn)：高劑量PMSG 會(huì)對(duì)體外受精小鼠胚胎的發(fā)育能力產(chǎn)生不利影響，并導(dǎo)致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的非整倍性；鄧凱偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)：PMSG 代謝緩慢會(huì)影響動(dòng)物發(fā)情。

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，藥物進(jìn)入機(jī)體后，主要由肝臟中的藥物代謝酶進(jìn)行分解代謝[6]。細(xì)胞色素酶P450 (cytochrome P450，CYP450)是電子傳遞鏈中的末端加氧酶，為含有1 個(gè)亞鐵血紅蛋白素輔助因子的超家族蛋白，是參與藥物代謝的I 相代謝酶[7-8]。細(xì)胞色素酶P450 17A1 (cytochrome P450 17A1，CYP17A1)是CYP450 超家族成員之一，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，在卵巢和肝臟中表達(dá)較多[9-10]；其作為合成雄激素的限速酶，參與早期卵泡生長發(fā)育，同時(shí)參與調(diào)節(jié)黃體顆粒細(xì)胞分泌孕酮[11]。孕烷X 受體(pregnane X receptor，PXR)是核受體家族的重要成員之一，由NR1I2基因編碼[12]，屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，主要在肝臟、小腸、胃、腎臟等組織中表達(dá)[13]，可調(diào)控藥物代謝酶的表達(dá)，影響藥物在肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而影響其在機(jī)體的肝臟代謝，是機(jī)體對(duì)抗內(nèi)外源物質(zhì)的重要調(diào)控因子[14-15]，所以PXR 常被視為藥物代謝的關(guān)鍵因子。

連翹(Forsythia suspensa)為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物，對(duì)藥物性肝損傷具有潛在的治療和保護(hù)作用，是中藥臨床常用傳統(tǒng)藥物，又名青翹、落翹等[16]。有研究發(fā)現(xiàn)：連翹葉中含有連翹苷、連翹酯苷A、連翹脂素等多種化學(xué)成分，其中連翹苷和連翹酯苷的含量遠(yuǎn)高于在連翹果中的含量[17]，這些化合物具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌、抗炎、保肝、降低血糖和血脂等生物活性[18]。此外，范碧玥等[19]研究發(fā)現(xiàn)：連翹葉酶—醇提取物可以改善由對(duì)乙酰氨基酚造成的氧化應(yīng)激。目前鮮有關(guān)于PMSG 在肝臟代謝的研究，且針對(duì)PMSG 代謝緩慢而造成的機(jī)體損傷還沒有具體解決方案，本研究旨在探究連翹葉提取物對(duì)PMSG 在肝臟代謝的影響及其影響代謝的可能機(jī)制，以期改善在畜牧生產(chǎn)中因PMSG 代謝緩慢而造成的氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明雌鼠144 只，平均體質(zhì)量(25±5) g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，飼養(yǎng)于22～26 ℃環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(GAU-LC-2020-33)。

1.1.2 主要試劑

PMSG 購自寧波三生生物科技有限公司；連翹葉采自甘肅省天水市秦嶺鎮(zhèn)；兔抗CYP17A1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗GAPDH 抗體和兔抗PXR 抗體購自美國affinity 公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(cerealthirdtransaminase，ALT)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；RIPA 裂解液購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 連翹葉提取物的制備

采用半仿生酶醇法提取連翹葉有效成分。稱取連翹葉粉末30 g，按料液比1∶8 (g∶mL)加入60%乙醇240 mL，密封后浸泡30 min，68 ℃水浴回流1 h，抽濾后收集濾液；在所得濾渣中加入纖維素酶0.15 g 和60%乙醇240 mL，50 ℃水浴回流2 h，抽濾后收集濾液。合并2 次所得濾液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)濃縮后于-80 ℃冷凍過夜，再用冷凍干燥機(jī)凍干72 h，收集連翹葉凍干粉末，做好標(biāo)記后放置于干燥陰涼處備用。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理

取連翹葉提取物粉末溶解于0.5%羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)中，分別配制成100、200 和400 mg/kg 的藥液；將PMSG 用生理鹽水稀釋，于4 ℃保存?zhèn)溆?。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將144 只昆明小鼠隨機(jī)分成6 組，分別為正常對(duì)照組(NC 組)、PMSG 模型組(PMSG 組)、連翹葉提取物低劑量組(LFSLE+PMSG 組)、連翹葉提取物中劑量組(MFSLE+PMSG 組)、連翹葉提取物高劑量組(HFSLE+PMSG 組)和高劑量藥物對(duì)照組(FSLE 組)。NC 組灌胃0.5% CMC 溶液，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG、HFSLE+PMSG和FSLE 組分別灌胃100、200、400 和400 mg/kg連翹葉提取物藥液，每天2 次，連續(xù)4 d；末次灌胃12 h 后，除NC 組和FSLE 組外，其余各組分別腹腔注射10 IU PMSG，后分別于12、24 和48 h采集小鼠肝臟及血清樣本，每次采集8 只小鼠。

1.2.3 血清PMSG 代謝水平的檢測

取分離后的血清作為待測樣本，按照PMSG酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行操作，得到小鼠血清中PMSG 終質(zhì)量濃度。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

采集小鼠肝臟，稱取適量肝臟組織，按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，用CT15RE日立卓上微量高速冷凍離心機(jī)(株式會(huì)社日立制作所)進(jìn)行離心，檢測GSH、SOD 和 MDA 水平的轉(zhuǎn)速為2 500 r/min，檢測H2O2水平的轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，之后取上清備用，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定SOD 活性以及GSH、MDA和H2O2的含量。

1.2.5 小鼠肝臟中PXR 和CYP17A1 蛋白表達(dá)的檢測

分別取各組小鼠肝臟20 mg，加入RIPA 裂解液200 μL，采用冷凍型組織研磨器充分研磨后28 820 r/min 離心5 min，取上清液即為蛋白原液；加入5×蛋白上樣緩沖液50 μL，混合均勻，于100 ℃恒溫變性蛋白10 min。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法轉(zhuǎn)膜，后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，于4 ℃一抗孵育過夜(GAPDH 1∶4 000 稀釋；PXR 1∶1 500 稀釋；CYP17A1 1∶1 000 稀釋)，加入二抗室溫孵育，后用AmershamImager600 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE 公司)進(jìn)行曝光，利用ImageJ 分析灰度值，進(jìn)而得到PXR 和CYP17A1 的蛋白表達(dá)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 21 分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差(one-way ANOVA)分析組間差異；使用Graphpad Prism 9.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 連翹葉提取物對(duì)小鼠血清中PMSG 代謝水平的影響

由圖1 可知：與NC 組相比，處理12、24 和48 h 后PMSG 組小鼠血清PMSG 水平極顯著升高(P＜0.01)；與PMSG 組相比，處理12、24 和48 h后LFSLE+PMSG 組、MFSLE+PMSG 組和HFSLE+PMSG 組小鼠血清PMSG 水平均顯著或極顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)；而不同處理時(shí)間下、同一處理組之間小鼠血清PMSG 水平均無顯著差異。說明連翹葉提取物可顯著降低不同處理時(shí)間段小鼠血清中的PMSG 水平，加快PMSG 在小鼠肝臟的代謝，且HFSLE+PMSG 組效果最佳。

圖1 連翹葉提取物對(duì)PMSG 代謝水平的影響Fig.1 Effects of Forsythia suspensa leaves extract (FSLE)on the metabolic level of PMSG

2.2 連翹葉提取物對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平的影響

由圖2 可知：與NC 組相比，處理12、24 和48 h 后PMSG 組小鼠肝臟中SOD 活性和GSH 含量極顯著降低(P＜0.01)，MDA 和H2O2含量極顯著升高(P＜0.01)。與PMSG 組相比，小鼠給藥12 h后，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組小鼠肝臟中SOD 活性顯著或極顯著增強(qiáng)(P＜0.05 或P＜0.01)、MDA 含量極顯著降低(P＜0.01)、H2O2含量顯著或極顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組的GSH 含量顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)；小鼠給藥24 h 后，MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組小鼠肝組織中SOD 活性顯著或極顯著增強(qiáng)(P＜0.05 或P＜0.01)，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 組的GSH 含量顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)、MDA 和H2O2含量極顯著降低(P＜0.01)；小鼠給藥48 h 后，MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 組小鼠肝臟中SOD 活性極顯著升高(P＜0.01)、GSH 含量顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 組的MDA 和H2O2含量顯著或極顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)。綜上所述，連翹葉提取物可顯著提高SOD 活性和GSH 含量、顯著降低MDA 和H2O2含量，改善因PMSG 代謝而引起的氧化應(yīng)激，且MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組效果最佳。

2.3 連翹葉提取物對(duì)小鼠肝臟CYP17A1 蛋白表達(dá)水平的影響

由圖3 可知：與NC 組相比，處理12 h 后PMSG 組小鼠肝臟CYP17A1 蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P＜0.01)，處理24 和48 h 后顯著升高(P＜0.05)；與PMSG 組相比，處理12 和48 h 后HFSLE+PMSG組小鼠肝臟CYP17A1 蛋白水平均極顯著降低(P＜0.01)，處理24 h 后MFSLE+PMSG 組CYP17A1 蛋白水平顯著降低(P＜0.05)，處理48 h 后MFSLE+PMSG 組CYP17A1 蛋白水平極顯著降低(P＜0.01)。說明連翹葉提取物可顯著下調(diào)小鼠肝組織中CYP17A1 蛋白的表達(dá)，且HFSLE+PMSG 組效果最明顯。

2.4 連翹葉提取物對(duì)小鼠肝臟PXR 蛋白表達(dá)水平的影響

由圖4 可知：與NC 組相比，處理12、24 和48 h 后PMSG 組小鼠肝臟PXR 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)；與PMSG 組相比，處理12 h 后MFSLE+PMSG 組PXR 蛋白水平顯著降低(P＜0.05)，處理24 h 后LFSLE+PMSG 組蛋白水平顯著降低(P＜0.05)，處理48 h 后LFSLE+PMSG 組PXR 蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P＜0.01)。說明連翹葉提取物可顯著下調(diào)小鼠肝臟中PXR 蛋白的表達(dá)，且LFSLE+PMSG 組效果最明顯。

圖4 連翹葉提取物對(duì)小鼠肝臟PXR 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of FSLE on the PXR protein expression levels in mouse liver

3 討論

孕馬血清促性腺激素(PMSG)通常被用于提高動(dòng)物的繁殖力[20]，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。由于PMSG 分子中N-乙酰-神經(jīng)氨酸的含量較高，導(dǎo)致其在動(dòng)物血液中的半衰期較長，一般為40～150 h[21]。有研究表明：由于PMSG 代謝較慢，長時(shí)間存在于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)會(huì)引發(fā)卵巢囊腫[22]；PARK 等[23]研究也發(fā)現(xiàn)：PMSG 在動(dòng)物機(jī)體代謝過程中會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。為了減少PMSG在畜牧生產(chǎn)使用中對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的傷害，研究生產(chǎn)可以加快PMSG 代謝的藥物尤為重要。本研究表明：注射PMSG 12、24 和48 h 后，小鼠血清中PMSG 水平極顯著升高，而連翹葉提取物可以顯著降低小鼠血清中PMSG 水平，表明連翹葉提取物可以加速PMSG 在小鼠肝臟的代謝。這一結(jié)果可為解決PMSG 因代謝緩慢而造成的機(jī)體損傷提供參考，也為其他藥物因代謝而引起的動(dòng)物機(jī)體氧化應(yīng)激和代謝性疾病研究提供解決途徑。

氧化應(yīng)激是機(jī)體抵御外源性有害物質(zhì)攻擊的自我保護(hù)方式，同時(shí)也是調(diào)控有害物質(zhì)攻擊機(jī)體的復(fù)雜過程[24]。機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，當(dāng)ROS 的含量大于正常水平時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 等生物大分子的結(jié)構(gòu)，從而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[25]。GSH 是一種水溶性的抗氧化物，其活性巰基結(jié)構(gòu)是重要的功能基團(tuán)，可維持機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡，抵抗氧化應(yīng)激損傷[26]。SOD 是體內(nèi)催化歧化反應(yīng)的一種抗氧化保護(hù)酶，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著重要的作用，它可通過歧化反應(yīng)將氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和O2[27]，其強(qiáng)弱在一定程度上可反映機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力。MDA 由機(jī)體氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生，其含量反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞損傷的程度[28]。本研究表明：注射PMSG 12、24 和48 h 后，小鼠肝組織中SOD 和GSH 水平均顯著降低、MDA 和H2O2水平均顯著升高，但連翹葉提取物可顯著提高SOD 和GSH 水平并顯著降低MDA 和H2O2水平，與安志霞等[29]的研究結(jié)果基本一致，表明連翹葉提取物具有良好的抗氧化作用，可以明顯改善動(dòng)物機(jī)體因PMSG 代謝而引起的氧化應(yīng)激。

CYP450 是I 相代謝酶，主要參與藥物代謝[30]。CYP17A1 作為其家族成員之一，可以在肝臟高表達(dá)，CYP17A1 編碼產(chǎn)生的P450c17 蛋白具有17a-羥化酶和17,20-碳鏈裂解酶活性，是類固醇激素合成途徑的關(guān)鍵酶[31]。KONG 等[32]研究發(fā)現(xiàn)：CYP17A1 酶活性高表達(dá)可以觸發(fā)ROS 在機(jī)體內(nèi)大量積累，從而引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激；王旭等[33]研究表明：CYP17A1 上調(diào)時(shí)可以引起腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激；本研究也表明：小鼠注射PMSG后CYP17A1 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激。給予小鼠不同含量的連翹葉提取物，CYP17A1 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，表明連翹葉提取物可以通過下調(diào)CYP17A1 來緩解PMSG 對(duì)CYP17A1 上調(diào)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這為連翹葉提取物可緩解因藥物代謝引起的氧化應(yīng)激提供了更有利的證據(jù)。

PXR 是肝臟解毒的重要核轉(zhuǎn)錄因子，也是調(diào)控CYP450 家族基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，可影響外源性物質(zhì)的毒性[34]。PXR 也被稱為類固醇和異源感應(yīng)核受體，最初在小鼠中被發(fā)現(xiàn)，可被天然類固醇(如孕烯醇酮和孕酮)以及合成糖皮質(zhì)激素激動(dòng)劑和拮抗劑激活，在肝臟和腸道高度表達(dá)[35-36]。PXR 可通過調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)直接參與機(jī)體脂質(zhì)、膽固醇和糖代謝，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[37]。KIM 等[38]研究發(fā)現(xiàn)：PXR 上調(diào)伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生；本研究也顯示：小鼠注射PMSG 后PXR 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)伴有小鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激；給予小鼠不同含量的連翹葉提取物藥液后PXR 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，表明連翹葉提取物可以通過下調(diào)PXR 的表達(dá)來緩解PMSG 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

4 結(jié)論

PMSG 代謝會(huì)引起小鼠機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，連翹葉提取物可以加速PMSG 的代謝，并可以通過下調(diào)CYP17A1 和PXR 蛋白的表達(dá)減緩PMSG誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。