趙宗磊，陳頌歌，孫鎖峰，王麗霞

(河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科,河南 鄭州 450000)

近年來,心肌梗死及其導(dǎo)致的心力衰竭發(fā)病率逐年上升[1]。心肌細(xì)胞受損后增殖能力明顯降低,有研究發(fā)現(xiàn),靶向內(nèi)源性基因可促進心肌細(xì)胞原位增殖,促進心肌細(xì)胞再生,進而改善心肌梗死后心功能[2]。蛋白酶N1(protein kinase N1,PKN1)是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白激酶,是磷酸鳥苷結(jié)合蛋白的下游作用靶點[3]。PKN1可發(fā)揮信號傳導(dǎo)作用,其活性異常與多種人類疾病及其病理發(fā)展過程密切相關(guān),如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥及動脈損傷后再狹窄[4-5]。有研究表明,PKN1在心臟中起保護作用,干擾PKN1表達可抑制心肌細(xì)胞收縮功能[6-7]。然而,PKN1對心肌細(xì)胞增殖的作用及機制目前尚不清楚。本研究旨在探討PKN1對小鼠心肌細(xì)胞增殖的作用及機制,以期為心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控提供新的靶點,為心肌梗死后心肌損傷的治療提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12只健康1日齡C57BL/6雄性小鼠乳鼠,無特定病原級,體質(zhì)量(4.0±0.2)g,購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗動物中心。所有動物實驗均獲得河南省人民醫(yī)院動物研究委員會的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

動物用異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司,PKN1干擾片段及對照片段購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司,PKN1干擾腺病毒及空載腺病毒購自漢恒生物科技(上海)有限公司,胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司,PKN1抗體、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)抗體、Ki-67抗體、cyclin D1抗體購自英國Abcam公司,β-actin抗體、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗購自上海普邁生物科技有限公司,RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司,RNA提取試劑盒、SYBRs Premix Ex TaqTM試劑盒購自寶生物工程 (大連) 有限公司;熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購自瑞士Roche公司,熒光共聚焦顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司,電泳槽、電轉(zhuǎn)膜裝置購自美國Bio-Rad公司,細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、冰凍切片機購自美國Thermo Fisher公司;所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及分組

使用異氟烷麻醉1日齡小鼠2只,分離心室并切成小塊,用胰蛋白酶37 ℃消化2次,每次消化15 min,離心后收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM中,培養(yǎng)于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。孵育2 h后,收集上清液中的小鼠心肌細(xì)胞,并接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿,分為對照組和干擾組,每組5個細(xì)胞培養(yǎng)皿。干擾組心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染PKN1干擾片段,對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照片段,轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2 動物分組與處理

按照隨機數(shù)字表法將10只小鼠分為正常組和觀察組,每組5只。觀察組小鼠于心臟原位注射 PKN1干擾腺病毒(1×109PFU),正常組小鼠于心臟原位注射空載腺病毒(1×109PFU),由母鼠喂養(yǎng)至7 d后進行后續(xù)實驗。

1.3.3 免疫熒光法檢測小鼠心肌細(xì)胞增殖能力

取對照組和干擾組心肌細(xì)胞,吸去培養(yǎng)基,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次,多聚甲醛固定30 min,Triton 破膜后,滴加含體積分?jǐn)?shù)1%牛血清白蛋白的PBS封閉60 min,滴加細(xì)胞增殖核抗原Ki-67一抗,室溫下孵育2 h,吸去一抗,PBS洗滌3次,滴加山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h,吸去二抗,PBS洗滌3次,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液孵育15 min,使用PBS溶液洗滌,將染色完成的心肌細(xì)胞置于共聚焦顯微鏡下進行圖像采集。

取正常組和觀察組小鼠,分離心臟組織,PBS洗滌3次,將心臟組織置于冰凍切片包埋盒中,加入冰凍包埋劑置于-20 ℃中包埋固定。使用冰凍切片機將心臟組織切片(厚3.5 μm),并將心臟組織切片貼于玻璃載玻片中,加入多聚甲醛固定30 min,加入Triton 破膜,滴加含體積分?jǐn)?shù)1%牛血清白蛋白的PBS封閉60 min,滴加細(xì)胞增殖核抗原Ki-67一抗,室溫下孵育2 h,吸去一抗,PBS洗滌3次,滴加山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h,吸去二抗,PBS洗滌3次,加入DAPI染液孵育15 min,使用PBS洗滌后用甘油封片,將染色完成的心肌組織切片置于共聚焦顯微鏡下進行圖像采集。

共聚焦顯微鏡下可見心肌細(xì)胞核被DAPI染成藍色,心肌細(xì)胞中心肌結(jié)構(gòu)蛋白 cTnT 陽性表達顯示為綠色熒光,心肌細(xì)胞核中Ki-67陽性表達顯示為紅色熒光。每個樣本隨機選取3個視野,視野中Ki-67陽性表達的心肌細(xì)胞數(shù)與視野中全部心肌細(xì)胞數(shù)的比值為Ki-67陽性表達率,取均值。Ki-67陽性表達率越高表示細(xì)胞增殖能力越強。

1.3.4 實時熒光定量PCR法檢測對照組和干擾組心肌細(xì)胞中PKN1 mRNA表達

取對照組和干擾組心肌細(xì)胞,根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取心肌細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA,使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。使用實時熒光定量PCR儀進行實時定量PCR,反應(yīng)體系:SYBRs Premix Ex Taq 5 μL、上下游引物各 0.2 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 3.6 μL;反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃ 退火/延伸 30 s, 共40個循環(huán)。PKN1上游引物序列為 5′-AAGCGATGCTACCCAATC-3′,下游引物序列為5′-GCTCTACGGCTCCCAGTT-3′;β-tubulin上游引物序列為5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′,下游引物序列為5′-TTGATGTCACGCACGATTTCC-3′。以β-tubulin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.3.5 Western blot法檢測對照組和干擾組心肌細(xì)胞中PKN1和cyclin D1蛋白表達

取對照組和干擾組心肌細(xì)胞,分別加入含蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法裂解緩沖液,4 ℃下裂解 30 min,離心后收集的上清液即為總蛋白提取物。使用二喹啉甲酸法蛋白質(zhì)定量分析試劑盒測定蛋白濃度,然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜置于含有體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白的Tris鹽酸緩沖鹽溶液中,室溫封閉2 h,滴加PKN1一抗(滴度為11 000)、cyclin D1一抗(滴度為11 000)、β-tubulin一抗(滴度為15 000),4 ℃孵育過夜。用含吐溫20的Tris鹽酸緩沖鹽溶液洗滌3次,滴加山羊抗兔二抗,室溫下孵育1 h,加入電化學(xué)發(fā)光顯色液顯影,使用化學(xué)發(fā)光成像儀成像。應(yīng)用Image J軟件檢測各條帶灰度值,以β-tubulin為內(nèi)參,以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌細(xì)胞和心肌組織中Ki-67陽性表達率比較

對照組和干擾組心肌細(xì)胞中Ki-67陽性表達率分別為(15.44±1.87)%、(8.54±1.33)%,正常組和觀察組小鼠心肌組織中Ki-67陽性表達率分別為(13.70±1.60)%、(5.14±1.00)%。干擾組心肌細(xì)胞中Ki-67陽性表達率均顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.201,P<0.01)。觀察組小鼠心肌組織中Ki-67陽性表達率顯著低于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)(t=11.851,P<0.01)。結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 對照組和干擾組心肌細(xì)胞中Ki-67表達情況(免疫熒光法,×200)

圖2 正常組和觀察組小鼠心肌組織中Ki-67表達情況(免疫熒光法,×200)

2.2 對照組與干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1 mRNA相對表達量比較

對照組和干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1 mRNA相對表達量分別為1.007±0.025、0.430±0.140。干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1 mRNA相對表達量顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.022,P<0.01)。

2.3 對照組與干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1和cyclin D1蛋白相對表達量比較

對照組和干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1蛋白相對表達量分別為0.983±0.165、0.317±0.113,對照組和干擾組小鼠心肌細(xì)胞中cyclin D1蛋白相對表達量分別為0.747±0.116、0.237±0.055。干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1和cyclin D1蛋白相對表達量均顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.762、6.884,P<0.01)。結(jié)果見圖3。

圖3 對照組和干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1和cyclin D1蛋白表達(Western blot)

3 討論

心肌梗死及心肌梗死導(dǎo)致的心力衰竭嚴(yán)重威脅著人類健康,是心血管疾病患者的主要死因之一[8]。心肌梗死會導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆的壞死,因此,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖是改善心肌梗死后心功能的一種有效方法[9]。尋找內(nèi)源性靶點進而促進心肌細(xì)胞增殖被視為一種心肌梗死及心力衰竭后促進心肌組織修復(fù)的途徑[10]。PKN1是體內(nèi)重要的信號調(diào)控因子,在心血管疾病如動脈損傷后再狹窄和心肌缺血中發(fā)揮著重要的作用[11]。FRANCOIS等[7]研究表明,過表達PKN1可以促進多種細(xì)胞如血管平滑肌細(xì)胞和上皮干細(xì)胞增殖及遷移。但PKN1能否調(diào)控心肌細(xì)胞增殖目前尚不清楚。Cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白,對整個細(xì)胞周期調(diào)控至關(guān)重要[12]。調(diào)控細(xì)胞周期可以促進腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞及心肌細(xì)胞增殖,對于調(diào)控疾病發(fā)展非常重要[13-15]。然而,PKN1能否通過調(diào)節(jié)cyclin D1介導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖目前尚不清楚。

本研究通過小鼠體內(nèi)外實驗顯示,干擾組心肌細(xì)胞中Ki-67陽性表達率均顯著低于對照組,觀察組小鼠心肌組織中Ki-67陽性表達率顯著低于正常組;此外,本研究結(jié)果表明,干擾組小鼠心肌細(xì)胞中PKN1 蛋白和mRNA相對表達量均顯著低于對照組。這表明,通過降低小鼠心肌細(xì)胞中PKN1表達,可抑制小鼠心肌細(xì)胞的增殖能力。

為了探究PKN1調(diào)控心肌細(xì)胞增殖的機制,本研究通過 Western blot檢測cyclin D1蛋白表達,結(jié)果顯示,干擾組小鼠心肌細(xì)胞中cyclin D1蛋白相對表達量顯著低于對照組;這表明,在小鼠心肌細(xì)胞中PKN1表達降低可抑制cyclin D1蛋白表達,從而抑制心肌細(xì)胞增殖,其機制可能與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。

4 結(jié)論

在小鼠心肌細(xì)胞中PKN1表達降低可抑制cyclin D1蛋白表達,從而抑制心肌細(xì)胞增殖。本研究為調(diào)控心肌細(xì)胞增殖提供了新的靶點,為心肌梗死后心功能恢復(fù)奠定基礎(chǔ)。未來將通過設(shè)置PKN1高表達組進一步驗證PKN1對心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及機制。