侯德淼 唐梓晉 李卓 熊禮順 晏怡果

(南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院脊柱外科,湖南 衡陽(yáng) 421001)

干細(xì)胞外泌體(Exo)的應(yīng)用和臨床治療潛力已成為再生醫(yī)學(xué)研究的新主流。干細(xì)胞Exo富含細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、信號(hào)脂質(zhì)和調(diào)控小分子RNA(miRNA),在骨科系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)等系統(tǒng)疾病的診斷和治療中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是目前研究中最常用的細(xì)胞類(lèi)型之一,是治療人類(lèi)疾病的一種基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)療法。干細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡(EV),包括Exo和微囊泡(MV)。它們參與細(xì)胞間的通訊,對(duì)靶細(xì)胞的作用主要包括自分泌、旁分泌和遠(yuǎn)距分泌。蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和核酸從Exo轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞,并有效地改變細(xì)胞或組織的代謝和生物反應(yīng)。此外,Exo還可以重新編程免疫細(xì)胞,并激活內(nèi)源性修復(fù)途徑,影響組織對(duì)損傷、感染和疾病的反應(yīng)。

在骨關(guān)節(jié)炎(OA)、骨質(zhì)疏松(OP)、椎間盤(pán)退變(IVDD)等多種老年骨科疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療中干細(xì)胞Exo發(fā)揮著重要作用。Exo在調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)途徑方面的固有特性已使其在許多疾病的治療控制中發(fā)揮了潛在的作用。Exo可以被設(shè)計(jì)成輸送不同治療的有效載體,包括短干擾RNA、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調(diào)節(jié)劑,并且具有將其輸送到所需靶點(diǎn)的能力。本文就干細(xì)胞Exo的在骨科疾病中的發(fā)病機(jī)制,及其作為治療載體在老年骨科疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

1 OA

1.1骨髓MSCs(BMSCs)Exo BMSCs的Exo(BMSCs-Exo)可以影響細(xì)胞命運(yùn),包括增殖、遷移、侵襲和凋亡。Chen等〔1〕發(fā)現(xiàn),BMSC-Exos可以挽救退行性軟骨細(xì)胞的線粒體功能障礙,還可以通過(guò)抑制受體活化因子(RANK)L-RANK-腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子(TRAF)6信號(hào)通路抑制軟骨下骨中破骨細(xì)胞的活性。還有一些研究發(fā)現(xiàn)〔2～4〕BMSC-Exo顯著促進(jìn)軟骨和軟骨下骨的再生和修復(fù),還可以通過(guò)顯著增加骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中合成代謝標(biāo)記物的表達(dá),并降低了分解代謝標(biāo)記基因的水平,以防止OA軟骨細(xì)胞凋亡〔5〕。

1.2滑膜MSCs(SMSCs)Exo SMSCs在體外表現(xiàn)出良好的軟骨分化能力,關(guān)節(jié)內(nèi)注射SMSCs可明顯促進(jìn)軟骨修復(fù),在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中可用于治療OA〔6〕。Tao等〔7〕發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-140-5p的SMSCs衍生的Exo(SMSC-140-Exos)不僅能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移,還能防止體外細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)損傷。此外,在大鼠OA模型中,SMSC-140-Exos治療可顯著減輕關(guān)節(jié)磨損,降低國(guó)際關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會(huì)(OARSI)評(píng)分并延遲OA進(jìn)展。此外,Zhu等〔8〕發(fā)現(xiàn),SMSC-Exos不僅能促進(jìn)體外軟骨細(xì)胞的遷移和增殖,而且在膠原酶誘導(dǎo)的小鼠OA模型中,SMSC-Exos提高了國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(ICRS)評(píng)分,低了OARSI評(píng)分,并維持了軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原含量〔8〕。Guo等〔9〕使用Micro-CT分析顯示SMSC-Exos顯著改善了大鼠股骨頭壞死的骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)和礦物質(zhì)密度。骨重塑(包括軟骨下骨改變和骨贅形成)是OA過(guò)程中常見(jiàn)的現(xiàn)象,且與OA進(jìn)展密切相關(guān)〔9〕,因此,SMSCs或其他細(xì)胞來(lái)源的Exo在OA發(fā)病過(guò)程中的骨重塑作用值得研究。

1.3脂肪MSCs(AMSCs)Exo AMSCs在軟骨再生中有很強(qiáng)的潛力,被認(rèn)為是治療OA的良好細(xì)胞源。Tofio-Vian等〔10〕發(fā)現(xiàn)脂肪源性Exo介導(dǎo)對(duì)OA成骨細(xì)胞的旁分泌效應(yīng),顯著降低與衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶和γH2AX的活性。此外AMSC-Exos可以抑制TNF-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、前列腺素(PG)E2和一氧化氮(NO)等促炎介質(zhì)的產(chǎn)生,同時(shí)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性和MMP-13水平升高,同時(shí)提高抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-10和軟骨細(xì)胞特異性Ⅱ型膠原分子的水平〔11〕。Zhao等〔12〕通過(guò)人脂肪分離出的AMSC-Exos發(fā)現(xiàn),Exo能上調(diào)miR145和miR221并下調(diào)促炎基因的表達(dá)促進(jìn)軟骨形成并抑制炎癥。在一項(xiàng)活體實(shí)驗(yàn)中,Woo等〔13〕發(fā)現(xiàn),AMSC-Exos可以增強(qiáng)人OA軟骨細(xì)胞的增殖和遷移,并維持軟骨ECM。

1.4胚胎MSC(EMSCs)Exo EMSCs的Exo能調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)表型,能在OA模型中延緩OA進(jìn)展〔14,15〕。Zhang等〔16〕在大鼠骨軟骨損傷處注射人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的Exo后,他們觀察到軟骨和軟骨下骨的損傷在6 w時(shí)基本逆轉(zhuǎn),在12 w時(shí)幾乎完全恢復(fù),此外,這些Exo就能顯著促進(jìn)新組織形成和ECM質(zhì)沉積,增加M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。與MSC相比,MSC-Exos在治療OA時(shí)更為保險(xiǎn)、便捷和高效。相信隨著研究的更近一步,Exo將在OA的臨床診治中發(fā)揮更大的作用。

2 OP

OP是臨床常見(jiàn)的老年慢性疾病,以骨量減少、骨脆性增加及骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征〔17〕。大量研究證據(jù)表明,Exo可以直接影響破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨基質(zhì)干細(xì)胞,以調(diào)節(jié)骨的形成和吸收〔18～20〕,也可以誘導(dǎo)MSC向骨細(xì)胞分化〔21〕。

2.1骨髓基質(zhì)源性Exo Luo等〔22〕研究發(fā)現(xiàn),骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST)衍生的Exo(ST-Exos)在體外顯著增強(qiáng)BMSCs的成骨分化。將ST-Exo傳遞到BMSCs中,讓ST-Exo表面與BMSCs特異性適配子結(jié)合,形成ST-Exos復(fù)合物,再將ST-Exos復(fù)合物靜脈注射到卵巢切除術(shù)(OVX)引起的OP小鼠模型中,結(jié)果證明了BMSCs特異性適配體功能化ST-Exos靶向增強(qiáng)OVX小鼠的骨量,加速小鼠股骨骨折模型的骨愈合〔22〕。Qiu等〔23〕及其團(tuán)隊(duì)利用BMSC-Exos進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)BMSC-Exos可減弱OP,闡明了Exo中miR-1503p上調(diào)可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化。

2.2破骨細(xì)胞衍生Exo Zhu等〔24〕通過(guò)使用磁羥基磷灰石(MHA)支架改變破骨細(xì)胞來(lái)源的Exo,降低成骨細(xì)胞攝取Exo效率,促進(jìn)了OP模型中的成骨細(xì)胞增殖,值得注意的是,在MHA刺激下,破骨細(xì)胞來(lái)源的Exo中,包括泛素、ATP和活性氧在內(nèi)的某些蛋白質(zhì)減少。

2.3內(nèi)皮細(xì)胞源性Exo Song等〔25〕發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)分泌的Exo(EC-Exos) 的骨靶向作用比成骨細(xì)胞來(lái)源的Exo或BMSC-Exo更強(qiáng),EC-exos可以抑制破骨細(xì)胞活性,而且還發(fā)現(xiàn)EC-Exos內(nèi)源性物質(zhì)miR-155有治療OP的潛力。

2.4Exos作為潛在的生物標(biāo)志物在老年人OP早期診斷、臨床干預(yù)和預(yù)后評(píng)估方面同樣具有良好的應(yīng)用前景〔26,27〕。不同細(xì)胞來(lái)源Exo對(duì)OP的作用機(jī)制主要涉及激活各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而影響骨重建過(guò)程中成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。但哪種細(xì)胞來(lái)源的ECM更適合作為治療的新型生物制劑,仍需從Exo的產(chǎn)量、成骨能力等多因素綜合分析。

3 椎間盤(pán)退行性病變(IVDD)

IVDD是與年齡有關(guān)的生物學(xué)改變,退變是衰老的過(guò)程。在IVDD過(guò)程中,髓核細(xì)胞的凋亡可能是髓核區(qū)域內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少的重要原因〔28〕。MSC-Exos對(duì)IVDD的保護(hù)作用,有助于抑制髓核細(xì)胞(NPCs)的凋亡〔29〕。NPC吸收純化的MSC-Exos,MSC-Exos中miR-21富集,而凋亡NPCs中miR-21水平下調(diào)。Exo中的miR-21通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT途徑靶向磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)〔31〕,轉(zhuǎn)移到髓核細(xì)胞中,緩解TNF-α誘導(dǎo)的NPC凋亡〔29,30〕。此外,有研究〔31〕發(fā)現(xiàn)MSC-Exos可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,抑制椎間盤(pán)退變期間髓核細(xì)胞過(guò)度凋亡,MSC-Exos通過(guò)激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此,MSC-Exos可以通過(guò)減少髓核細(xì)胞的死亡從而延緩IVDD的進(jìn)展。

IVDD往往伴隨著髓核ECM的丟失,椎間盤(pán)中炎性因子和基質(zhì)降解酶的大量積聚是造成這種現(xiàn)象的重要原因〔28〕。有研究〔32〕利用兔IVDD模型驗(yàn)證了Exo降低核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NLRP)3炎癥小體表達(dá)用于IVDD治療,結(jié)果證實(shí)NLRP3炎癥小體是IVDD治療的有效靶點(diǎn)。研究證明Exo對(duì)髓核細(xì)胞線粒體具有保護(hù)作用,因?yàn)镋xo可以對(duì)抗H2O2對(duì)線粒體的作用,H2O2可以破壞線粒體結(jié)構(gòu),上調(diào)活性氧(ROS),從而激活硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)/NLRP3炎癥小體和下游炎癥介質(zhì)IL-1β,進(jìn)而誘導(dǎo)ECM變性,而Exo可下調(diào)NP細(xì)胞中ROS水平,減少炎癥介質(zhì)的釋放,降低NP細(xì)胞凋亡。因此,MSC-Exos還可以通過(guò)減少ECM降解,進(jìn)而延緩IVDD的進(jìn)展。

不僅如此,軟骨終板細(xì)胞的退變與IVDD也密切相關(guān),有研究表明MSC-Exos能延緩軟骨終板細(xì)胞的凋亡和鈣化,從而延緩IVDD,有研究〔28〕通過(guò)叔丁基過(guò)氧化氫(TBHP)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型和IVDD大鼠模型得出這一結(jié)論,作者發(fā)現(xiàn)MSC-Exos下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),使EPCs不受氧化應(yīng)激導(dǎo)致凋亡和鈣化,而且MSC-Exo還通過(guò)表達(dá)miR-31-5抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)應(yīng)激從而抑制EPCs凋亡和鈣化〔33〕。此外,Luo等〔34〕發(fā)現(xiàn),正常軟骨終板干細(xì)胞來(lái)源的Exo(N-Exos)比退化的軟骨終板干細(xì)胞來(lái)源的Exo(D-Exos)在體外和體內(nèi)更能誘導(dǎo)自噬激活,并通過(guò)激活PI3K/AKT/自噬通路抑制髓核細(xì)胞凋亡和減緩IVDD的進(jìn)展,Luo及其團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)軟骨終板細(xì)胞在其自分泌Exo自分泌機(jī)制誘導(dǎo)下激活低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α/Wnt信號(hào)通路,增加GATA結(jié)合蛋白4和TGF-β1的表達(dá),從而促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞向髓核遷移并向NPCs的轉(zhuǎn)化,從而抑制IVDD〔35〕。

綜上,干細(xì)胞來(lái)源的Exo能夠促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖,能夠抑制凋亡;并且,通過(guò)抑制基質(zhì)蛋白酶的積累,增加細(xì)胞外矩陣的合成,抑制分解,從而維持ECM穩(wěn)定狀態(tài),抑制炎癥因子的出現(xiàn),減少細(xì)胞微環(huán)境對(duì)髓核細(xì)胞的干涉。Exo還可以作用于軟骨終板,抑制軟骨終板細(xì)胞的凋亡和鈣化,促進(jìn)終板軟骨細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞,抑制IVDD。隨著研究的不斷深入,相信干細(xì)胞Exo在治療老年人IVDD方面能夠起到更大作用。

4 肌腱損傷

肌腱損傷分急性損傷和慢性損傷。老年人常見(jiàn)的是慢性損傷,慢性損傷是肌腱長(zhǎng)期反復(fù)經(jīng)受輕微外傷,或肌腱本身有慢性磨損,導(dǎo)致腱纖維變性、變細(xì)、日后輕微扭傷即可造成肌腱斷裂。肌腱干細(xì)胞(TSCs)是肌腱組織中發(fā)現(xiàn)的前體細(xì)胞,具有自我更新和分化的潛能,已廣泛應(yīng)用于組織工程和肌腱損傷修復(fù)中〔36〕。許多研究表明,TSCs的應(yīng)用可以有效地促進(jìn)損傷肌腱的修復(fù)和再生〔37～40〕。在一項(xiàng)研究中,Zhang等〔36〕發(fā)現(xiàn),TSC-Exos能促進(jìn)肌腱細(xì)胞的增殖和遷移,并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。Ⅰ型膠原是正常肌腱膠原蛋白的主要成分,參與肌腱結(jié)構(gòu)的形成及其力學(xué)性能〔41〕。然而,相對(duì)于Ⅰ型膠原,Ⅲ型膠原表達(dá)增加會(huì)抑制膠原纖維的生長(zhǎng),導(dǎo)致瘢痕形成〔42,43〕。研究表明,Ⅰ/Ⅲ型膠原的最佳比例可能是促進(jìn)肌腱損傷高質(zhì)量愈合的主要因素〔44〕。肌腱組織的生物力學(xué)性能與肌腱膠原纖維的直徑密切相關(guān),修復(fù)后膠原纖維直徑較大的肌腱組織比正常膠原纖維修復(fù)的肌腱組織具有更強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度〔45,46〕。在同一項(xiàng)研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)TSC-Exos在抑制瘢痕形成、增強(qiáng)肌腱損傷愈合的生物力學(xué)性能方面發(fā)揮了重要作用。另外,TSC-Exos在體內(nèi)早期炎癥反應(yīng)的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)與巨噬細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)消炎和肌腱損傷的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)證明了Exo在肌腱損傷修復(fù)中的潛在價(jià)值,也為T(mén)SC-Exos在肌腱損傷修復(fù)的臨床應(yīng)用中提供了有力的證據(jù)。

最后,Exo在細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和組織再生也發(fā)揮著重要作用〔47〕。許多研究已經(jīng)報(bào)道了BMSCs和AMSCs在體外對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響〔48～54〕。一些研究證實(shí),AMSC-Exos能夠在體外將巨噬細(xì)胞從M1表型調(diào)節(jié)為M2表型〔55～59〕。一項(xiàng)研究表明,將BMSC-Exos移植到肌腱損傷部位會(huì)促使巨噬細(xì)胞向M2表型分化,并降低M1/M2巨噬細(xì)胞比率〔60〕。同樣,局部應(yīng)用BMSC-Exos到髕腱窗傷口也促進(jìn)了巨噬細(xì)胞從M1表型到M2表型的極化〔60〕。Shen等〔55〕研究發(fā)現(xiàn),AMSC-Exos在肌腱愈合的最早階段可以促進(jìn)肌腱基質(zhì)的再生,從而促進(jìn)肌腱損傷修復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)為肌腱損傷的生物治療提供了新的契機(jī)。研究發(fā)現(xiàn),miR-29家族具有抗纖維化活性〔61～64〕。Yao等〔65〕研究發(fā)現(xiàn),miR-29a-3p可能是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的Exos(UMSC-Exos)在肌腱愈合中發(fā)揮有利作用的關(guān)鍵miRNA。研究結(jié)果提示,PTEN/mTOR/TGF-β1信號(hào)通路可能是UMSC-Exos傳遞miR-29a-3p促進(jìn)肌腱愈合的潛在途徑,并為通過(guò)工程化干細(xì)胞來(lái)源的Exo進(jìn)行肌腱再生提供了一種新的治療策略。

5 肌肉損傷

骨骼肌挫傷是創(chuàng)傷和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中最常見(jiàn)的損傷之一〔66〕,老年人雨雪天氣受傷較為常見(jiàn)。由于挫傷后局部纖維化的形成,受傷的肌肉很容易再次損傷〔67〕。已經(jīng)證明骨骼肌纖維化與損傷早期的過(guò)度炎癥反應(yīng)有關(guān)〔68,69〕。巨噬細(xì)胞與炎癥浸潤(rùn)密切相關(guān),在骨骼肌愈合過(guò)程中起關(guān)鍵作用〔66,70,71〕。據(jù)報(bào)道,挫傷后中性粒細(xì)胞大量滲入損傷區(qū),導(dǎo)致早期局部炎性血腫和濕重增加〔72,73〕。研究證明,BMSC-Exos在其他組織中也有抗炎作用〔74～76〕。Luo等〔77〕發(fā)現(xiàn),小鼠肌肉挫傷后肌肉注射BMSC-Exos可減輕炎癥水平,BMSC-Exos在體內(nèi)和體外均促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化,同時(shí),BMSC-Exos減少炎癥微環(huán)境下炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,上調(diào)抗炎因子的表達(dá)從而減輕小鼠肌肉挫傷,促進(jìn)肌肉愈合。為肌肉損傷后的生物治療提供一種新的治療策略。通常認(rèn)為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)是活化的纖維化細(xì)胞亞群的生物標(biāo)志物,其表達(dá)水平可以反映纖維化的過(guò)程〔78〕,在同一項(xiàng)研究中研究人員發(fā)現(xiàn)BMSC-外源性治療可能通過(guò)下調(diào)α-SMA蛋白的表達(dá)來(lái)降低纖維化水平。但BMSC-Exos在巨噬細(xì)胞耗竭后對(duì)肌肉纖維化和功能恢復(fù)的作用受到抑制,這也表明BMSC-Exo在肌肉愈合中的作用是通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外,BMSC-Exos注射后的相對(duì)生物力學(xué)指標(biāo)(快速收縮和強(qiáng)直強(qiáng)度)明顯改善,挫傷后的肌力提高,肌肉愈合的生物力學(xué)性能增強(qiáng)。這些研究結(jié)果為BMSC-Exos在臨床上用于肌肉愈合提供了有力的證據(jù)。

由于Exo在骨骼肌損傷和修復(fù)過(guò)程中選擇性地裝載內(nèi)容物,因此可以在骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中探究外泌體的不同內(nèi)容物,對(duì)疾病發(fā)生的不同時(shí)間段進(jìn)行優(yōu)化治療,大大改善老年患者的骨骼肌損傷狀況。

綜上,Exo是當(dāng)前一個(gè)熱門(mén)的研究領(lǐng)域。干細(xì)胞Exo富含細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、信號(hào)脂質(zhì)和調(diào)控miRNAs,在OA、OP、IVDD等老年骨科疾病的診斷和治療中發(fā)揮著廣泛的作用,對(duì)修復(fù)肌腱損傷、肌肉損傷起到很大的作用。除了這些治療潛力之外,Exo還有幫助診斷疾病的潛力。目前,Exo可以用于無(wú)細(xì)胞再生,為降低風(fēng)險(xiǎn)的無(wú)細(xì)胞干細(xì)胞治療提供新的治療模式。但是,再生醫(yī)學(xué)在很大程度上取決于其生產(chǎn)的質(zhì)量、可重復(fù)性和效力,這些參數(shù)同樣決定了Exo療法的發(fā)展。隨著今后開(kāi)發(fā)更多標(biāo)準(zhǔn)化的純化和分析程序來(lái)研究Exo,這可能會(huì)揭示其功能異質(zhì)性,為其在各種老年疾病中的作用提供了新的見(jiàn)解與方法。