李煒娟 梁斌 黃雄峰 李亮榮

(南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生教研室,江西 撫州 344000)

機(jī)體在體內(nèi)因素如DNA堿基錯(cuò)配、自身不穩(wěn)定性、機(jī)體代謝產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)等,體外因素如輻射、化學(xué)毒物、藥物、病毒和霉菌等作用下,可以造成DNA損傷。DNA損傷有堿基損傷、錯(cuò)配、DNA單鏈或雙鏈斷裂、嘧啶二聚體形成等多種類型。其中,DNA雙鏈斷裂(DSB)是一種非常嚴(yán)重的損傷類型。DSB的修復(fù)方式主要有兩種,分別是同源重組(HR)、非同源末端連接(NHEJ)〔1〕。HR修復(fù)過程中需要使用與受損DNA同源的一條完整姐妹染色體作為模板,因此更為準(zhǔn)確,修復(fù)主要在細(xì)胞周期的S期和G2期〔2〕。NHEJ可以發(fā)生在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期,不需要模板,直接連接DNA斷裂的末端,修復(fù)過程中很容易出現(xiàn)錯(cuò)配。哺乳動(dòng)物發(fā)生DSB的主要修復(fù)方式是NHEJ。DNA依賴性蛋白激酶亞單位(DNA-PKcs)在NHEJ中發(fā)揮了重要作用。DNA-PKcs通過與Ku70/80蛋白結(jié)合形成DNA-PK復(fù)合物,并激活NHEJ下游因子,進(jìn)行DSB斷端的修復(fù)與連接。隨著人們對(duì)DNA-PKcs在DNA損傷修復(fù)方面的深入研究,發(fā)現(xiàn)其在癌癥發(fā)展中的潛在影響作用,開始在癌癥治療中使用DNA-PKcs抑制劑。本研究對(duì)DNA-PKcs在DNA損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 DNA-PKcs的結(jié)構(gòu)與功能

DNA-PKcs是一種Ser/Thr激酶,是磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(PIKK)家族的成員之一。DNA-PKcs是由4 128個(gè)氨基酸構(gòu)成的,分子量約為469 kD,編碼合成該蛋白的PRKDC基因(也稱為XRCC7基因)位于染色體8q11.12上。DNA-PKcs可被細(xì)分為三大結(jié)構(gòu)單位：一個(gè)大的 N 端螺旋結(jié)構(gòu)域,其次是環(huán)形搖籃,含有多個(gè)HEAT,延長(zhǎng)因子3,蛋白磷酸酶2(PP2A),雷帕霉素靶蛋白(TOR)1重復(fù)序列和一些保守的磷酸化簇,還有一個(gè)C末端,含有高度保守的催化激酶結(jié)構(gòu)。激酶結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)是FAT(FRAP-ATM-TRRAP)和FAT-C(C端的FAT)結(jié)構(gòu)域〔3〕。人們?cè)诓粩嗟匮芯窟^程中,發(fā)現(xiàn)了DNA-PKcs具有多種生物學(xué)功能,如參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞自噬、代謝調(diào)節(jié)、維持端粒穩(wěn)定等。本文主要討論DNA-PKcs在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮的作用。DNA-PKcs主要通過NHEJ方式參與DNA雙鏈斷裂的修復(fù)。NHEJ的主要過程包括：①Ku70/80二聚體識(shí)別和結(jié)合DSB末端,通過招募DNA-PKcs與 XRCC4、DNA 連接酶Ⅳ、XLF等因子將雙鏈斷裂末端連接在一起,此過程可以防止他們被核酸內(nèi)切酶水解;②去除不可連接的末端;③最后連接DSB末端〔4〕。Ku70 和 Ku80 包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N末端vWA結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合/二聚體核心和C末端螺旋結(jié)構(gòu)域。 DNA-PKcs可以與vWA 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合參與 DNA損傷位點(diǎn)的修復(fù)〔5〕。不同于Ku70 (C末端結(jié)構(gòu)域包含增加 DNA 親和力的 SAP 結(jié)構(gòu)域),Ku80 C末端結(jié)構(gòu)域(CTD)包含關(guān)鍵的 DNA-PKcs 結(jié)合區(qū)域。Caspase-2 介導(dǎo)的 Ku80可與 DNA-PKcs 結(jié)合并形成 DNA-PK 復(fù)合物,通過FAT和FATC結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化導(dǎo)致Ku異構(gòu)體的內(nèi)向轉(zhuǎn)移和DNA-PKcs的激活。DNA-PKcs被激活后,使參與 NHEJ機(jī)制中的其他蛋白發(fā)生磷酸化,例如XRCC4、XLF、DNA連接酶Ⅳ、Artemis〔3〕,將受損的DNA末端相互連接。DNA-PKcs自磷酸化以及磷酸化其他關(guān)鍵蛋白,促進(jìn)斷端修復(fù)與連接,在DSB修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。

2 DNA-PKcs對(duì)于DSB修復(fù)途徑的選擇

NHEJ和HR是DSB的兩種主要修復(fù)途徑,但是細(xì)胞如何在這兩種修復(fù)途徑中選擇,其機(jī)制未完全明了。DNA末端的切除啟動(dòng)是選擇HR和防止NHEJ發(fā)生的明確因素〔6〕,DNA-PKcs磷酸化是影響末端切除的因素之一。許多研究表明,DNA-PKcs調(diào)節(jié)DSB途徑的選擇跟細(xì)胞周期有關(guān)。在G2期,DNA-PKcs自動(dòng)磷酸化可以促進(jìn)其與DSB結(jié)合位點(diǎn)解離并且促進(jìn)末端切除酶的招募〔7〕。MRN(Mre11-Rad50-Nbs1)復(fù)合物能夠招募EXO1和增強(qiáng)DNA-PKcs自磷酸化,起到進(jìn)一步刺激切除的作用。MRN復(fù)合物還能抑制XRCC4/DNA連接酶Ⅳ介導(dǎo)的DNA末端重新連接。在S期,BRCA1 與 DNA-PKcs 相互作用,直接阻斷 DNA-PKcs 自磷酸化,從而啟動(dòng) DNA 末端切除,進(jìn)行HR途徑。有研究發(fā)現(xiàn),由PISA4 E3連接酶介導(dǎo)的TIP60 K430的SUMO2修飾增加,阻礙了其與DNA-PKcs的相互作用,從而導(dǎo)致DNA-PKcs S2056自磷酸化受阻,在S期優(yōu)先通過HR途徑進(jìn)行DSB的修復(fù)。在G1期時(shí),HR途徑受到抑制。DNA-PKcs可直接磷酸化 ATM,在 DNA 損傷時(shí)抑制 ATM 活性和 ATM 信號(hào)傳導(dǎo),為 G1 期抑制HR途徑提供了機(jī)會(huì)。此外,促進(jìn)DSB末端切除的酶EXO1在G1 期被嚴(yán)格抑制。RBX1 蛋白表達(dá)的增加促進(jìn)了Skp1-Cullin1-F-box (SCF) 泛素 3 連接酶在 G1 期介導(dǎo) EXO1的泛素化降解,抑制EXO1促進(jìn)末端切除的功能。DNA-PKcs活性的增加是RBX1蛋白表達(dá)增加的原因,其活性增加亦限制EXO1參與DSB末端ssDNA的形成,抑制了G1細(xì)胞的HR修復(fù)途徑〔8〕。

3 DNA-PKcs與PP1的相互作用

DNA-PKcs在多個(gè)Ser/Thr殘基上發(fā)生自磷酸化并介導(dǎo)NHEJ。N末端Ser-56、 Ser-72和 Thr-3950是DNA-PKcs的3個(gè)自磷酸化位點(diǎn),可導(dǎo)致激酶失活。PP1可使DNA-PK脫磷酸化達(dá)到激活DNA-PKcs激酶的活性。PP1是一種主要的Ser/Thr磷酸酶,由催化亞基和多種調(diào)節(jié)元件構(gòu)成,通過靶向亞基實(shí)現(xiàn)某些特定功能〔9〕。PP1可使DNA-PK脫磷酸化達(dá)到激活DNA-PKcs激酶的活性。有研究表明,PP1調(diào)節(jié)DNA-PKcs的磷酸化及活化,在DNA損傷修復(fù)方面發(fā)揮了一定作用。在實(shí)驗(yàn)中,研究者發(fā)現(xiàn)隨著PP1被耗盡,DNA-PKcs在Ser-2056的自磷酸化消失。相比之下,主要由ATM介導(dǎo)的DNA-PKcs在Thr-2609處的磷酸化反而增加。通過使用XRCC4作為底物的體外激酶試驗(yàn),證實(shí)了PP1的耗盡阻斷了DNA損傷后DNA-PKcs激酶的激活。為了闡明PP1對(duì)DNA-PKcs的依賴性調(diào)控,研究者做了進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)PP1與DNA-PKcs的ABCDE和PQR簇及遠(yuǎn)端N端區(qū)域結(jié)合。PP1的耗盡導(dǎo)致Thr-2609磷酸化的積累,表明PP1在Thr-2609和ABCDE簇的其他位點(diǎn)發(fā)揮了去磷酸化作用。相反,PP1的耗盡降低了Ser-2056自磷酸化的水平。Ser-2056 是DNA-PKcs的一個(gè)自磷酸化位點(diǎn),其磷酸化情況可影響DNA-PKcs激活。以上結(jié)果提示,PP1是DNA-PKcs激活所必需〔10〕。

4 DNA-PKcs與scaRNA2的作用

關(guān)于DNA修復(fù)方面,RNA亦發(fā)揮了一定作用,如受損DNA轉(zhuǎn)錄的RNA可通過與互補(bǔ)DNA雜交來促進(jìn)修復(fù),或者是RNA被DICER和DROSHA轉(zhuǎn)化為小的雙鏈RNA后,刺激關(guān)鍵修復(fù)因子募集促進(jìn)修復(fù)等〔11〕。snoRNA是一組執(zhí)行多種生物學(xué)功能的非編碼 RNA,根據(jù)其結(jié)構(gòu)相似性和生化功能,snoRNA家族可分為box C/D和box H/ACA snoRNA。scaRNA是 snoRNA 家族的一個(gè)子集,聚集在 Cajal 體中,在成熟前對(duì)剪接體 RNA 進(jìn)行生化修飾〔12〕。研究表明,scaRNA在DNA修復(fù)過程中控制DNA-PK催化活性及雙鏈斷裂時(shí)修復(fù)途徑選擇的調(diào)節(jié)。有研究〔13〕采用交聯(lián)和免疫沉淀,證明scaRNA2直接結(jié)合DNA-PKcs,間接結(jié)合Ku70/80。scaRNA2和Ku70之間的關(guān)聯(lián)性在去除DNA-PKcs的細(xì)胞中增強(qiáng),表明在與scaRNA2的結(jié)合過程中,DNA-PKcs和Ku70存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。此外,實(shí)驗(yàn)〔13〕發(fā)現(xiàn),scaRNA2可抑制線性化質(zhì)粒激活DNA-PK,但增加Ku70/80的濃度并不能防止這種抑制,進(jìn)一步支持DNA-PKcs是scaRNA2靶標(biāo)的結(jié)論。DNA-PKcs的S 2056是自磷酸化的,而T2609主要是通過ATM和ATR磷酸化的,因此S2056的磷酸化被用作DNA-PKcs活化的指標(biāo)。在去除scaRNA2的細(xì)胞中,DNA-PKcs的自磷酸化升高,可得出其可抑制DNA-PKcs自磷酸化。為了明確scaRNA2抑制DNA-PKcs具體機(jī)制,研究人員做了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)〔13〕,在scaRNA2耗盡的細(xì)胞中對(duì)Ku80進(jìn)行免疫沉淀,顯示其與DNA-PKcs的結(jié)合增強(qiáng),與和Ku70之間的結(jié)合保持不變。Ku80與DNA-PKcs相互作用的增強(qiáng)在缺乏scaRNA2的細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀時(shí)更加明顯。Ku80與DNA-PKcs的PQR自磷酸化簇(包括S2056位點(diǎn))附近的區(qū)域結(jié)合,對(duì)于DNA-PKcs活化有重要意義。scaRNA2與DNA-PKcs的結(jié)合阻止了DNA-PKcs與Ku80的相互作用,從而抑制DNA-PKcs的活化〔13〕。

5 DNA-PKcs與TIP60的作用

TIP60最初被認(rèn)為是一種60 kD的蛋白質(zhì),也稱為 KAT5,是與 HIV Tat 相關(guān)的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)MYST 家族的成員〔14〕。TIP60可參與基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定性 和DNA修復(fù)等多個(gè)細(xì)胞過程。當(dāng)DSB發(fā)生,TIP60 將定位其受損位點(diǎn)并乙?；?H3、H4 和 γH2AX,導(dǎo)致染色質(zhì)松弛和重塑。為了探索TIP60和DNA-PKcs相互作用的機(jī)制及其在決策過程中的作用,Gao等〔15〕使用了免疫共沉淀 (Co-IP) 方法。他們首先使用來自 HeLa 細(xì)胞的無染色質(zhì)細(xì)胞提取物使用針對(duì) TIP60 的抗體進(jìn)行 Co-IP 測(cè)定,發(fā)現(xiàn)TIP60 與 DNA-PKcs 的相互作用在 S 期細(xì)胞中顯著降低。其次,在HEK-293T 細(xì)胞中表達(dá)一系列 DNA-PKcs 截短突變體來確定 DNA-PKcs與 TIP60 相互作用的位點(diǎn)。結(jié)果表明,DNA-PKcs C 末端 H 結(jié)構(gòu)域(AA3540-4128)負(fù)責(zé)其與 TIP60 的結(jié)合。接著通過在 HEK-293T 細(xì)胞中表達(dá)TIP60野生型(WT)或其截短或缺失的突變體來測(cè)試 TIP60 的哪個(gè)區(qū)域負(fù)責(zé)其與 DNA-PKcs 的相互作用,發(fā)現(xiàn)了TIP60 的 AA404-471 片段與 DNA-PKcs 存在直接相互作用。TIP60 的 AA404-471區(qū)域有兩個(gè)潛在的SUMO化位點(diǎn)：K430和K451。通過在 HEK-293T 細(xì)胞中表達(dá)TIP60和其突變體,發(fā)現(xiàn)在K430突變體中,S期TIP60和DNA-PKcs相互作用減弱的情況得到恢復(fù)。這一結(jié)果表明,K430 位點(diǎn) 可減弱TIP60 和 DNA-PKcs相互作用,尤其是在 S 期細(xì)胞中。有研究〔16〕探討了SENP3 介導(dǎo)的 TIP60 去泛素化調(diào)控TIP60與 DNA-PKcs 相互作用,表明TIP60 被 SENP3 快速去SUMO化,并在照射后促進(jìn)其與 DNA-PKcs 相互作用,從而促進(jìn) NHEJ 修復(fù)。為了研究 SENP3 對(duì) DNA-PKcs 活化的影響,他們進(jìn)行了免疫熒光測(cè)定,以檢測(cè) TIP60、DNA-PKcs 和 DNA-PKcs pS2056 在 DNA 損傷位點(diǎn)的定位。通過敲除 SENP3,發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs pS2056 顯著降低,說明SENP3敲除降低了DNA損傷后的DNA-PKcs活性。

6 DNA-PKcs 抑制劑在癌癥治療的應(yīng)用

PRKDC 突變和 DNA-PKcs 表達(dá)缺陷可導(dǎo)致 DSB 修復(fù)功能障礙,使基因組不穩(wěn)定和突變積累,從而增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。許多研究分析了各種類型腫瘤臨床樣本中DNA-PKcs的表達(dá)水平,已發(fā)現(xiàn)多種癌癥的腫瘤發(fā)生與DNA-PKcs缺陷有關(guān)。Teneng等〔17〕通過體外研究表明,DNA-PKcs 的敲除顯著增加了博來霉素治療后檢測(cè)到的 DNA 損傷的數(shù)量,并導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。DNA-PKcs的高表達(dá)與許多腫瘤類型的不良結(jié)果有關(guān)。Wang等〔18〕對(duì)不同時(shí)期的胃癌黏膜采用LC-MS/MS 分析測(cè)定表達(dá)蛋白的差異,發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs表達(dá)隨著胃癌起始的不同階段成倍數(shù)增加,說明了異常的 DNA-PKcs可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。DNA-PKcs蛋白還可通過改變腫瘤微環(huán)境參與腫瘤進(jìn)展。Kotula等〔19〕將DNA-PKcs缺陷的人黑色素瘤細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)以產(chǎn)生皮下腫瘤。 他們發(fā)現(xiàn)這些腫瘤的血管明顯少于非 DNA-PKcs 缺陷的腫瘤,增殖指數(shù)很低。 小鼠生存分析表明,DNA-PKcs缺陷小鼠的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率(MFS)明顯高于非DNA-PKcs缺陷小鼠,在癌癥治療中,放療和化療非常重要,其抗癌機(jī)制與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中致死性 DSBs 相關(guān)。DNA-PKcs 水平的增加增強(qiáng)了細(xì)胞中 DSB 修復(fù),從而削弱了放療和細(xì)胞毒性藥物的致死作用。研究表明,DNA-PKcs 表達(dá)與乳腺癌患者對(duì)化療的反應(yīng)之間存在顯著相關(guān)性,化療耐藥患者腫瘤細(xì)胞中DNA-PKcs的表達(dá)水平顯著高于對(duì)化療不耐藥的患者腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平。此外,在接受化療的患者中,DNA-PKcs 表達(dá)水平高的患者與 DNA-PKcs 表達(dá)水平低的患者相比總生存期顯著降低。DNA-PKcs的上調(diào)導(dǎo)致放療和化療的抗性,由此,抑制DNA-PKcs可以誘導(dǎo)腫瘤的程序性細(xì)胞死亡,并通過抑制DSBs的修復(fù)來增強(qiáng)化療和放療的細(xì)胞殺傷作用〔20〕。

DNA-PKcs 抑制劑已用于放化療或與其他抗腫瘤劑結(jié)合治療腫瘤。多效調(diào)節(jié)劑 CC-122、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/哺乳動(dòng)物雷帕酶素靶蛋白(mTOR)/DNA-PK 抑制劑 LY3023414 和 mTOR/DNA-PK 抑制劑 CC-115等多種非特異性 DNA-PKcs 抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。盡管這些抑制劑并不專門針對(duì) DNA-PKcs,但每種抑制劑都會(huì)抑制與癌癥相關(guān)的激酶。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),靶向 DNA-PKcs 發(fā)揮了更有效的抗腫瘤作用。因此,研究者開發(fā)出了具有高特異性的 DNA-PKcs 抑制劑,如VX-984、M3814、AZD7648 和 AsiDNA等〔21〕。特異性靶向DNA-PKcs抑制劑為治療癌癥疾病提供了新思路,隨著對(duì)DNA-PKcs抑制劑的不斷研究,未來將出現(xiàn)更多新型的抗腫瘤藥物。

綜上,DNA-PKcs在DNA損傷修復(fù)過程中有重要作用。DNA-PKcs抑制劑在腫瘤放療和化療方面,除了DNA-PKcs在DNA損傷修復(fù)方面的作用,發(fā)現(xiàn)其在其他方面的功能可能會(huì)是腫瘤治療的新方向。此外,DNA-PKcs上存在很多位點(diǎn),對(duì)于位點(diǎn)的未知功能研究,可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的DNA-PKcs抑制劑,為腫瘤患者提供更為有效的治療藥物。