于曉斌,張先輝

胃癌是常見的癌癥之一[1]。研究表明,miRNA具有干預(yù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能,可作為監(jiān)測(cè)癌癥的生物標(biāo)志物[2-3]。研究證實(shí),miRNA能夠調(diào)控下游靶基因,從而在胃癌中發(fā)揮致癌或抑癌作用[4]。miR-181a是STAT3介導(dǎo)的TCRαβ+CD8+T淋巴細(xì)胞白血病生存網(wǎng)絡(luò)中的新參與者[5]。miR-181a可作為治療靶點(diǎn)和腫瘤標(biāo)志物。靶向致癌miR-181a-2-3p可抑制胃癌的生長(zhǎng)并降低順鉑耐藥性[6]。遠(yuǎn)華蟾毒精是中國(guó)傳統(tǒng)藥物蟾酥的活性化合物,具有抗腫瘤作用。遠(yuǎn)華蟾毒精通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮抗腫瘤作用[7-8]?？梢?遠(yuǎn)華蟾毒精可能通過(guò)干預(yù)miR-181a表達(dá)影響胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究旨在分析遠(yuǎn)華蟾毒精通過(guò)下調(diào)miR-181a抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲,為胃癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2019年1月—2020年12月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院診治胃癌患者90例,取其胃部病變標(biāo)本及血液備用;另納入30例癌旁組織樣本備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù):本實(shí)驗(yàn)中使用的胃癌細(xì)胞系SGC-7901購(gòu)自ATCC公司。細(xì)胞用含胎牛血清(10%)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco,USA)在37 ℃、5% CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)期胃癌細(xì)胞SGC-7901,制成4×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液,100 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組與遠(yuǎn)華蟾毒精組,每組3個(gè)復(fù)孔。遠(yuǎn)華蟾毒精組每孔加175 μl濃度分別為0.05、0.10、0.50、1.00、1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精,對(duì)照組不加藥。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-181a表達(dá)水平:使用TRIzol提取總RNA。TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Life Technologies)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為特定microRNA的cDNA。使用Taq Man MicroRNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)檢測(cè)miR-181a表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增程序如下:在94 ℃下變性5 min,然后在94 ℃下變性30 s,在60 ℃下變性30 s,在72 ℃下變性40 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。miR-181a定量PCR引物序列號(hào)見表1。

表1 miR-181a和U6定量PCR引物序列號(hào)

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況:對(duì)數(shù)期胃癌細(xì)胞SGC-7901培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl的噻唑藍(lán)溶液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入100 μl二甲基亞砜,置于搖床上低速震蕩10 min。遠(yuǎn)華蟾毒精組和對(duì)照組分別于24 h和48 h各檢測(cè)1次。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè):將對(duì)數(shù)期胃癌細(xì)胞SGC-7901接種在密度為5×105個(gè)細(xì)胞的6孔板中,細(xì)胞分組并按照“1.2.1”下的方法處理48 h。孵育后,收集細(xì)胞,用PBS洗滌2次,并懸浮在100 μl冷PBS中。將細(xì)胞懸液與1.4 ml冷的70%乙醇混合,并在20 ℃下固定過(guò)夜。將冷PBS沖洗1次,并在37 ℃下與10 μl RNase A孵育1 h,然后在4 ℃下用0.7 ml碘化丙啶染色30 min避光。遠(yuǎn)華蟾毒精組和對(duì)照組分別于24 h和48 h各檢測(cè)1次。立即使用流式細(xì)胞術(shù)和FloJo軟件分析細(xì)胞。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定,用200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮1×105個(gè)細(xì)胞置于帶有基質(zhì)膠(BD Biosciences)的上室中,下室加入含有10% FBS的培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)劑。孵育24 h后,用甲醇將細(xì)胞固定在下表面,0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色。遠(yuǎn)華蟾毒精組和對(duì)照組分別于24 h和48 h各檢測(cè)1次。隨機(jī)選擇5個(gè)場(chǎng),并在顯微鏡(100×)下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較miR-181a在胃癌患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。(2)miR-181a表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性。(3)遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞活力和侵襲力的影響。(4)遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響。(5)遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞系SGC-7901中miR-181a表達(dá)水平的影響。

2 結(jié) 果

2.1 miR-181a在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平比較 通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)miR-181a在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平并進(jìn)行生存分析。與癌旁組織相比,胃癌組織中miR-181a呈高表達(dá)(P<0.05),見圖1A。miR-181a低表達(dá)的胃癌患者生存曲線優(yōu)于高達(dá)表者(P<0.05),見圖1B。

圖1 miR-181a在胃癌組織中的表達(dá)和生存分析

2.2 miR-181a表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性 miR-181a高表達(dá)患者間腫瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率大于miR-181a低表達(dá)(P<0.01);miR-181a高表達(dá)與miR-181a低表達(dá)患者年齡、體質(zhì)指數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 miR-181a高表達(dá)與低表達(dá)患者臨床參數(shù)比較 [例(%)]

2.3 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞活力和侵襲力的影響 遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901 24、48 h存活率及侵襲數(shù)低于對(duì)照組,濃度為0.50、1.00、1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組48 h存活率低于24 h存活率(P<0.05),見表3。

表3 對(duì)照組與遠(yuǎn)華蟾毒精組對(duì)細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞活力和侵襲力影響的比較

2.4 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響 濃度為1.00、1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901早期和晚期凋亡率及總凋亡率高于對(duì)照組,且濃度為1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901晚期凋亡率低于早期凋亡率(P<0.05),見表4。

表4 對(duì)照組與遠(yuǎn)華蟾毒精組對(duì)細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞凋亡影響的比較

2.5 遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞系SGC-7901中miR-181a表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較,濃度為1.00、1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901中miR-181a表達(dá)水平降低(P<0.05),且濃度為1.00 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組48 h的miR-181a表達(dá)水平較24 h低(P<0.05),見表5。

表5 對(duì)照組與遠(yuǎn)華蟾毒精組對(duì)細(xì)胞系SGC-7901中miR-181a表達(dá)水平影響的比較

3 討 論

蟾酥在中國(guó)的臨床應(yīng)用可以追溯到1 400年前,并記錄在古代醫(yī)學(xué)書籍《藥性論》中。從歷史上看,蟾酥一直被用作強(qiáng)心劑、利尿劑和止血?jiǎng)?。蟾酥被用?lái)治療癌癥和改善免疫系統(tǒng)[9-10],傳統(tǒng)中藥蟾酥的提取物具有抗炎和抑制腫瘤的能力。遠(yuǎn)華蟾毒精是從傳統(tǒng)中藥蟾酥中分離出來(lái)的活性成分,具有蟾酥的藥理學(xué)特性。藥學(xué)科學(xué)家研究了蟾酥或蟾酥活性成分的抗癌機(jī)制,并取得了一定的研究進(jìn)展,但只有少數(shù)研究集中在遠(yuǎn)華蟾毒精在癌癥治療中的作用和分子機(jī)制上。從蟾酥中提取的化學(xué)物質(zhì)遠(yuǎn)華蟾毒精的功能和機(jī)制尚未得到確切定論。遠(yuǎn)華蟾毒精具有重要的抗腫瘤活性,如抑制腫瘤細(xì)胞增殖、約束細(xì)胞分化、阻斷細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成、阻礙腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等。梁順添等[11]結(jié)果表明,遠(yuǎn)華蟾毒精可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而明顯抑制HCT116和SW480的細(xì)胞活力,這可能與P53介導(dǎo)的Bax通路激活和結(jié)腸癌細(xì)胞IAP通路阻斷有關(guān)。作為一種化合物,遠(yuǎn)華蟾毒精已被發(fā)現(xiàn)具有免疫激活或抑制的作用[12]。這說(shuō)明遠(yuǎn)華蟾毒精可通過(guò)調(diào)節(jié)致癌代謝通路以及患者的免疫系統(tǒng)而發(fā)揮抗癌功效。

miRNA是一類長(zhǎng)度為19～22個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA。miRNA功能障礙與包括胃癌在內(nèi)的各種癌癥發(fā)生有關(guān),這些miRNA可以作為腫瘤抑制因子miRNA或oncomiR[13-14]。miR-181a-5p被廣泛認(rèn)為與血管內(nèi)皮細(xì)胞[15]和淋巴細(xì)胞[16]的發(fā)育和分化有關(guān)。此外,miR-181a-5p在多種癌癥中也起著至關(guān)重要的作用,包括多發(fā)性骨髓瘤[17]、乳腺癌[18]。最新研究發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p在胃癌標(biāo)本中呈上調(diào)水平[19-20]。即使在胃癌中,也有人認(rèn)為miR-181a-5p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Prox1來(lái)抑制HGC-27細(xì)胞的遷移和增殖,基于這個(gè)發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子。相比之下,許多研究表明,miR-181a-5p通過(guò)抑制RASSF6、ATM或KLF6表達(dá),在胃癌發(fā)生中上調(diào)并充當(dāng)oncomiR[20-21]。隨著miR-181a在癌癥研究中的深入,越來(lái)越多證據(jù)表明miR-181a可能具有抑癌或促癌的不同性質(zhì)。miR-181a可以作為致命惡性腫瘤潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

由于遠(yuǎn)華蟾毒精抗癌機(jī)制尚不清晰,miR-181a在胃癌組織樣本中呈現(xiàn)高表達(dá),并且低表達(dá)miR-181a在胃癌患者中總生存更好。本研究利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)和細(xì)胞侵襲功能檢測(cè)判定遠(yuǎn)華蟾毒精對(duì)細(xì)胞系SGC-7901的細(xì)胞學(xué)影響,并檢測(cè)不同遠(yuǎn)華蟾毒精濃度對(duì)miR-181a表達(dá)水平的影響,結(jié)果顯示,遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞24、48 h存活率及侵襲數(shù)低于對(duì)照組,濃度為0.50、1.00、1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組48 h存活率低于24 h存活率,表明遠(yuǎn)華蟾毒精以濃度依賴和時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞活力,遠(yuǎn)華蟾毒精組能有效抑制細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù),且抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。濃度為1.00、1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901早期和晚期凋亡率及總凋亡率高于對(duì)照組,且濃度為1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901晚期凋亡率低于早期凋亡率,表明遠(yuǎn)華蟾毒精能有效增強(qiáng)SGC-7901細(xì)胞早期和晚期凋亡率,且呈藥物濃度依賴性。與對(duì)照組比較,濃度為1.00、1.25 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組細(xì)胞系SGC-7901中miR-181a表達(dá)水平降低,且濃度為1.00 μg/ml的遠(yuǎn)華蟾毒精組48 h的miR-181a表達(dá)水平較24 h低,表明遠(yuǎn)華蟾毒精可以通過(guò)下調(diào)miR-181a表達(dá)抑制細(xì)胞系SGC-7901增殖并促進(jìn)SGC-7901凋亡發(fā)揮抗癌功效。因此,miR-181a表達(dá)水平在胃癌中屬于風(fēng)險(xiǎn)基因,遠(yuǎn)華蟾毒精可以通過(guò)下調(diào)miR-181a表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗癌功效,該研究為胃癌的臨床治療提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

利益沖突所有作者聲明無(wú)利益沖突