龍文巧,許永杰 綜述,張 華,△ 審校

1.遵義醫(yī)科大學(xué),貴州遵義 563000;2.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,貴州貴陽(yáng) 550000

常見(jiàn)的病原微生物如病毒、細(xì)菌、真菌等引起的感染性疾病仍是危害人類健康的主要原因之一[1]。因此,快速、靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法對(duì)感染性疾病的診斷、療效評(píng)估及預(yù)防控制具有重要意義?；诔纱匾?guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)-CRISPR相關(guān)蛋白(Cas)系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)因具有高靈敏度、高特異度、快速、便攜等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)中[2]。

1987年ISHINO等[3]在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)了CRISPR基因組,2005年HAFT 等[4]鑒定了Cas的功能,隨后POURCEL等[5]證明了CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌抵抗噬菌體入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。目前CRISPR-Cas系統(tǒng)除了應(yīng)用于基因編輯技術(shù)外,還廣泛應(yīng)用于病原微生物核酸檢測(cè)技術(shù)[6]?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)表現(xiàn)出高靈敏度、高特異度、快速等優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),在感染性疾病診斷方面具有巨大應(yīng)用前景。同時(shí),基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用也存在許多挑戰(zhàn),這些挑戰(zhàn)包括開(kāi)發(fā)快速高效的核酸提取方式、簡(jiǎn)便的檢測(cè)程序及高通量檢測(cè)技術(shù)等[7]。隨著基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,非核酸分析物的檢測(cè)也成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[8]。本文概述了CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制和不同效應(yīng)蛋白的核酸酶活性,綜述了CRISPR-Cas系統(tǒng)在病原微生物核酸檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展和挑戰(zhàn),并進(jìn)一步介紹了CRISPR-Cas系統(tǒng)在抗原、血清學(xué)抗體、病原體等非核酸分析物檢測(cè)方面的最新研究熱點(diǎn)。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)概述

CRISPR-Cas系統(tǒng)由存儲(chǔ)記憶的CRISPR和Cas基因組成,這兩部分共同作用形成CRISPR-Cas效應(yīng)復(fù)合體,參與核酸識(shí)別、切割過(guò)程[4]。CRISPR-Cas系統(tǒng)通過(guò)將外來(lái)噬菌體DNA儲(chǔ)存到細(xì)菌宿主染色體中形成記憶,進(jìn)而阻止噬菌體再次感染。CRISPR-Cas系統(tǒng)遵循免疫的3個(gè)主要階段[9]:(1)適應(yīng)。對(duì)外來(lái)核苷酸序列識(shí)別、處理后將間隔序列整合到CRISPR基因座中,由此存儲(chǔ)首次感染的記憶。(2)CRISPR RNA(crRNA)成熟。間隔序列翻譯成crRNA和反式激活RNA通過(guò)堿基配對(duì)形成向?qū)NA(sgRNA),用于募集Cas。(3)干擾。Cas通過(guò)結(jié)合sgRNA形成效應(yīng)復(fù)合物,在原間隔相鄰基序(PAM)的協(xié)助下對(duì)靶標(biāo)識(shí)別并切割,完成對(duì)外來(lái)核苷酸序列的特異性清除。

不同的Cas具有不同的核酸內(nèi)切酶活性,當(dāng)前研究主要集中于Cas9、Cas12、Cas13、Cas14,Cas9結(jié)合sgRNA后特異性識(shí)別和切割靶標(biāo),通過(guò)對(duì)切割產(chǎn)物的分析實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的檢測(cè)[10]。而Cas12、Cas13、Cas14識(shí)別并結(jié)合crRNA及靶標(biāo)后形成效應(yīng)復(fù)合體,該復(fù)合體可非特異性切割任意單鏈DNA或單鏈RNA,該過(guò)程被稱為反式切割。此類蛋白反式切割大量帶有標(biāo)記的單鏈DNA或單鏈RNA報(bào)告探針,進(jìn)而輸出檢測(cè)信號(hào)?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)技術(shù)可分為兩類[11]:第1類是通過(guò)提取基因組,聯(lián)合CRISPR-Cas系統(tǒng)建立核酸檢測(cè)方法;第2類是通過(guò)適配體或抗體識(shí)別非核酸分析物,直接或間接與CRISPR-Cas系統(tǒng)聯(lián)合,實(shí)現(xiàn)非核酸分析物的檢測(cè)。

2 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的病原微生物核酸檢測(cè)

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)常通過(guò)對(duì)樣品中的微量核酸進(jìn)行特異性識(shí)別和信號(hào)放大完成相關(guān)檢測(cè)。目前,基于CRISPR-Cas9/Cas13/Cas12/Cas14系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)具有高特異度、高靈敏度、快速等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)中?；贑RISPR-Cas9系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)依賴于該系統(tǒng)識(shí)別及切割雙鏈DNA(dsDNA)的能力,用于病原微生物的核酸檢測(cè)。PARDEE等[12]將基于CRISPR-Cas9及含有激發(fā)序列的toehold傳感器聯(lián)合依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)方法開(kāi)發(fā)一種顯色紙片檢測(cè)技術(shù),建立了可視化檢測(cè)寨卡病毒檢測(cè)技術(shù),該技術(shù)通過(guò)比色法輸出檢測(cè)信號(hào),檢測(cè)靈敏度可達(dá)3 fmol/L,能鑒別美洲和非洲寨卡病毒株,且不需要昂貴的設(shè)備。但NASBA需要3種酶使得反應(yīng)成本較高,反應(yīng)成分較復(fù)雜,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。選擇合適的核酸擴(kuò)增方法對(duì)提高檢測(cè)平臺(tái)的綜合檢測(cè)性能至關(guān)重要。此外,去核酸酶活性的Cas9(dCas9)保留了dsDNA的結(jié)合能力,對(duì)目標(biāo)核酸序列無(wú)切割活性,也可用于核酸檢測(cè)。HAIJIAN等[13]開(kāi)發(fā)了CRISPR芯片(CRISPR-Chip)技術(shù),該技術(shù)將dCas固定于石墨烯電子晶體管,在sgRNA輔助下,加入目標(biāo)dsDNA后在晶體管上形成dCas-sgRNA-dsDNA復(fù)合物,該復(fù)合物會(huì)改變晶體管電導(dǎo)率,可根據(jù)電導(dǎo)率變化得出檢測(cè)結(jié)果。CRISPR-Chip技術(shù)無(wú)須對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)前擴(kuò)增,可直接檢測(cè)到1.7 fmol/L的目標(biāo)dsDNA,耗時(shí)15 min。Cas9和dCas9常用于核酸檢測(cè),但此類技術(shù)的信號(hào)放大及輸出過(guò)程較復(fù)雜。Cas12a 、Cas13a 、Cas14等具有反式切割活性的發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)更簡(jiǎn)便、快速、精準(zhǔn)的基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)平臺(tái)提供更多可能。

基于CRISPR-Cas12/Cas13/Cas14系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)通常利用Cas的反式切割活性直接切割帶標(biāo)記的檢測(cè)探針,從而產(chǎn)生各種信號(hào)(如熒光、比色、電化學(xué)等),直接、快速地獲得較高的檢測(cè)靈敏度。KELLNER等[2]將重組酶聚合擴(kuò)增技術(shù)(RPA)聯(lián)合CRISPR-Cas13a系統(tǒng),建立了SHERLOCK技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)切割淬滅的熒光報(bào)告探針?lè)糯蠛洼敵鰴z測(cè)信號(hào),在寨卡病毒檢測(cè)中可達(dá)到單堿基分辨率,并極大地提高了檢測(cè)的靈敏度。此外,Cas12a同樣具有強(qiáng)大的反式切割活性,CHEN等[14]將CRISPR-Cas12a系統(tǒng)聯(lián)合RPA開(kāi)發(fā)了DETECTR技術(shù)。SHERLOCK及DETECTR技術(shù)具有高靈敏度、高特異度和快速等優(yōu)點(diǎn),并為開(kāi)發(fā)更多新的基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)提供基礎(chǔ)。但此類技術(shù)有兩步反應(yīng),增加了檢測(cè)過(guò)程中被污染的風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)一步的研究可通過(guò)將核酸擴(kuò)增過(guò)程與CRISPR檢測(cè)過(guò)程整合于單一反應(yīng)體系中進(jìn)而降低檢測(cè)過(guò)程被污染的風(fēng)險(xiǎn)?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中面臨著復(fù)雜的核酸提取方式和檢測(cè)程序,以及難以實(shí)現(xiàn)對(duì)單一crRNA及Cas進(jìn)行多重靶標(biāo)檢測(cè)等挑戰(zhàn),這些挑戰(zhàn)限制了新技術(shù)在實(shí)際樣本檢測(cè)中的應(yīng)用。

3 病原微生物核酸檢測(cè)的挑戰(zhàn)

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的病原微生物核酸檢測(cè)在臨床應(yīng)用上面臨需開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易的核酸提取方法,簡(jiǎn)化檢測(cè)程序,建立多重檢測(cè)平臺(tái)等諸多挑戰(zhàn)[7],筆者進(jìn)一步討論了目前的一些解決方案。

3.1核酸提取的簡(jiǎn)化 簡(jiǎn)化核酸提取過(guò)程仍然是快速核酸檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的主要瓶頸,因此需要開(kāi)發(fā)快速高效的核酸提取方法促進(jìn)基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用。MYHRVOLD等[15]建立了樣本加熱消除核酸酶非提取(HUDSON)技術(shù),將HUDSON與SHERLOCK技術(shù)聯(lián)合,在提取和純化DNA或RNA的情況下裂解病毒,可以直接從臨床樣本中檢測(cè)病毒核酸,極大地簡(jiǎn)化了操作步驟,降低了氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)。然而,HUDSON技術(shù)缺乏純化和濃縮核酸的步驟,可能會(huì)降低檢測(cè)復(fù)雜樣本中目標(biāo)核酸的能力。納米材料和技術(shù)可以通過(guò)簡(jiǎn)便的工藝從復(fù)雜樣品中提取目標(biāo)核酸。納米級(jí)的隔離膜具有較大的比表面積,RODRIGUEZ等[16]開(kāi)發(fā)了基于紙張核酸擴(kuò)增的流控芯片技術(shù),該技術(shù)使用的隔離膜通過(guò)靜電作用和氫鍵結(jié)合力將高鹽溶液中的目標(biāo)核酸快速、高效地分離,使吸附在膜上的核酸保持穩(wěn)定的結(jié)合,通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)在原位擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列的富集、純化和擴(kuò)增,完成從樣品到結(jié)果的集成檢測(cè)。目前,芯片上的等溫放大步驟需要外部熱源,該技術(shù)使用加熱模塊來(lái)輔助等溫?cái)U(kuò)增,因此,若在基于紙張的微流控檢測(cè)平臺(tái)中整合一個(gè)集成的加熱系統(tǒng)將大大加強(qiáng)其便攜性。

3.2檢測(cè)過(guò)程的簡(jiǎn)化 大多數(shù)基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)仍然使用標(biāo)準(zhǔn)的兩步檢測(cè)法,此類方法增加了檢測(cè)的時(shí)間和檢測(cè)過(guò)程中交叉污染的風(fēng)險(xiǎn),這促使研究者開(kāi)發(fā)單管檢測(cè)策略。常規(guī)兩步檢測(cè)法首先利用核酸擴(kuò)增技術(shù)提高靶標(biāo)的濃度,再聯(lián)合CRISPR-Cas系統(tǒng)產(chǎn)生放大的檢測(cè)信號(hào)[2]。但核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增靶標(biāo)的同時(shí),還增加了非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn),故研究者們開(kāi)發(fā)了無(wú)須靶標(biāo)擴(kuò)增的超靈敏的檢測(cè)方法。

3.2.1單管檢測(cè)策略 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的單管檢測(cè)技術(shù)將核酸擴(kuò)增和CRISPR-Cas系統(tǒng)反應(yīng)整合于一個(gè)緩沖體系,用于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。單管檢測(cè)是在反應(yīng)管底部添加核酸擴(kuò)增試劑,在反應(yīng)管蓋上也添加Cas12a和crRNA試劑,反應(yīng)管底部的核酸擴(kuò)增完成后,將預(yù)先加在管蓋上的Cas12a和crRNA試劑通過(guò)離心移至管底,使Cas12a和crRNA試劑與擴(kuò)增子混合,實(shí)現(xiàn)在1管內(nèi)完成擴(kuò)增和檢測(cè),避免了氣溶膠污染[17]。但此技術(shù)先進(jìn)行靶標(biāo)擴(kuò)增再將擴(kuò)增產(chǎn)物與CRISPR-Cas系統(tǒng)反應(yīng),檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。因此,研究者們將靶標(biāo)的擴(kuò)增與CRISPR-Cas系統(tǒng)整合于一個(gè)緩沖系統(tǒng)中同時(shí)進(jìn)行反應(yīng),縮短了檢測(cè)時(shí)間。根據(jù)核酸擴(kuò)增步驟和CRISPR-Cas系統(tǒng)反應(yīng)的溫度偏好,JOUNG等[18]將LAMP介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)(55～65 ℃)與耐高溫的Cas12b(31～59 ℃)集中于一管中同時(shí)完成核酸擴(kuò)增與信號(hào)檢測(cè),建立了單管檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)不但降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn),還明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間。同樣,該技術(shù)的核酸擴(kuò)增過(guò)程也需要加熱,未來(lái)的研究可通過(guò)開(kāi)發(fā)集成加熱系統(tǒng),進(jìn)一步簡(jiǎn)化工作流程,進(jìn)而在不同環(huán)境下均可進(jìn)行相關(guān)核酸檢測(cè)。

3.2.2無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)策略 無(wú)核酸擴(kuò)增步驟的檢測(cè)策略具有快速、避免非特異性擴(kuò)增、不易產(chǎn)生交叉污染等優(yōu)勢(shì),但可能會(huì)造成檢測(cè)靈敏度下降。為解決靈敏度下降這一問(wèn)題,研究者們通常使用超靈敏信號(hào)報(bào)告系統(tǒng)、信號(hào)級(jí)聯(lián)放大技術(shù),以及微小體積等方式提高靈敏度[13]。首先,電化學(xué)傳感器、金屬納米材料、高性能的表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)等可放大來(lái)自CRISPR-Cas系統(tǒng)的微弱信號(hào),超靈敏地檢測(cè)低濃度靶標(biāo)。其次,因?qū)嶒?yàn)中CRISPR-Cas系統(tǒng)反應(yīng)速率與Cas-crRNA復(fù)合物的數(shù)量呈正比,基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)用多個(gè) Cas-crRNA復(fù)合物直接靶向目標(biāo)序列的不同位點(diǎn),通過(guò)加快信號(hào)積累速率,在更短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到檢測(cè)信號(hào)閾值[19]。此外,根據(jù)Cas的反式切割活性與底物濃度呈正比的原理,空間限制檢測(cè)體系可濃縮底物進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度[20]。不同無(wú)擴(kuò)增策略的組合可提高檢測(cè)的靈敏度?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)的無(wú)擴(kuò)增數(shù)字RNA檢測(cè)技術(shù)通過(guò)采用多個(gè)Cas13a-crRNA復(fù)合物靶向多個(gè)位點(diǎn)在空間限制體系(反應(yīng)體積減小到nL水平)中檢測(cè)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2),檢測(cè)限為5 fmol/L,耗時(shí)5 min[21]。因此,合理整合上述策略可以實(shí)現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增、快速、靈敏的靶標(biāo)檢測(cè)。但由于缺乏靶標(biāo)擴(kuò)增步驟,用來(lái)增加靈敏度的策略可能會(huì)增加檢測(cè)方法的復(fù)雜性和費(fèi)用,在選擇或設(shè)計(jì)檢測(cè)方法時(shí),必須綜合考慮這些策略的優(yōu)缺點(diǎn)。

3.3多重檢測(cè) 多重檢測(cè)可以提高診斷效能,實(shí)現(xiàn)大規(guī)模樣本的高通量檢測(cè)。GOOTENBERG等[22]利用PsmCas13b、LwaCas13a、CcaCas13b和Cas12a分別切割富含特定核苷酸序列的報(bào)告探針,實(shí)現(xiàn)了四重檢測(cè)。但在該檢測(cè)方法中,Cas的反式切割可能會(huì)產(chǎn)生信號(hào)重疊以降低檢測(cè)的特異度,且該技術(shù)涉及較多的蛋白質(zhì)種類,導(dǎo)致檢測(cè)成本較高。因此,一種通過(guò)DNA阻斷劑調(diào)控Cas反式切割活性的檢測(cè)方法以單一蛋白實(shí)現(xiàn)了多重靶標(biāo)的檢測(cè)一定程度上降低了檢測(cè)成本。HAN等[23]開(kāi)發(fā)了一種基于Cas12a-DNA阻斷劑的多重檢測(cè)(CASTI)技術(shù)。CASTI可以通過(guò)聯(lián)合RPA擴(kuò)增靶標(biāo),以一種Cas實(shí)現(xiàn)人乳頭瘤病毒(HPV)16和HPV18基因的檢測(cè),檢測(cè)限為1 amol/L。該多重檢測(cè)平臺(tái)有助于在設(shè)備有限的條件下進(jìn)行病原微生物的檢測(cè)。然而,與檢測(cè)人工合成的DNA靶標(biāo)相比,該技術(shù)在細(xì)胞系和臨床樣本中檢測(cè)目標(biāo)DNA的效率較低,因此,需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以避免樣本中其他DNA或RNA的干擾。此外,ACKERMAN等[24]將核酸多重評(píng)估的組合排列反應(yīng)(CARMEN)聯(lián)合CRISPR-Cas13a系統(tǒng),開(kāi)發(fā)一種多通道檢測(cè)方法(CARMEN-Casl3)。CARMEN-Casl3已可同時(shí)檢測(cè)169種人類病毒,還能區(qū)分多種亞型的流感病毒,檢測(cè)時(shí)間為5 min。CARMEN-Cas13的靈敏度和特異度可與SHERLOCK技術(shù)匹配,這對(duì)病原微生物高通量檢測(cè)及流行病學(xué)研究至關(guān)重要。該技術(shù)可檢測(cè)來(lái)自不同人群的數(shù)千份樣本,需要專業(yè)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)分析解釋。該技術(shù)若能與移動(dòng)電話應(yīng)用程序連接將直接讀出檢測(cè)結(jié)果,會(huì)有更大的應(yīng)用潛力。

4 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)的病原微生物非核酸分析物檢測(cè)

病原微生物及其抗原和血清學(xué)抗體等非核酸分析物往往在發(fā)病早期和治療開(kāi)始后以低濃度出現(xiàn)。靈敏和可定量的基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)早期病變和準(zhǔn)確評(píng)估疾病療效[25]。近年來(lái),基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)已用于檢測(cè)多種類型靶標(biāo),包括病原體、抗原、血清學(xué)抗體等。

4.1基于CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)的病原微生物直接檢測(cè) 基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的病原微生物直接檢測(cè)常通過(guò)抗體或適配體識(shí)別致病菌,再與CRISPR-Cas系統(tǒng)聯(lián)合放大檢測(cè)信號(hào),實(shí)現(xiàn)免培養(yǎng)、免提取的病原微生物直接檢測(cè)?；诳贵w的檢測(cè)方法利用抗體對(duì)靶細(xì)菌識(shí)別,通過(guò)免疫夾心法聯(lián)合CRISPR-Cas12a系統(tǒng)輸出檢測(cè)結(jié)果。DUAN等[26]開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)引導(dǎo)、無(wú)DNA提取和擴(kuò)增、可快速直接檢測(cè)病原體的生物傳感器(CATCHER)。CATCHER通過(guò)免疫夾心結(jié)構(gòu)(標(biāo)記鼠傷寒抗體的磁珠、靶細(xì)菌、標(biāo)記鼠傷寒抗體和DNA核酸內(nèi)切酶Ⅰ的膠體金),經(jīng)磁分離后巧妙地利用DNA核酸內(nèi)切酶Ⅰ將溶液中單鏈DNA激活探針降解為短寡核苷酸,改變CRISPR-Cas12a系統(tǒng)生物活性,進(jìn)而輸出檢測(cè)結(jié)果,檢測(cè)限為7.9×101CFU/mL。該方法為非核酸分析物的檢測(cè)提供了一個(gè)通用平臺(tái)。相比價(jià)格較貴的抗體識(shí)別方法,適配體識(shí)別方法成本較低且步驟更簡(jiǎn)便?；谶m配體的方法,研究者通常識(shí)別適配體靶標(biāo)后釋放一個(gè)DNA或RNA激活探針用于激活CRISPR-Cas系統(tǒng),進(jìn)而完成信號(hào)的放大及輸出。SHEN等[27]開(kāi)發(fā)了將核酸變構(gòu)探針(AP)與CRISPR-Cas13a系統(tǒng)聯(lián)合的APC-Cas檢測(cè)方法。該方法通過(guò)AP識(shí)別靶細(xì)菌后暴露引物結(jié)合位點(diǎn),引物在DNA聚合酶和T7 啟動(dòng)子作用下進(jìn)行DNA序列的延伸和轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生大量單鏈RNA激活探針及CRISPR-Cas13系統(tǒng),通過(guò)熒光信號(hào)輸出結(jié)果。該技術(shù)可快速、直接、定量檢測(cè)各種樣本中腸炎單胞菌數(shù)(1～105CFU/mL)。以上病原微生物直接檢測(cè)技術(shù)省去了檢測(cè)前核酸提取和擴(kuò)增步驟,明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間。

4.2基于CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)的病原微生物抗原檢測(cè) 病原微生物抗原與致病力密切相關(guān),抗原檢測(cè)也是傳染性疾病診斷的主要方式之一。基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)抗原時(shí)大多需利用適配體識(shí)別抗原后將抗原轉(zhuǎn)化為核酸信號(hào),聯(lián)合CRISPR-Cas系統(tǒng)放大檢測(cè)信號(hào),實(shí)現(xiàn)抗原快速檢測(cè)。生物毒素是細(xì)菌產(chǎn)生的一類重要抗原,會(huì)引起人類急性中毒、致癌或致畸等,生物毒素的檢測(cè)有助于評(píng)估細(xì)菌感染嚴(yán)重程度和預(yù)防毒素引發(fā)的休克。ABNOUS等[28]利用核酸適配體聯(lián)合CRISPR-Cas12a系統(tǒng)識(shí)別黃曲霉毒素M1(AFM1),開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)便、高效的抗原檢測(cè)技術(shù)。在添加了AFM1的牛奶樣品中,該技術(shù)在 0.5～50.0 ng/L呈現(xiàn)出較寬的線性關(guān)系。該技術(shù)利用比色法,通過(guò)顏色的變化輸出檢測(cè)結(jié)果,不需要昂貴設(shè)備,信號(hào)輸出方式簡(jiǎn)便,便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),但比色這一信號(hào)輸出方式靈敏度相對(duì)較低。研究者可探索使用包括金屬有機(jī)框架在內(nèi)的新型納米材料來(lái)提高傳感器的靈敏度。此外,病毒抗原往往決定了病毒的宿主、組織嗜性及其致病的能力,也成為檢測(cè)的重要靶標(biāo)。通過(guò)適配體聯(lián)合CRISPR-Cas12a系統(tǒng),研究者建立了SARS-CoV-2抗原的電化學(xué)檢測(cè)平臺(tái)[29],實(shí)現(xiàn)核衣殼蛋白的檢測(cè)。與常規(guī)抗原檢測(cè)法相比,基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的抗原檢測(cè)技術(shù)提高了抗原檢測(cè)的特異度和靈敏度,并可對(duì)抗原進(jìn)行定量檢測(cè)。

4.3基于CRISPR-Cas系統(tǒng)相關(guān)的病原微生物抗體檢測(cè) 抗體檢測(cè)在疾病診斷、療效評(píng)估和流行病學(xué)調(diào)查中具有重要意義。BARBER等[30]建立了CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的自組裝固定肽(PICASSO)技術(shù)。PICASSO技術(shù)通過(guò)將能與靶分子特異性結(jié)合的重組肽段與dCas9融合形成復(fù)合物,利用sgRNA引導(dǎo)該復(fù)合物與微陣列表面上特定位置的DNA進(jìn)行自組裝,構(gòu)建DNA-蛋白質(zhì)微陣列,用于檢測(cè)不同抗體。PICASSO技術(shù)能快速識(shí)別樣本中的上千種抗體,實(shí)現(xiàn)了病原微生物血清學(xué)抗體快速高通量檢測(cè)。PICASSO技術(shù)已被用于檢測(cè)新型冠狀病毒感染(COVID-19)恢復(fù)期患者血清SARS-CoV-2的抗體。但該技術(shù)難以避免非特異性背景信號(hào),未來(lái)的研究可通過(guò)改變微陣列表面寡核苷酸的間距密度及dCas9與其融合蛋白之間的連接長(zhǎng)度等進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,提高檢測(cè)特異度。

5 總結(jié)與展望

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)在病原微生物核酸和非核酸靶標(biāo)的檢測(cè)中迅速發(fā)展,實(shí)現(xiàn)對(duì)超低濃度樣品的精確、靈敏檢測(cè)。本文歸納了基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)的構(gòu)建和應(yīng)用,討論了該技術(shù)目前存在的挑戰(zhàn)及可能的解決辦法,進(jìn)一步闡述了基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)在病原微生物非核酸分析物檢測(cè)方面的最新研究熱點(diǎn)。核酸靶標(biāo)的檢測(cè)通過(guò)開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易的核酸提取方法,簡(jiǎn)化檢測(cè)程序,建立多重檢測(cè)平臺(tái)等方式提高了檢測(cè)性能。非核酸靶標(biāo)的檢測(cè)則需通過(guò)適配體、抗體及其他方式將靶標(biāo)轉(zhuǎn)換成核酸信號(hào)進(jìn)一步完成檢測(cè),在病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了更廣闊的應(yīng)用前景。

盡管CRISPR-Cas系統(tǒng)在病原微生物檢測(cè)中具有各種優(yōu)勢(shì),但仍有一些挑戰(zhàn)需要克服。(1) 靶基因片段選擇的局限性。CRISPR-Cas系統(tǒng)在Cas錨定目標(biāo)序列時(shí)依賴于PAM,在選擇檢測(cè)的靶基因片段時(shí)存在一定的局限性。(2)crRNA 和單鏈DNA、單鏈RNA報(bào)告探針在添加RNA酶抑制劑的臨床復(fù)雜樣本中仍存在降解風(fēng)險(xiǎn)。(3)Cas存在一定的背景活性,不同批次的背景活性不同,導(dǎo)致樣品檢測(cè)結(jié)果不同。

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)在臨床應(yīng)用上具有巨大的潛力?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)與人工智能相結(jié)合,可以促進(jìn)感染性疾病的早期診斷,直接向衛(wèi)生專家甚至普通人群發(fā)出警報(bào)。此外,基于CRISPR-Cas系統(tǒng)技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果可以通過(guò)移動(dòng)電話應(yīng)用程序連接到云數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和儲(chǔ)存,可用于構(gòu)建醫(yī)療大數(shù)據(jù)分析平臺(tái),為臨床診療及科學(xué)研究提供有力證據(jù)。CRISPR-Cas 系統(tǒng)現(xiàn)在能夠檢測(cè)的不僅是基因組材料,還有望擴(kuò)展到更多領(lǐng)域。除病原微生物及其抗原和血清學(xué)抗體等非基因組目標(biāo)外,CRISPR-Cas 系統(tǒng)在癌癥生物標(biāo)志物、人體樣本罕見(jiàn)突變、食品水樣污染檢測(cè)、植物病原微生物檢測(cè)等領(lǐng)域的新應(yīng)用仍有待進(jìn)一步探究。