南 璐，郭夢(mèng)杰，高雅楠，賈紅燕

1.山西醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 乳腺科，山西 太原 030001

乳腺癌(breast cancer)是全球女性最常見(jiàn)的癌,目前已位居女性惡性腫瘤病死率之首,2022年2月,國(guó)家癌中心發(fā)布的最新一期的全國(guó)癌統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示: 2020年中國(guó)女性新發(fā)癌病例數(shù)209萬(wàn), 其中乳腺癌新發(fā)超越肺癌,登頂首位。盡管目前針對(duì)乳腺癌的手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療、免疫治療及靶向治療等綜合治療已經(jīng)相對(duì)成熟,但越來(lái)越多的患者在治療后期會(huì)產(chǎn)生耐藥性,因此,探索新的乳腺癌治療策略刻不容緩。

膜聯(lián)蛋白A(annexins A,ANX A)家族是受Ca2+調(diào)節(jié)的蛋白超家族,包括C端核心區(qū)域和N端可變區(qū)域,前者通過(guò)與膜相關(guān)磷脂結(jié)合發(fā)揮作用,后者則可區(qū)分不同家族的不同亞型。與一系列生物學(xué)活動(dòng)密切相關(guān),包括生物膜形成、胞吞胞吐,DNA合成等。研究發(fā)現(xiàn)ANX A家族參與乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥等。本文通過(guò)剖析ANX A家族在乳腺癌中扮演的角色,以期為乳腺癌的診斷和治療提供新方向。

1 ANX A家族成員概述

高等脊椎動(dòng)物的Annexins被歸類(lèi)為A家族,含12個(gè)成員,命名為ANX A1-ANX A13,其中ANX A12尚未被證實(shí)。在生物學(xué)中,ANX A蛋白家族是一組鈣依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白,當(dāng)Ca2+存在時(shí),其C端可結(jié)合到磷脂膜上并發(fā)生構(gòu)象變化,并暴露出N端從而發(fā)揮生物學(xué)功能。除了Ca2+外,ANX A的N端也有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn),S100鈣結(jié)合蛋白A10(S100A10)是一種鈣依賴(lài)性的信號(hào)通路介導(dǎo)分子,S100-ANXA相互作用已被證明可以激活A(yù)NX A使其發(fā)揮作用。N端結(jié)構(gòu)域是區(qū)分不同亞家族的主要依據(jù),是該家族成員具有不同功能特性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2 ANX A家族各成員的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)

ANX A家族均為可溶性蛋白,存在一些共同的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。在結(jié)構(gòu)上,其C端區(qū)域?yàn)楸Ｊ氐?除ANX A6由8個(gè)核心片段組成外,其余成員均為4個(gè)螺旋狀重復(fù)單元,并在空間結(jié)構(gòu)中折疊為盤(pán)狀,可以以Ca+依賴(lài)的方式與磷脂結(jié)合。其共同參與有絲分裂、膜離子通道的形成、磷脂酶A2活性的抑制、出胞、入胞作用,并與多種惡性腫瘤的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其差別主要由N端結(jié)構(gòu)域決定,根據(jù)N端序列的不同,表現(xiàn)出不同的功能特點(diǎn),ANX A1通過(guò)其N(xiāo)端激酶特性磷酸化多種蛋白質(zhì)殘基,ANX A3通過(guò)丙氨酸取代經(jīng)典的Trp-5,與磷脂具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。同時(shí),家族中的一些成員在特定組織中唯一表達(dá),ANX A3誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成,ANX A4在耳蝸和前庭毛細(xì)胞中特異性表達(dá)[1],ANX A5則參與免疫T細(xì)胞的活化[2]。ANX A家族在癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡中的作用也已經(jīng)得到證實(shí)。ANX A1主要調(diào)控腫瘤細(xì)胞骨骼重塑和免疫應(yīng)答相關(guān)過(guò)程,從而影響癌細(xì)胞的侵襲性遷移[3]。ANX A2通過(guò)破壞細(xì)胞外基質(zhì)的完整性,導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。ANX A3通過(guò)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和低氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路等影響細(xì)胞增殖、遷移和凋亡。ANX A4通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞凋亡[5]。有些成員還被證實(shí)可能與腫瘤耐藥性相關(guān),在正常情況下,紫杉醇誘導(dǎo)ANX A4向細(xì)胞質(zhì)膜易位,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。然而,ANX A4可以與腫瘤抑制基因Fhit蛋白的N端部分結(jié)合,形成ANX A4-Fhit復(fù)合物,特異性地阻止細(xì)胞質(zhì)易位并產(chǎn)生耐藥性[6]。含有ANX A6的外泌體的分泌以YAP1依賴(lài)的方式促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥[7]。

3 ANX A家族各成員在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

3.1 ANX A1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

PRSS22是人絲氨酸蛋白酶中的一員,最初被證實(shí)為促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的新型癌基因,篩選PRSS22和ANX A1蛋白結(jié)合的乳腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)PRSS22裂解ANX A1后可產(chǎn)生一個(gè)n端肽,該肽啟動(dòng)FPR2/ERK信號(hào)軸以增加乳腺癌的侵襲性[8]。USP7為程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)的去泛素化酶,ANX A1衍生肽A11與USP7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和降解癌細(xì)胞中的PD-L1,通過(guò)抑制腫瘤免疫逃逸表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用[3]。ANX A1通過(guò)減少上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)標(biāo)志物、波蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶的表達(dá)也可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)DCST1-AS1通過(guò)ANX A1促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT,并增強(qiáng)三陰性乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥[9]。目前TNBC可分為6個(gè)亞型,大多數(shù)關(guān)于ANX A1的研究與TNBC中的間質(zhì)干細(xì)胞型(mesenchymal stem-like,MSL)、基底樣-1型(basal-like-1,BL-1)及基底樣-2型(basal-like-2,BL-2)相關(guān),這3種亞型約占TNBC的70%～80%,因此可以推斷ANX A1與TNBC之間存在良好的關(guān)聯(lián)。而未來(lái)的機(jī)制研究應(yīng)側(cè)重于ANX A1在未被充分代表的TNBC分子亞型中的作用,并使用更具有臨床相關(guān)性的疾病模型。

3.2 ANX A2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移的前體細(xì)胞,是最終導(dǎo)致乳腺癌死亡的主要原因,Ral蛋白是Ras小G蛋白家族的成員,激活的RalA可以直接與下游效應(yīng)物相互作用,Src家族激酶(Src family kinases,SFKs)是一類(lèi)非受體型的蛋白酪氨酸激酶,Src為家族中的一員,可使ANX A2磷酸化,RalA-ANXA2-Src復(fù)合物通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)在乳腺癌中促進(jìn)CTC的形成,導(dǎo)致乳腺癌進(jìn)展[10]?；罨疌激酶1(receptor for activated C kinase 1,Rack1)作為信號(hào)中樞,也可以介導(dǎo)Src激酶對(duì)ANX A2的磷酸化,在乳腺癌細(xì)胞耐藥和侵襲/轉(zhuǎn)移的潛能中發(fā)揮作用[11]。癌蛋白c-Myc的表達(dá)和定位在轉(zhuǎn)錄、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯以及蛋白穩(wěn)定性水平上受到高度調(diào)控,胞質(zhì)中磷酸化的ANX A2可以與c-Myc mRNA的3′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)的特定定位元件結(jié)合,導(dǎo)致其定位到核周區(qū)域[12],參與乳腺癌細(xì)胞凋亡。此外,S100鈣結(jié)合蛋白A10(S100A10)是一種鈣依賴(lài)性的信號(hào)通路介導(dǎo)分子,ANXA2/S100A10四聚體復(fù)合體 (AIIt)的發(fā)現(xiàn),在惡性癌細(xì)胞和纖溶之間建起了橋梁[4]。該復(fù)合物是惡性及非惡性血管生成的關(guān)鍵因子,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,因此了解其在乳腺癌中的作用,有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

3.3 ANX A3在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

ANXA3被認(rèn)為是一種新的血管生成因子,與乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡及耐藥有關(guān),并且是乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。ANX A3主要通過(guò)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用,該通路在乳腺癌模型的EMT過(guò)程中起重要作用。在三陰性乳腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)在敲低ANX A3的癌細(xì)胞中存在EMT,其證據(jù)是間質(zhì)標(biāo)志物(vimentin和N-cadherin)減少,上皮標(biāo)志物(E-cadherin和γ-cadherin)增加,而敲低NF-κB抑制蛋白IκBɑ可以部分逆轉(zhuǎn)ANXA敲低誘導(dǎo)的EMT狀態(tài),證實(shí)ANX A3通過(guò)該信號(hào)通路影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[13]。ANX A3的異常表達(dá)也被證明可以通過(guò)下調(diào)多種促凋亡蛋白和細(xì)胞周期獨(dú)立激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDKs),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。在一項(xiàng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的體外研究中發(fā)現(xiàn),抑制ANX A3可顯著降低細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶4(CDK4)的表達(dá),增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子E2F1和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p27Kip1的表達(dá)[14]。同時(shí),ANX A3激活 NF-κB通路活性也被認(rèn)為是影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素和多西紫杉醇耐藥性的可能機(jī)制[13]。最新的一項(xiàng)研究表明,miR-221/222直接靶向ANX A3的3′-UTR,在mRNA和蛋白水平上抑制ANX A3的表達(dá)。與阿霉素聯(lián)合,下調(diào)ANX A3可能使阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡致敏,誘導(dǎo)持續(xù)的G2/M和G0/G1驟停。通過(guò)增加miR-221/222的表達(dá)抑制ANX A3,可以提高化療藥物的有效性[15]。盡管有這些發(fā)現(xiàn),但目前關(guān)于ANX A3在抗腫瘤抗生素和紫杉烷類(lèi)藥物耐藥中作用的數(shù)據(jù)非常有限,表明該領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步探索。

3.4 ANX A4在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

STAT3信號(hào)在乳腺癌中經(jīng)常被激活,ANX A4可以通過(guò)提高JAK1和p-STAT3的表達(dá)來(lái)激活JAK-STAT3信號(hào)通路,增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,該作用被證實(shí)是與ANX A1共同介導(dǎo)的結(jié)果[16]。此外,上調(diào)ANX A4可增強(qiáng)其與NF-κB p50的相互作用,激活NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞凋亡[5]。ANX A4還可以與腫瘤抑制基因Fhit蛋白的n端部分結(jié)合,形成ANX A4-Fhit復(fù)合物,特異性地阻止細(xì)胞質(zhì)易位并產(chǎn)生耐藥性,并且目前已經(jīng)通過(guò)合成Fhit衍生物在親和力測(cè)量方面進(jìn)行了量化[6]。

3.5 ANX A5在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

所有膜聯(lián)蛋白家族的成員都有暴露于凋亡細(xì)胞表面的高度保守的核心結(jié)構(gòu)域,并通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)的C型凝集素-1(dectin-1)受體觸發(fā)吞噬細(xì)胞中的耐受性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后所有表達(dá)的膜聯(lián)蛋白均能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面,其中以ANX A1、ANX A2和ANX A5為主,并根據(jù)人類(lèi)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其在惡性組織中的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)相關(guān)[17]。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí),通常位于質(zhì)膜內(nèi)小葉中的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)會(huì)重新定位到外質(zhì)膜,一旦外化,PS與其受體結(jié)合促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取。ANX A5與PS具有高親和力,二者結(jié)合阻礙PS與免疫細(xì)胞的相互作用,目前已被用作檢測(cè)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物[18]。ANX A5可能通過(guò)與其他膜聯(lián)蛋白家族成員的協(xié)同作用參與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡,尚未發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌中產(chǎn)生耐藥的機(jī)制,探究該復(fù)雜的生物活動(dòng)過(guò)程,對(duì)于未來(lái)乳腺癌的早期診斷、治療和預(yù)后方面有廣泛的應(yīng)用前景。

3.6 ANX A6在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

ANX A6是所有保守膜聯(lián)蛋白中最大的蛋白,主要存在于質(zhì)膜和內(nèi)體室中。ANX A6作為多功能支架蛋白,招募信號(hào)蛋白,調(diào)節(jié)膽固醇和膜轉(zhuǎn)運(yùn),影響肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)。ANX A6與許多癌相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程有關(guān),包括細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥等。ANX A6通常被認(rèn)為是腫瘤抑制基因,主要是因?yàn)锳NX A6負(fù)調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)及其下游MAPK和PI3K-Akt信號(hào)通路的磷酸化,這是腫瘤發(fā)生的兩個(gè)重要信號(hào),從而進(jìn)一步抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。而乳腺癌中ANX A6的表達(dá)是多功能的,其在基底樣乳腺癌患者的腫瘤組織中低表達(dá),但在浸潤(rùn)性乳腺癌表型中升高[20]。外泌體-ANX A6(ANX A6-exo)上調(diào)可提高敏感癌細(xì)胞的細(xì)胞活力和集落形成,抑制細(xì)胞凋亡[21]。ANX A6的耐藥可由多種因素介導(dǎo)。TNBC細(xì)胞暴露于缺氧(>24 h)而不是短暫暴露(<24 h)可以刺激ANX A6的表達(dá),并且缺氧誘導(dǎo)的ANX A6表達(dá)也可以增加TNBC細(xì)胞對(duì)EGFR和雄激素受體(androgen receptor,AR)拮抗劑的抗性[22]。YAP1是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子,其活性受Hippo信號(hào)通路控制,ANX A6-exo通過(guò)上調(diào)YAP1促進(jìn)Hippo通路的調(diào)控異常,并且通過(guò)沉默YAP1可以取消ANX A6-exo對(duì)乳腺癌細(xì)胞紫杉醇(PTX)耐藥和癌細(xì)胞侵襲性的促進(jìn)作用[7],其可能為ANX A6-exo促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展和PTX耐藥的潛在機(jī)制。各項(xiàng)研究表明ANX A6的檢測(cè)可能不僅能作為特定乳腺癌亞型的潛在生物標(biāo)志物,還有望對(duì)基底樣TNBC對(duì)靶向治療干預(yù)的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此進(jìn)一步研究ANX A6的上述特性并加以利用,對(duì)于作為描述乳腺癌的診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物是有必要的。

3.7 ANX A家族其他成員在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

大量臨床前和臨床研究表明,大多數(shù)ANX A具有明顯的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。構(gòu)建體外三維(3D)“乳腺導(dǎo)管原位癌(ductal carcinomainsitu,DCIS)樣”無(wú)定形結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)受全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,ATRA)調(diào)控的miRNA可以靶向調(diào)節(jié)ANX A8 mRNA從而影響ATRA-全反式視黃酸受體α(retinoic acid receptor,RARA)-ANX A8,其失調(diào)可能導(dǎo)致DCIS的發(fā)生[23]。敲低AXNA7可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡[24],其可能由激素和/或神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)。MicroRNAs(miRNAs)是細(xì)胞中一類(lèi)短的內(nèi)源性非編碼RNA,主要功能是沉默靶mRNA。miRNA篩選分析發(fā)現(xiàn)miR-186-5p在人乳腺腫瘤中下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-186-5p可以調(diào)節(jié)Bcl-2和p53信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ANXA9作為miR-186-5p的靶基因,提示miR-186-5p-ANX A9可能參與乳腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控[25]。

4 問(wèn)題與展望

ANX A蛋白家族眾多成員中的大多數(shù)已被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌有關(guān),但目前國(guó)內(nèi)外均尚未發(fā)現(xiàn)ANX A10-ANX A13在乳腺癌中的應(yīng)用,并且許多相關(guān)研究方向仍集中于蛋白C端功能的研究,這些研究雖有一定意義,但由于蛋白C端功能較為一致,無(wú)法體現(xiàn)每個(gè)家族成員的獨(dú)特分子特征及功能。此外,ANX A蛋白也與多藥耐藥密切相關(guān),目前,大多數(shù)涉及ANX A蛋白的藥物研究仍處于實(shí)驗(yàn)室階段,只有少數(shù)臨床應(yīng)用。如何將這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床治療是未來(lái)乳腺癌研究的挑戰(zhàn)之一。未來(lái)的研究應(yīng)側(cè)重于ANX A蛋白家族N端功能的研究以及深入了解ANX A家族誘導(dǎo)化療耐藥的機(jī)制,評(píng)估ANX A家族作為診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物在更大患者隊(duì)列中的臨床意義,實(shí)現(xiàn)防癌與治癌相結(jié)合。