張琦 滕彬宏

軟骨組織因其缺乏血管和細胞含量低的特點，無法完成自我修復和重建。基于間充質(zhì)干細胞治療的方法可以為軟骨組織的修復和再生提供一種新策略[1-3]。但間充質(zhì)干細胞治療策略仍然面臨植入后細胞本身存活率低，或是受周圍血液和組織液的影響導致細胞流失等問題?；诮M織工程化的水凝膠支架可以解決上述問題，其不僅可提供間充質(zhì)干細胞生存的三維載體環(huán)境，而且可以模擬天然細胞外基質(zhì)的部分特性，并具備臨床工作所需的可注射特性[4-5]。然而，傳統(tǒng)的組織工程水凝膠仍然無法有效調(diào)控細胞行為活性的表達，例如細胞擴增、凝聚、分化以及伴隨著基質(zhì)沉淀，而這些是間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞轉(zhuǎn)變過程中必不可少的細胞行為事件[6]。越來越多的研究開始關(guān)注細胞在支架中的行為，結(jié)合生物活性信號可以促進水凝膠支架中細胞表達活性和功能[7-8]。這其中，有通過修飾活性基團改變水凝膠的功能[9]，或是將活性因子直接引入水凝膠體系中[10]，也有從空間結(jié)構(gòu)入手，改變水凝膠的內(nèi)部構(gòu)造[11]。這些方式都可以在某些方面調(diào)控間充質(zhì)干細胞的功能和活性。本研究以天然高分子材料海藻酸鈉（sodium alginate，SA）為支架主體，將生物活性多肽RGD 接枝于酰化SA（methacryloyl sodium alginate，MeSA）中，研究功能化的SA 水凝膠基質(zhì)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的行為活性以及成軟骨向分化的效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 MeSA（中國阿拉丁生化科技有限公司）；三乙醇胺（triethanolamine，TEOA）緩沖液（中國麥克林生化科技有限公司）；RGD 多肽（序列GCGYRGDSPG，杭州丹港生物科技公司）；光引發(fā)劑Irgacure 2959（美國Sigma 公司）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）；鬼筆環(huán)肽染色液-FITC（美國Sigma 公司）；酶標儀（美國Bio-RAD 公司）；真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器公司）；S-4800 掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡（日本Nikon 公司）；小鼠單克隆抗體、兔多克隆抗體（美國Abcam 公司）；人源BMSCs、人源BMSCs 成軟骨向分化誘導培養(yǎng)基（蘇州賽業(yè)生物科技有限公司）；BCA 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 MeSA 水凝膠及接枝RGD 多肽的MeSA[MeSA（RGD）]水凝膠制備 MeSA（10 g/L）與光引發(fā)劑（1 g/L）溶解于去離子水中，充分混合后，在紫外光（365 nm，1 W）照射下交聯(lián)1 min后成膠，即MeSA水凝膠。采用邁克爾加成反應，將凍干MeSA 和RGD 多肽（112 mol/g）溶解在0.2 mol/L TEOA 緩沖液（pH 8.0）中，在37 ℃下過夜反應，然后透析3 d，冷凍干燥后，-20 ℃保存，即MeSA（RGD）水凝膠。

1.3 細胞培養(yǎng)和傳代 BMSCs 在含10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM 中培養(yǎng)，每隔1 d 更換1 次培養(yǎng)液。

1.4 細胞-水凝膠二維和三維培養(yǎng)體系構(gòu)建

1.4.1 細胞-水凝膠二維培養(yǎng)體系構(gòu)建 將水凝膠成膠于24 孔板底部，每個孔包含300 μL 的水凝膠溶液，在紫外光照射下交聯(lián)成膠。將1 mL 細胞懸液（密度為1.0×105個細胞/mL）接種于孔板底部的水凝膠基質(zhì)表面。

1.4.2 細胞-水凝膠三維培養(yǎng)體系構(gòu)建 將300 μL 的細胞-水凝膠懸液（密度為2×106個細胞/mL）滴加到24孔板底部，在紫外光照射下交聯(lián)成膠（形成細胞-水凝膠復合體）后，每孔添加2 mL培養(yǎng)液進行培養(yǎng)或者誘導。

1.5 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 形態(tài)的影響評估 用掃描電鏡觀察水凝膠表面的細胞形態(tài)。細胞在水凝膠表面培養(yǎng)至3 d 時，經(jīng)過PBS 洗滌和多聚甲醛固定，冷凍干燥獲得樣品。樣品經(jīng)過噴金20 s 后，在掃描電鏡下觀察細胞形態(tài)。細胞培養(yǎng)至7 d時，細胞-水凝膠復合體經(jīng)過多聚甲醛固定30 min，在細胞穿孔液（0.1% Triton X-100/PBS）中打孔10 min，經(jīng)PBS 洗滌后在鬼筆環(huán)肽染色液-FITC 中孵育30 min。后經(jīng)PBS 充分洗滌3 次，在室溫下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色10 min，染色后的樣品在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 增殖活性的影響評估 BMSCs 在水凝膠二維和三維培養(yǎng)體系中連續(xù)培養(yǎng)7 d，分別在培養(yǎng)1、3、7 d 時，采用CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖活性。

1.7 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 成軟骨向分化的影響評估

1.7.1 軟骨形成標志物膠原蛋白Ⅱ（collagen Ⅱ，CollⅡ）和軟骨聚蛋白多糖（aggrecan，ACAN）蛋白表達定性檢測 采用免疫熒光染色法。細胞-水凝膠復合體在成軟骨分化誘導液中連續(xù)培養(yǎng)14 d 后，在多聚甲醛（40 g/L）中固定30 min。PBS 洗滌3 次后，在細胞穿孔液（0.1% Triton X-100/PBS）中打孔15 min。PBS 洗滌3次后，在3%（w/v）牛血清白蛋白溶液中室溫孵育2 h。經(jīng)PBS 洗滌后加入一抗混合液，4 ℃冰箱孵育12 h。分別添加山羊抗兔IgG H&L（熒光強度：Alexa Fluor 488）、山羊抗小鼠IgG H&L（熒光強度：Alexa Fluor 647）的二抗（稀釋比為1∶500），在室溫黑暗中孵育2 h。最后在室溫下用DAPI 染色10 min，染色后的樣品在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7.2 Coll Ⅱ和ACAN mRNA 表達水平檢測 采用RT-PCR 法。細胞-水凝膠復合體在成軟骨分化誘導液中連續(xù)培養(yǎng)14 d，PBS 洗滌3 次，放置于Trizol 溶液中充分研磨提取RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 逆向轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR 分析儀解析軟骨形成標志物基因表達水平。實驗涉及的引物序列如下，28sr RNA：5'-CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3'，5'-AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3'；Coll Ⅱ：5'-TGGACGATCAGGCGAAACC-3'，5'-GCTGCGGATGCTCTCAATCT-3'；ACAN：5'- TGCATTCCACGAAGCTAACCTT- 3'，5'-GACGCCTCGCCTTCTTGAA-3'）。將28sr RNA作為內(nèi)參指標，采用2-ΔΔCt法分析目標基因表達水平。

1.7.3 Coll Ⅱ和ACAN 蛋白表達定量檢測 采用Western blot 法。細胞-水凝膠復合體在成軟骨分化誘導液中連續(xù)培養(yǎng)14 d，PBS 洗滌3 次，后放置于細胞裂解液中充分研磨。研磨后的溶液經(jīng)離心（12 000 r/min，15 min）后獲得上清液。首先使用BCA 試劑盒測定上清液的總蛋白濃度。其次采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白，將電泳結(jié)束后的蛋白凝膠轉(zhuǎn)入至PVDF 膜上。最后PVDF 膜依次經(jīng)過一抗和二抗孵育后，放置于發(fā)光成像儀內(nèi)曝光顯影，Image lab 軟件分析蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 形態(tài)影響的比較 細胞在水凝膠表面培養(yǎng)3 d 后，BMSCs在MeSA（RGD）水凝膠表面可以很好地鋪展和黏附，而在MeSA 水凝膠表面成獨立的球形結(jié)構(gòu)，見圖1。BMSCs 在水凝膠三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7 d 后，在MeSA水凝膠中的細胞呈球形并且相對獨立，而在MeSA（RGD）水凝膠內(nèi)可以向基質(zhì)中伸展和遷移，并出現(xiàn)相互聚集的現(xiàn)象，細胞增殖明顯，細胞和基質(zhì)間的相互作用更顯著，見圖2（插頁）。

圖1 細胞在水凝膠二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)3 d 時的形態(tài)電鏡下所見[A：在MeSA 水凝膠表面的細胞形態(tài)；B：在MeSA（RGD）水凝膠表面的細胞形態(tài)]

圖2 細胞在水凝膠三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)7 d 時的形態(tài)電鏡下所見[A：在MeSA 水凝膠內(nèi)的細胞形態(tài)；B：在MeSA（RGD）水凝膠內(nèi)的細胞形態(tài)]

2.2 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 增殖活性的比較 隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖活性呈現(xiàn)上升趨勢。無論在MeSA（RGD）水凝膠二維或是三維培養(yǎng)體系，BMSCs 增殖活性明顯高于在MeSA 水凝膠中（均P＜0.05），見圖3。這表明，MeSA（RGD）水凝膠可以更好地促進BMSCs 的增殖活性。

圖3 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 增殖活性的比較（A：二維培養(yǎng)體系；B：三維培養(yǎng)體系）

2.3 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 成軟骨向分化的誘導效果比較 免疫熒光染色定性分析顯示，在MeSA（RGD）水凝膠中，BMSCs Coll Ⅱ和ACAN 的表達強度高于在MeSA 水凝膠中，同時可以觀察到在MeSA（RGD）水凝膠中BMSCs 聚集明顯，出現(xiàn)細胞凝聚現(xiàn)象，見圖4（插頁）。定量分析顯示，在Me-SA（RGD）水凝膠中，BMSCs Coll Ⅱ和ACAN 基因及蛋白表達水平高于在MeSA 水凝膠中（均P＜0.05），見圖5。這表明，MeSA（RGD）水凝膠可以更好地促進BMSCs 的成軟骨向分化。

圖4 體外培養(yǎng)14 d 后的細胞-水凝膠復合體激光共聚焦顯微鏡下所見

圖5 體外培養(yǎng)14 d 后的細胞-水凝膠復合體的軟骨相關(guān)基因mRNA 和蛋白的表達水平比較（A：ACAN mRNA 表達水平比較；B：Coll ⅡmRNA 表達水平比較；C：ACAN 和Coll Ⅱ在水凝膠基質(zhì)內(nèi)的蛋白表達電泳圖）

3 討論

水凝膠支架作為一種新型細胞培養(yǎng)體系和可注射修復材料，在近些年的組織再生領域得到廣泛的關(guān)注和研究[12-13]。以海藻酸鈉為代表的天然高分子材料，可以通過物理和化學改性，制備適用于組織工程技術(shù)的支架體系[14-16]。海藻酸鈉來源于褐色海藻，具有優(yōu)良的親水性和生物相容性，其較慢的降解速度可以保證支架較長時間充填和修復目標缺損[17-18]。以往的研究表明，通過共價交聯(lián)形成的MeSA 水凝膠，可以提供一種穩(wěn)定非降解的膠態(tài)結(jié)構(gòu)，并且有利于細胞的生存和生長[19]。然而，天然的細胞外基質(zhì)是復雜和動態(tài)的，這種穩(wěn)定且高度交聯(lián)的網(wǎng)絡基質(zhì)結(jié)構(gòu)往往會限制種子細胞的遷移和增殖。同時，由于MeSA 本身缺乏與細胞接觸的位點，這也會導致種子細胞在此凝膠基質(zhì)中的信號傳遞和細胞-基質(zhì)相互作用受到限制[20-21]?；诖?，本研究著眼于BMSCs 向軟骨分化轉(zhuǎn)變中的關(guān)鍵細胞行為，構(gòu)建功能化MeSA 基質(zhì)，改善基質(zhì)的生物活性，用以調(diào)節(jié)關(guān)鍵細胞行為并高效促軟骨形成。

本研究首先通過邁克爾加成反應，將仿生多肽接枝于MeSA 中的雙鍵上。仿生多肽由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容性好以及生物學效果顯著等優(yōu)點，可以賦予水凝膠額外的生物性能。以往的研究表明，RGD 多肽可以通過整合素，提供細胞作用于基質(zhì)的結(jié)合位點并調(diào)控種子細胞存活和增殖，顯著改善凝膠基質(zhì)微環(huán)境。Luo 等[22]研究RGD 調(diào)控BMSCs 增殖和成骨分化的實驗中，證明了離子交聯(lián)的MeSA 水凝膠通過接枝RGD 序列，可以改善細胞增殖活性。同時指出增殖活性的提高可以更好地促進成骨分化效果。Huebsch等[8]在研究三維水凝膠基質(zhì)對BMSCs 分化的調(diào)控中，為了更好地模擬天然細胞外基質(zhì)環(huán)境，也是首先將RGD 多肽修飾于MeSA 基質(zhì)中，增強細胞與基質(zhì)間的連接。同時也指出，細胞與基質(zhì)間的作用力加強，是調(diào)控細胞分化的重要指標。因此，在水凝膠的設計中，增強基質(zhì)與細胞間的黏附對于細胞活性的表達和細胞分化的調(diào)控至關(guān)重要。就目前的研究動態(tài)來講，仿生RGD 多肽功能化SA 在調(diào)節(jié)BMSC 成軟骨向分化中的細胞行為還鮮有報道。本實驗中，無論在二維培養(yǎng)體系還是三維培養(yǎng)體系，細胞可以與功能化基質(zhì)產(chǎn)生更好的相互作用，細胞表現(xiàn)出顯著的遷移趨勢和骨架延展。在RGD 對細胞活性調(diào)控的基礎上，將細胞-水凝膠三維復合體在體外誘導培養(yǎng)14 d 后，功能化的水凝膠基質(zhì)可以更好地調(diào)控BMSCs 的成軟骨向分化。同時，在功能化的三維培養(yǎng)體系內(nèi)，細胞出現(xiàn)明顯的聚集成團現(xiàn)象，而BMSCs 在發(fā)育和分化過程中的聚集和凝聚現(xiàn)象，是軟骨形成過程中的關(guān)鍵行為特征[23]。

本研究通過將RGD 多肽接枝于MeSA 上，改善共價交聯(lián)水凝膠的基質(zhì)特性，促進了BMSCs 增殖和聚集活性的表達。BMSCs 在凝膠基質(zhì)中誘導培養(yǎng)14 d 后，軟骨形成相關(guān)的蛋白和基因表達顯著。因此，該功能化的水凝膠可以提供BMSCs 良好的生存空間和微環(huán)境，促進BMSCs 在凝膠基質(zhì)中的成軟骨向分化。