吳宇 謝祥成 趙寧 楊秀

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管病變的常見慢性并發(fā)癥之一，以腎小球基底膜增厚、通透性增加，系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)增多為主要病理改變，表現(xiàn)為持續(xù)性白蛋白尿[1]。除了合理藥物治療積極控制血糖之外，飲食治療是糖尿病治療的重點(diǎn)，同時(shí)也是DN 患者治療的基礎(chǔ)[2]。低蛋白飲食是指在滿足機(jī)體營(yíng)養(yǎng)的情況下，降低機(jī)體蛋白攝入量的一種膳食方式，其目的是減少體內(nèi)代謝廢物，減輕腎臟代謝負(fù)荷[3]。研究顯示，低蛋白結(jié)合酮酸飲食可有效降低DN 患者24 h 尿白蛋白排泄率，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激水平，對(duì)延緩腎功能損傷起到一定作用[4-5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)參與腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化，TGF-β1 的激活與DN 發(fā)展有關(guān)[6]?；诖?，本研究探討低蛋白補(bǔ)充酮酸對(duì)DN 小鼠腎臟功能的改善作用和對(duì)腎組織TGF-β1 含量影響，分析完善低蛋白飲食方式延緩DN進(jìn)展的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)db/db 小鼠（2 型糖尿病腎病模型小鼠）18只、db/m 小鼠（db/db 小鼠的對(duì)照）6 只（7 周齡，均為雄性），購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008], 飼養(yǎng)于浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司屏障系統(tǒng)[許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0003]。系統(tǒng)環(huán)境為恒溫（22±2）℃、恒濕（50%～60%），通風(fēng)，12 h 明暗交替光照。本研究經(jīng)浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：ZJEY-20230619-01）。

1.1.2 主要試劑和儀器 正常蛋白飼料、低蛋白飼料、低蛋白-酮酸飼料均購自天津科澳協(xié)力飼料有限公司。Ⅳ型膠原（ⅣCollagen，Ⅳ-Col）、TGF-β1 抗體購自美國affinity 抗體公司（批號(hào)：82A6748、20r6523）。E100 顯微鏡購自日本尼康公司；KF-PRO-120 全景掃描儀購自寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與飲食干預(yù) 18 只db/db 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后尾靜脈采血測(cè)定空腹6 h 血糖，平均血糖值≥16.7 mmol/L，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常蛋白飲食組、低蛋白飲食組、低蛋白-酮酸飲食組，每組各6 只，分別給予正常蛋白飲食（添加24%酪蛋白）、低蛋白飲食（添加6%酪蛋白）、低蛋白-酮酸飲食。6 只db/m 小鼠設(shè)為正常對(duì)照組，給予正常蛋白飲食。各組小鼠以對(duì)應(yīng)飼養(yǎng)方式連續(xù)喂養(yǎng)12 周，結(jié)束后進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 基本指標(biāo)檢測(cè) 自喂養(yǎng)開始至結(jié)束，每隔2 周測(cè)定各組小鼠體重。喂養(yǎng)結(jié)束后，小鼠當(dāng)天禁食過夜，第2 天記錄小鼠的24 h 飲水量及排尿量。

1.2.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 記錄小鼠24 h 飲水量及排尿量后，立即通過眼眶靜脈叢取血。血糖儀檢測(cè)血糖；分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐、尿素氮、TG 和TC。

1.2.2.3 腎臟體積、腎重/體重比值檢測(cè) 小鼠取血后，立即二氧化碳安樂死，稱體重。取小鼠雙側(cè)腎臟，測(cè)量腎臟橫徑以大體反映腎臟體積，并拍照記錄，稱重量，計(jì)算腎重/體重比值。保留腎臟組織用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2.4 腎臟組織病理變化檢測(cè) 制備腎臟組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。HE 染色，鏡下觀察腎臟組織病理變化。同時(shí)行過碘酸雪夫染色（periodic acid-Schiff stain，PAS）：烤箱（62 ℃）烘烤切片1 h，脫蠟、水化、清洗；0.5%過碘酸水溶液孵育氧化5 min，蒸餾水徹底清洗；雪夫染色試劑孵育20 min，清洗；哈瑞蘇木素染細(xì)胞核1 ～2 min，流水清洗；乙醇脫水后透明，封片，鏡下觀察系膜基質(zhì)、基底膜增生和糖原聚集情況（染色紅紫色為陽性）。

1.2.2.5 腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 表達(dá)水平檢測(cè)采用免疫組化染色法，腎臟組織切片烘烤、脫蠟、水化，過氧化氫阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 清洗。抗原修復(fù)，PBS 清洗甩干，封閉液封閉20 min。稀釋（1∶100）的TGF-β1、Ⅳ-Col 一抗抗原，4 ℃過夜孵育。隔天取出，常溫放置1 h，清洗。隨后孵育二抗30 min，清洗。顯色試劑孵育反應(yīng)，根據(jù)顯色程度終止反應(yīng)，清洗后，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，清洗，脫水。透明標(biāo)本，封片，顯微鏡下觀察陽性表達(dá)情況（染色黃色至棕黃色為陽性）。用Image J 軟件定量分析免疫組化圖，通過AOD 值作統(tǒng)計(jì)圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠基本指標(biāo)比較 與正常對(duì)照組比較，正常蛋白飲食組小鼠喂養(yǎng)第2、4、6、8、10、12 周的體重均增加（均P＜0.05）；24 h 飲水量和排尿量均增加（均P＜0.05）。與正常蛋白飲食組比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠第2、4、6、8、10、12 周體重均減輕（均P＜0.05）；24 h 飲水量和排尿量均減少（均P＜0.05）。見表1、表2。

表1 4 組小鼠體重比較（g）

表2 4 組小鼠24 h 飲水量和排尿量比較（mL）

2.2 4 組小鼠生化指標(biāo)變化 4 組小鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、TG、TC 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，正常蛋白飲食組小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、TG、TC 水平均升高（均P＜0.05）。與正常蛋白飲食組比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、TG、TC 水平均降低（均P＜0.05）。見表3。

表3 4 組小鼠生化指標(biāo)改變

2.3 4 組小鼠腎臟體積、腎重/體重比值比較 與正常對(duì)照組相比，正常蛋白飲食組小鼠腎臟體積增大，且腎臟周圍出現(xiàn)較多脂肪，小鼠腎重/體重比值上升（P＜0.01）；與正常蛋白飲食組小鼠比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠周圍的脂肪明顯減少，腎臟體積縮小，小鼠腎重/體重比值顯著下降（均P＜0.05）。見圖1（插頁）、表4。

表4 4 組小鼠腎重/體重比值比較（mg/g）

圖1 4 組小鼠腎臟體積肉眼觀察比較

2.4 4 組小鼠腎臟組織病理變化比較 正常對(duì)照組小鼠腎臟組織形態(tài)正常，腎小球系膜無增生，組織內(nèi)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或結(jié)締組織增生；正常蛋白飲食組小鼠腎小球形狀不規(guī)則，系膜基質(zhì)增生，并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常蛋白飲食組小鼠比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠腎小球系膜增生有所改善。見圖2（插頁）。

圖2 4 組小鼠腎臟組織病理變化鏡下所見

2.5 4 組小鼠腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比較4 組小鼠腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，正常蛋白飲食組小鼠腎組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平均升高（均P＜0.05）。與正常蛋白飲食組比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠腎組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平均降低（均P＜0.05）。見圖3（插頁）、圖4。

圖4 4 組小鼠腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比較

3 討論

蛋白質(zhì)攝入可促進(jìn)腎小球血管擴(kuò)張，促進(jìn)胰高血糖素分泌，升高機(jī)體血糖水平，因此對(duì)于早期DN 患者，限制膳食中蛋白質(zhì)含量可減輕腎臟負(fù)擔(dān)，并控制機(jī)體血糖水平[7]。通過既往DN 動(dòng)物模型可了解到，低蛋白飲食或聯(lián)合酮酸可減輕DN 鼠腎臟肥大，減輕腎小球系膜基質(zhì)積聚以及腎小球基底膜增厚等腎臟病理改變，改善血糖、血脂等生化指標(biāo)[8-9]。本研究中，自發(fā)性2 型糖尿病動(dòng)物模型db/db 小鼠分別用正常蛋白飼料、低蛋白飼料、低蛋白-酮酸飼料喂養(yǎng)12 周后，在低蛋白喂養(yǎng)的方式下，db/db 小鼠體重下降，飲水量、排尿量增加，血糖水平下降，血脂TG、TC 指標(biāo)含量下降，腎臟體積縮小，腎周圍脂肪組織減少，其中聯(lián)合酮酸可加強(qiáng)對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的控制，表明低蛋白或聯(lián)合酮酸可改善db/db 組小鼠基本指標(biāo)以及DN 相關(guān)生化指標(biāo)，減輕DN 小鼠腎臟肥大。

TGF-β1 是目前較為明確的腎臟纖維化誘導(dǎo)因子，通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和膠原合成，參與DN 進(jìn)展[10-11]。張世魯?shù)萚12]研究表明，抑制DN 大鼠腎臟組織TGF-β1 表達(dá)，可改善大鼠腎臟組織纖維化程度。Ⅳ-Col 是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的主要膠原組成成分，在DN 早期合成增加[13]。唐詩等[14]研究表明，高糖誘導(dǎo)可促進(jìn)小鼠系膜細(xì)胞TGF-β1 基因表達(dá)，和細(xì)胞上清液Ⅳ-Col 含量。本研究染色結(jié)果顯示，正常蛋白飲食組小鼠腎小球形狀改變，基底膜增厚，組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平較正常對(duì)照組小鼠顯著升高，而低蛋白或聯(lián)合酮酸飼養(yǎng)可顯著降低db/db 小鼠腎組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平，減少系膜基質(zhì)增生，提示低蛋白或聯(lián)合酮酸飲食可能通過降低腎臟組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平而減少DN 小鼠腎臟系膜基質(zhì)增生。

綜上所述，低蛋白和酮酸補(bǔ)充的飲食方式可改善DN 小鼠生化指標(biāo)，降低腎臟組織TGF-β1、Ⅳ-Col 表達(dá)水平，改善腎組織損傷形態(tài)，具有延緩DN 腎損傷的作用。