王珍珍 黃琦 黃鈞濤 沈毅 鄔振華

慢性鼻竇炎是目前臨床最常見的慢性疾病之一，以鼻竇黏膜炎癥、繼發(fā)自然引流通道阻塞而導(dǎo)致的一系列臨床癥狀為特征，如鼻塞、鼻涕、鼻后滴漏、面部脹痛、嗅覺減退或喪失、頭痛、疲勞甚至抑郁。慢性鼻竇炎會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。研究表明，慢性鼻竇炎具有臨床、病理和免疫多樣性，盡管其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但炎癥相關(guān)因素起著重要作用，主要表現(xiàn)為鼻竇黏膜的慢性炎癥，伴有大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的炎性浸潤及黏膜上皮結(jié)構(gòu)的病理變化[3-4]。隨著基因測序及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，疾病的發(fā)病機(jī)制在基因?qū)用娴玫搅烁敿?xì)的探究。采用生物基因測序技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法相結(jié)合，可將目標(biāo)對(duì)象的特征數(shù)據(jù)納入對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，通過計(jì)算機(jī)迭代模擬，篩選出目標(biāo)的候選相關(guān)特征[5-6]。基于此，本研究使用多種機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)慢性鼻竇炎的相關(guān)測序芯片進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上，篩選出慢性鼻竇炎的相關(guān)基因，并與慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境中的炎性細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 慢性鼻竇炎相關(guān)基因表達(dá)芯片獲取 從高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫公開獲取慢性鼻竇炎疾病相關(guān)基因芯片，選擇GSE23552 芯片作為本次研究的訓(xùn)練集。該芯片由17 例慢性鼻竇炎樣本和22 例正常對(duì)照樣本組成，根據(jù)GPL 5175 平臺(tái)的探針注釋信息，對(duì)該芯片進(jìn)行注釋，使用R 軟件的“l(fā)imma”程序包對(duì)該芯片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，獲得基因表達(dá)矩陣用于后續(xù)分析。本研究經(jīng)寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：KY2023ML046）。

1.2 差異基因篩選、加權(quán)共表達(dá)分析及功能分析使用R 軟件的“l(fā)imma”程序包對(duì)上述GSE23552 芯片中的慢性鼻竇炎和正常對(duì)照樣本進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)：（1）|log2FC|＞1（即兩組基因表達(dá)量的差異＞2 倍）；（2）校準(zhǔn)后P＜0.05，當(dāng)基因同時(shí)滿足上述2 個(gè)條件時(shí)認(rèn)為是慢性鼻竇炎樣本和正常對(duì)照樣本的差異基因。篩選后獲得的差異基因的表達(dá)分布情況通過基因熱圖和火山圖呈現(xiàn)。同時(shí)，采用加權(quán)共表達(dá)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）對(duì)兩組樣本進(jìn)行分析，篩選相關(guān)基因，選擇基因重要性＞0.5 和模塊相關(guān)性＞0.8 作為過濾標(biāo)準(zhǔn)，過濾并篩選疾病相關(guān)基因。對(duì)上述差異基因和加權(quán)共表達(dá)分析的結(jié)果取交集，即為候選慢性鼻竇炎的相關(guān)基因，用于進(jìn)一步機(jī)器學(xué)習(xí)篩選。將上述交集基因輸入蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫（search tool for retrieval of interacting genes/proteins，STRING）在線分析網(wǎng)站，分析上述基因蛋白相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。此外，選擇P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)交集基因行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encylopaedia of genes and genomes，KEGG）分析，探究其潛在的生物學(xué)功能及有關(guān)信號(hào)通路。

1.3 機(jī)器學(xué)習(xí)篩選核心基因及驗(yàn)證 分別使用最小絕對(duì)值收斂和選擇算子算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、隨機(jī)森林算法以及支持向量機(jī)遞歸特征消除算法（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）對(duì)上述慢性鼻竇炎候選基因進(jìn)行篩選，分別獲得3 種算法下的特征基因集，并對(duì)上述3 種算法的結(jié)果取交集，獲得慢性鼻竇炎疾病相關(guān)基因。使用箱式圖反映基因在慢性鼻竇炎樣本和正常對(duì)照樣本的差異顯著性，使用ROC 曲線的AUC 評(píng)估基因的診斷效能，并使用GSE179265 芯片作為外部隊(duì)列進(jìn)行相關(guān)外部驗(yàn)證。

1.4 慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境分析 采用CIBERSORT 算法對(duì)訓(xùn)練集芯片進(jìn)行免疫浸潤分析，對(duì)每個(gè)樣本中的22 種免疫細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行預(yù)測，并進(jìn)行相關(guān)差異分析。此外，對(duì)慢性鼻竇炎樣本和正常對(duì)照樣本的免疫細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行差異比較，采用Spearman 秩相關(guān)對(duì)診斷基因與免疫細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 慢性鼻竇炎差異基因篩選及加權(quán)共表達(dá)分析結(jié)果 基于|log2FC| ＞1，校準(zhǔn)后P＜0.05 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)GSE23552 芯片進(jìn)行差異表達(dá)分析，共獲得309 個(gè)差異基因，其中126 個(gè)基因在正常對(duì)照樣本中上調(diào)，其余183 個(gè)基因在慢性鼻竇炎樣本中上調(diào)（圖1A，見插頁）。使用加權(quán)共表達(dá)分析對(duì)上述樣本進(jìn)行聚類（圖1B，見插頁），篩選疾病相關(guān)基因模塊。如圖1C（插頁）所示，天青色、藍(lán)色、棕色模塊中的基因與慢性鼻竇炎相關(guān)，綜合考慮模塊的顯著性檢驗(yàn)P值、圖1D（插頁）中的基因顯著性及圖1E（插頁）模塊相關(guān)性，選擇天青色模塊的總計(jì)214 個(gè)核心基因作為慢性鼻竇炎差異基因最終篩選結(jié)果。

圖1 慢性鼻竇炎候選基因的篩選（A：慢性鼻竇炎差異性基因火山圖；B：加權(quán)共表達(dá)對(duì)差異性基因進(jìn)一步分析篩選出疾病相關(guān)基因模塊；C：分析各模塊基因與慢性鼻竇炎的相關(guān)性；D：各模塊基因的顯著性；E：選擇天青色模塊進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)分析，篩選出214 個(gè)相關(guān)基因）

2.2 慢性鼻竇炎差異基因PPI 網(wǎng)絡(luò)及功能分析 將上述309 個(gè)差異表達(dá)基因和214 個(gè)加權(quán)共表達(dá)分析模塊基因取交集后，共獲得184 個(gè)交集基因。將其輸入STRING 在線數(shù)據(jù)庫后，獲得其PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。使用R 軟件對(duì)交集基因行GO 富集分析（圖2A，見插頁），結(jié)果表明，上述184 交集基因主要參與白細(xì)胞游出、免疫反應(yīng)的細(xì)胞激活等生物學(xué)過程。KEGG 分析顯示（圖2B，見插頁），上述交集基因主要參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱的形成等相關(guān)信號(hào)通路。

圖2 相關(guān)功能分析（A：基本本體富集分析；B：京都基因與基因組百科全書分析）

2.3 慢性鼻竇炎相關(guān)診斷基因機(jī)器學(xué)習(xí)篩選及驗(yàn)證 LASSO 回歸結(jié)果表明，當(dāng)基因數(shù)為9 時(shí)該算法擬合效果最好，所篩選獲得基因包括PLP1、ADRA1A、CSRP1、SCN7A、ALX1、CD180、LPHN3、SLAMF6 和EVI2B（圖3A、B，見插頁）。隨機(jī)森林算法分析結(jié)果表明，當(dāng)決策樹數(shù)目為10 時(shí)模型擬合最優(yōu)，進(jìn)而選擇重要性＞1 的基因作為候選診斷基因，包括CSRP1、PLP1、F13A1、CGNL1、FHL1、EMR3、GPR97、CD209、SPON1 和CCR3（圖3C、D，見插頁）。SVM-RFE 分析表明，SCN7A、ADRA1A、ALX1 和PLP1可作為疾病診斷的候選基因（圖3E，見插頁）。隨后，對(duì)上述結(jié)果取交集，PLP1 在3 種算法擬合下均考慮為慢性鼻竇炎相關(guān)基因（圖3F，見插頁），故考慮其為潛在的疾病相關(guān)診斷基因。

圖3 慢性鼻竇炎相關(guān)診斷基因的篩選（A、B：LASSO 回歸得出擬合效果最好的9 個(gè)候選基因；C、D：隨機(jī)森林算法分析得出擬合效果最好的10 個(gè)候選基因；E：SVM-RFE 分析得出4 個(gè)候選基因；F：3 種算法取交集得出最終得慢性鼻竇炎相關(guān)診斷基因PLP1）

對(duì)PLP1 進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證，結(jié)果表明，PLP1 基因在訓(xùn)練集（GSE23552）和驗(yàn)證集（GSE179265）均表現(xiàn)為在慢性鼻竇炎樣本中下調(diào)（圖4A、B），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ROC 曲線顯示，PLP1 在訓(xùn)練集中的AUC 為1.000（圖4C），在驗(yàn)證集中的AUC 為0.950（圖4D），表明該基因有良好的診斷效能。

圖4 PLP1 進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證（A、B：PLP1 在2 個(gè)慢性鼻竇炎樣本集中表現(xiàn)為下調(diào)；C：PLP1 在訓(xùn)練集中的ROC 曲線；D：PLP1 在驗(yàn)證集中的ROC 曲線）

2.4 慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境探究 采用CIBERSORT算法對(duì)訓(xùn)練集芯片中22 種免疫細(xì)胞浸潤情況行免疫浸潤分析預(yù)測，各免疫細(xì)胞在每個(gè)樣本中的分布情況及占比見圖5A（插頁）。隨后，對(duì)22 種免疫細(xì)胞的浸潤情況作差異分析（圖5B，見插頁），結(jié)果表明慢性鼻竇炎樣本中的漿細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞、活化NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和M0 巨噬細(xì)胞較正常對(duì)照樣本顯著減少，而M2 巨噬細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞顯著增加。Spearman 秩相關(guān)分析顯示，PLP1 基因表達(dá)與漿細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞、活化NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0 巨噬細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，與M2 巨噬細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、靜息樹突細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)（圖5C、D，見插頁）。其中，PLP1 表達(dá)量與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)系數(shù)r=-0.7（P＜0.001）。

圖5 PLP1 表達(dá)量與慢性鼻竇炎免疫微環(huán)境分析（A：CIBERSORT 對(duì)22 種免疫細(xì)胞浸潤情況分析；B：Spearman 秩相關(guān)分析PLP1基因表達(dá)量與嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性；C：22 種免疫細(xì)胞的浸潤情況的差異分析；D：PLP1 表達(dá)量與各細(xì)胞相關(guān)系數(shù)顯示）

3 討論

慢性鼻竇炎為耳鼻咽喉頭頸外科常見疾病之一，是一種病因復(fù)雜、復(fù)發(fā)率高的鼻腔鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病。隨著對(duì)慢性鼻竇炎遺傳學(xué)的深入探索，研究表明慢性鼻竇炎患者具有良好的遺傳突變特征[7-8]，但對(duì)其是否表現(xiàn)出可識(shí)別的單基因改變卻缺乏研究。在此基礎(chǔ)上，本文對(duì)公開的測序數(shù)據(jù)庫中有效數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，通過加權(quán)共表達(dá)分析得出慢性鼻竇炎相關(guān)候選基因，通過PPI 網(wǎng)絡(luò)及GO 富集分析與KEGG 分析得出上述候選基因主要位于細(xì)胞膜，與免疫相關(guān)反應(yīng)有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其通過白細(xì)胞介導(dǎo)免疫、免疫反應(yīng)的細(xì)胞激活、白細(xì)胞趨化反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)等發(fā)揮生物學(xué)作用，本研究顯示慢性鼻竇炎的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)，這與之前的研究一致[9-10]。

研究表明PLP1 是髓鞘形成中最豐富的蛋白質(zhì)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究被廣泛報(bào)道[11-12]。除神經(jīng)系統(tǒng)病變外，PLP1 在其他疾病中也有相關(guān)研究，有文獻(xiàn)報(bào)道原發(fā)性癌癥患者中PLP1 的高水平表達(dá)與總體生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[13]，PLP1 可作為子宮肌瘤的潛在生物標(biāo)志物[14]。本研究通過3 種算法對(duì)候選基因進(jìn)行交集分析，最終得到潛在疾病相關(guān)診斷基因PLP1，并通過診斷ROC 曲線驗(yàn)證PLP1 在慢性鼻竇炎中的診斷效能，所研究的2 個(gè)數(shù)據(jù)集的AUC 為分別為1.000 和0.950，驗(yàn)證了PLP1 的診斷特異性，表明PLP1 可以作為慢性鼻竇炎的診斷基因，并可指導(dǎo)后續(xù)的相關(guān)分子生物學(xué)水平的研究。

巨噬細(xì)胞存在于各種組織中，在機(jī)體的發(fā)育、組織重塑、傷口愈合、血管生成和代謝中擔(dān)任著重要角色。巨噬細(xì)胞根據(jù)其分泌的不同炎癥介質(zhì)及基因特征分為不同的亞型，每種亞型的免疫作用各不相同[15]。隨著對(duì)慢性鼻竇炎患者免疫微環(huán)境的深入探索，研究表明慢性鼻竇炎中M2 型巨噬細(xì)胞數(shù)量在一定程度上有所增加，其主要通過復(fù)雜的免疫反應(yīng)和組織重塑來調(diào)節(jié)慢性鼻竇炎的發(fā)病機(jī)制并影響鼻竇炎的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸[16-17]。巨噬細(xì)胞是鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的重要細(xì)胞來源，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生[18]。研究表明在慢性鼻竇炎，特別是嗜酸性慢性鼻竇炎的發(fā)展過程中，嗜酸性粒細(xì)胞作為重要的效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮作用，其作為一種有害的免疫細(xì)胞，加劇局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致治療效果不佳，增加了并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[19]。本研究對(duì)慢性鼻竇炎患者標(biāo)本中的22 種免疫細(xì)胞浸潤情況行免疫浸潤分析及差異性分析，顯示CRS 中嗜酸性粒細(xì)胞、M2 巨噬細(xì)胞顯著增加，而M0 巨噬細(xì)胞較正常樣本顯著減少。對(duì)PLP1 基因與免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示PLP1 基因表達(dá)與M0 巨噬細(xì)胞和M1 巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)，與M2 巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步表明了PLP1 作為低表達(dá)基因與慢性鼻竇炎的免疫相關(guān)性，影響著慢性鼻竇炎的預(yù)后及復(fù)發(fā)，顯示其臨床意義。

本研究尚有不足之處，盡管通過機(jī)器學(xué)習(xí)得出PLP1 可作為慢性鼻竇炎的診斷性基因，與慢性鼻竇炎的免疫微環(huán)境存在一定的相關(guān)性，但尚缺乏PCR 等相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐驗(yàn)證。

綜上所述，本研究運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)得出慢性鼻竇炎的發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)診斷基因?yàn)镻LP1，并初步推斷出相關(guān)基因可能的作用機(jī)制及其與慢性鼻竇炎嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性，為后續(xù)進(jìn)一步機(jī)制及通路的研究提供了方向。