潘璐璐 王澤敏 陳輝 何穎雪 胡文雯 邵國(guó)建

作為終末期腎臟病患者的主要替代治療方法，維持性血液透析（maintenance hemodialysis, MHD）可有效延長(zhǎng)患者的生存期。但隨著透析時(shí)間的增加，MHD 患者容易出現(xiàn)多種并發(fā)癥，其中睡眠障礙較為常見(jiàn)，其會(huì)增加MHD 患者心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)以及死亡率[1-3]。目前對(duì)于MHD 患者睡眠障礙發(fā)生的影響因素及機(jī)制的研究，結(jié)論尚不一致。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)腸道菌群能夠影響大腦的活動(dòng)，可能是睡眠機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[4-5]?；诖?，本研究通過(guò)分析睡眠障礙MHD 患者和非睡眠障礙MHD 患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，探討MHD 患者睡眠障礙與腸道菌群的關(guān)系，以期為臨床上MHD 患者睡眠障礙的治療提供新策略。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2022 年1 至7 月在溫州市中心醫(yī)院根據(jù)匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（Pittsburgh sleep quality index，PSQI）量表[6]評(píng)估為睡眠障礙（PSQI 總分≥5 分）和非睡眠障礙（PSQI 總分＜5 分）的MHD 患者各30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80 歲；（2）在本院規(guī)律接受MHD 治療至少3 個(gè)月以上；（3）至少3 個(gè)月內(nèi)無(wú)抗菌藥物及益生菌制劑服用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在以下情況或疾?。壕窦膊?、認(rèn)知功能障礙、嚴(yán)重心肺功能不全、惡性腫瘤、劇烈疼痛、消化系統(tǒng)感染、膽囊或結(jié)腸切除術(shù)后等；（2）正處于禁食或腸內(nèi)、外營(yíng)養(yǎng)支持患者；（3）患者或家屬不能合作。兩組患者性別、年齡、BMI 及原發(fā)病等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：快K2021-04-040），所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 糞便標(biāo)本采集 使用糞便微生物DNA 專用采集管收集患者新鮮糞便標(biāo)本（約2～5 g），于30 min內(nèi)放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 標(biāo)本DNA 提取和檢測(cè) 采用糞便DNA 提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN 公司）提取糞便標(biāo)本總DNA，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳儀（美國(guó)Bio-RAD 公司）和紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo 公司）進(jìn)行DNA 濃度及純度的檢測(cè)。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 取50 ng 稀釋后的基因組DNA 作為模板DNA，使用美國(guó)NEB 公司的Phusion Hot start flex 2X Master Mix 高效高保真酶對(duì)16S rDNA 基因V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR 產(chǎn)物由核酸純化試劑盒（美國(guó)Beckman 公司）純化，Qubit 熒光儀（美國(guó)Invitrogen 公司）定量。

1.2.4 16S rDNA 高通量測(cè)序及生物學(xué)信息分析 對(duì)純化后的PCR 產(chǎn)物使用Agilent 2100 生物分析儀（美國(guó)Agilent 公司）和文庫(kù)定量試劑盒（美國(guó)Illumina 公司）進(jìn)行評(píng)估。合格擴(kuò)增產(chǎn)物使用NovaSeq 6000 測(cè)序儀（美國(guó)Illumina 公司）進(jìn)行2×250 bp 的雙端測(cè)序。將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分、拼接和過(guò)濾，再使用QIIME2 軟件進(jìn)行分析，將數(shù)據(jù)中有效序列以97%的相似度進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OUT）劃分?；贜T-16S 與SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋OUT，獲得各樣品在門(mén)和屬分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)圖。采用α 多樣性和β 多樣性進(jìn)行菌群多樣性分析。本研究α 多樣性分析主要通過(guò)Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)進(jìn)行樣本內(nèi)物種多樣性的評(píng)估，其中Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)越大，Simpson 指數(shù)越小，代表群落α 多樣性越高。β 多樣性分析通過(guò)基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）來(lái)反映樣本間物種多樣性。采用線性判別分析及效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析進(jìn)行菌群差異性分析。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群α 多樣性、β 多樣性、腸道菌群結(jié)構(gòu)，并分析兩組腸道菌群結(jié)構(gòu)差異的顯著性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。腸道菌群生物學(xué)信息的統(tǒng)計(jì)分析和作圖使用R 軟件（Version 2.15.3）完成。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群α 多樣性比較 睡眠障礙組患者腸道菌群的Chao1 指數(shù)為233.35±65.22，Shannon 指數(shù)為4.80±0.48，Simpson指數(shù)為0.0749±0.0253；非睡眠障礙組患者腸道菌群的Chao1 指數(shù)為235.91±59.73，Shannon 指數(shù)為4.24±0.51，Simpson 指數(shù)為0.1295±0.0570。兩組患者腸道菌群的Chao1 指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.159，P=0.874）。睡眠障礙組的Shannon 指數(shù)高于非睡眠障礙組（t=4.342，P＜0.001），睡眠障礙組的Simpson指數(shù)低于非睡眠障礙組（t=-4.799，P＜0.001）。這提示睡眠障礙組患者腸道菌群的α 多樣性高于非睡眠障礙組患者。

2.2 睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群β 多樣性比較 PCoA 分析顯示，PC1 對(duì)于樣本差異的貢獻(xiàn)值為15.01%，PC2 對(duì)于樣本差異的貢獻(xiàn)值為10.18%。睡眠障礙組與非睡眠障礙組樣本在坐標(biāo)圖中雖有一定重合，但整體距離存在一定分離趨勢(shì)，進(jìn)一步Anosim 分析提示睡眠障礙組與非睡眠障礙組的群落結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=0.10，P=0.04），見(jiàn)圖1。

圖1 兩組患者腸道菌群β 多樣性的PCoA 圖

2.3 睡眠障礙組與非睡眠障礙組患者腸道菌群結(jié)構(gòu)比較 在門(mén)分類水平，兩組患者腸道菌群主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）及變形菌門(mén)（Proteobacteria）構(gòu)成，這4 個(gè)菌門(mén)包含了所有樣本豐度95%以上的腸道細(xì)菌。與非睡眠障礙組比較，睡眠障礙組中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度明顯下降，而變形菌門(mén)的相對(duì)豐度明顯升高。在屬分類水平，與非睡眠障礙組比較，睡眠障礙組中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、羅氏菌屬（Roseburia）及乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對(duì)豐度明顯下降，而大腸桿菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）和毛螺菌屬（Lachnospira）的相對(duì)豐度明顯升高。

2.4 睡眠障礙組與非睡眠障礙組腸道菌群結(jié)構(gòu)差異顯著性分析 兩組患者腸道菌群結(jié)構(gòu)差異行LEfSe 分析，并制作LEfSe 分析柱狀圖。柱狀圖縱坐標(biāo)是腸道菌群，橫坐標(biāo)是線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）分值，其長(zhǎng)度代表差異的顯著性。本研究LEfSe 分析的閾值設(shè)置為L(zhǎng)DA＞2.5，P＜0.05。結(jié)果顯示，在門(mén)水平，睡眠障礙組患者腸道菌群中擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于非睡眠障礙組患者，厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)相對(duì)豐度顯著低于非睡眠障礙組患者。在屬水平，MHD 睡眠障礙組患者腸道菌群中擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀氏菌屬、毛螺菌屬、鏈球菌屬（Streptococcus）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、巴恩斯氏菌屬（Barnesiella）及顫桿菌克屬（Oribacterium）相對(duì)豐度顯著高于非睡眠障礙組患者（均P＜0.05），乳桿菌屬、雙歧桿菌屬及羅氏菌屬相對(duì)豐度顯著低于非睡眠障礙組患者（均P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組患者腸道菌群LEfSe 分析柱狀圖

3 討論

近年來(lái)，終末期腎臟病的患病人數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，目前我國(guó)MHD 患者約63.2 萬(wàn)人[7]。睡眠障礙是困擾MHD 患者最突出的臨床問(wèn)題之一。睡眠障礙不僅造成MHD 患者虛弱、認(rèn)知功能障礙、生活質(zhì)量下降，還導(dǎo)致MHD 患者心血管疾病并發(fā)癥和病死率的增加，嚴(yán)重影響MHD 患者的預(yù)期壽命。

人體腸道中存在著種類繁多的微生物群，其中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)占整個(gè)菌群95%以上。此外還包括變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和梭桿菌門(mén)等[8]。這些微生物不僅直接參與了人體的多項(xiàng)生理活動(dòng)（如消化、免疫、內(nèi)分泌等），還對(duì)大腦發(fā)育、情緒和認(rèn)知功能具有多重影響[9]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可通過(guò)多種途徑影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，并影響睡眠過(guò)程[10-11]。機(jī)體睡眠障礙的發(fā)生亦與腸道菌群的失調(diào)相關(guān)[12]。本研究初步探討了睡眠障礙MHD 患者和非睡眠障礙MHD 患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，睡眠障礙組患者腸道菌群的α 多樣性高于非睡眠障礙組患者，并且兩組患者腸道菌群的β 多樣性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。α 多樣性分析是度量單個(gè)樣本內(nèi)有多少種微生物物種（豐富度），以及每個(gè)微生物物種所占的比例（均勻度），即關(guān)注樣本自身的菌群組成與分布。當(dāng)一個(gè)樣本中所含微生物物種種類越多，則它的豐富度越高，所含的每種微生物物種的占比越平均，則均勻度越高。β多樣性分析是度量不同樣本間菌群組成的相似度大小，即關(guān)注各樣本間的菌群組成差異。筆者推測(cè)，睡眠障礙MHD 患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，一些有害菌的增加可能導(dǎo)致了菌群豐富度增高。

通過(guò)LEfSe 多級(jí)物種差異判別分析，筆者發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非睡眠障礙MHD 患者，睡眠障礙MHD 患者腸道菌群中擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀氏菌屬、毛螺菌屬及鏈球菌屬的相對(duì)豐度顯著升高，而雙歧桿菌屬、乳桿菌屬及羅氏菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。動(dòng)物研究表明，睡眠質(zhì)量低下小鼠的腸道菌群中毛螺菌屬豐度增多，而乳桿菌屬豐度減少[13]。在人群中，失眠患者腸道菌群中擬桿菌屬和毛螺菌屬的豐度顯著高于健康人群，而能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的菌屬的豐度顯著降低[14]。作為腸道的有益菌，雙歧桿菌屬、乳桿菌屬及羅氏菌屬能夠合成SCFA，在結(jié)腸運(yùn)動(dòng)、免疫調(diào)節(jié)及抗炎方面發(fā)揮重要作用[15-17]。一項(xiàng)研究表明，腸道菌群產(chǎn)生的SCFA 能夠增加?jì)雰旱乃邥r(shí)間[18]。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬還能夠合成γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA），通過(guò)微生物-腸-腦軸，影響大腦功能。GABA 作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠緩解機(jī)體的焦慮行為，起到改善睡眠的作用。Spiegelhalder 等[19]亦證明GABA 水平低下能夠引起睡眠障礙。大腸桿菌-志賀氏菌屬歸屬于腸桿菌科。有研究者發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠進(jìn)行人為的睡眠剝奪后，其腸道內(nèi)腸桿菌科的豐度顯著升高[20]。鏈球菌屬是一種革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌，主要將葡萄糖分解代謝產(chǎn)生乳酸，可能會(huì)降低腸道pH 值，導(dǎo)致兼性厭氧菌和厭氧菌的豐度變化，改變腸道微生物代謝，還可以穿過(guò)血腦屏障導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[21]。研究表明，鏈球菌能夠?qū)е滤哒系K[22]，并且相較于腦卒中后非睡眠障礙患者，腦卒中后睡眠障礙患者腸道菌群中鏈球菌屬的豐度顯著升高[23]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，Parabacteroides、Barnesiella 為抑郁癥患者優(yōu)勢(shì)菌群[24-25]，產(chǎn)后抑郁患者在其抑郁情緒的緩解與Oribacterium 相對(duì)豐度減少相關(guān)[26]。睡眠障礙往往與焦慮、抑郁等情況相伴隨。本研究亦發(fā)現(xiàn)，睡眠障礙MHD 患者腸道菌群中Parabacteroides、Barnesiella 及Oribacterium 的相對(duì)豐度顯著增加。

綜上所述，睡眠障礙組MHD 患者腸道菌群的α多樣性高于非睡眠障礙組MHD 患者，兩組患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成存在差異。其中擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀氏菌屬、毛螺菌屬、鏈球菌屬、Parabacteroides、Barnesiella 及Oribacterium 是MHD 睡眠障礙患者腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬，可能與MHD 患者的睡眠障礙存在相關(guān)性。但本研究樣本量較小，也并未排除兩組患者的生活因素及飲食因素方面的影響，上述結(jié)論有待后續(xù)更多的大樣本研究明確。另外，本研究無(wú)法證實(shí)MHD 患者睡眠障礙與腸道菌群結(jié)構(gòu)改變之間的因果關(guān)系及相互作用機(jī)制，亦有待后續(xù)進(jìn)一步的研究探討，以期更好地為臨床治療和干預(yù)提供理論依據(jù)。