黃柯嘉 蔡心清 郭冰玉 張全根 張俊芳 韓兵社

摘 要：為研究抗氧化劑對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞冷凍保存效果的影響，在基礎(chǔ)冷凍保護(hù)液配方中分別添加褪黑素、谷胱甘肽和甜菜堿等3種抗氧化劑進(jìn)行了冷凍保存試驗(yàn)，比較冷凍后卵母細(xì)胞的活性氧（ROS）含量、總抗氧化能力（T-AOC）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量、琥珀酸脫氫酶（SDH）活性、凋亡基因表達(dá)水平和存活率。試驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過篩選，3種抗氧化劑的最優(yōu)添加濃度分別為褪黑素1×10-3 mol/L、谷胱甘肽5×10-4 mol/L、甜菜堿1×10-3 mol/L。與對(duì)照組相比，添加最優(yōu)濃度抗氧化劑的3個(gè)試驗(yàn)組（褪黑素組、谷胱甘肽組和甜菜堿組）的ROS含量均顯著降低，ATP含量和SDH活性均顯著提高，褪黑素組和甜菜堿組的T-AOC水平顯著提高（P＜0.05）；褪黑素組卵母細(xì)胞的caspase3、caspase9和bax基因表達(dá)量顯著降低，bcl-2基因表達(dá)量則顯著升高（P＜0.05）；谷胱甘肽組卵母細(xì)胞的caspase3基因表達(dá)量顯著下降，bcl-2基因表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）；甜菜堿組卵母細(xì)胞的caspase9和bax基因表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞在體外培育120 min，褪黑素組、谷胱甘肽組、甜菜堿組卵母細(xì)胞的存活率分別比對(duì)照組提高10.13%、14.20%和15.99%；冷凍保存1、7、30、60、90 d，3個(gè)試驗(yàn)組卵母細(xì)胞的存活率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；冷凍保存90 d，褪黑素組、谷胱甘肽組、甜菜堿組的存活率分別提高了9.05%、7.34%、6.68%。試驗(yàn)結(jié)果說明，在斑馬魚卵母細(xì)胞冷凍保存過程中添加1×10-3 mol/L褪黑素或5×10-4 mol/L谷胱甘肽或1×10-3 mol/L甜菜堿，均能夠增強(qiáng)冷凍保存后卵母細(xì)胞的線粒體功能，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，減少細(xì)胞凋亡，從而提高斑馬魚卵母細(xì)胞冷凍效率。

關(guān)鍵詞：冷凍保存；卵母細(xì)胞；斑馬魚；抗氧化劑；褪黑素；谷胱甘肽；甜菜堿

冷凍保存是在超低溫下長期保存生物配子的技術(shù)，可以減少遺傳漂變，保持活躍的繁殖群體，為保護(hù)種質(zhì)資源提供一種方案［1］。由于母體遺傳的存在，母本基因組在種質(zhì)資源保護(hù)中十分重要，卵母細(xì)胞的冷凍保存能夠提高物種的保護(hù)效率［2］。迄今，對(duì)卵母細(xì)胞冷凍保存的研究已開展了40多年，并已成功實(shí)現(xiàn)了人、小鼠、兔、牛、羊、豬等哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的冷凍保存［3］。對(duì)于魚類，目前研究者已對(duì)斑馬魚、鯉、鱘、彩虹魚、褐鱒、鯽等的卵巢組織或卵母細(xì)胞進(jìn)行了冷凍保存，但是由于魚類卵母細(xì)胞具有體積大、卵膜通透性差、卵黃含量多、對(duì)抗凍劑毒性敏感等特點(diǎn)，對(duì)魚類卵母細(xì)胞凍存的效果還不夠理想，保存方案的可重復(fù)較差［4］，再加上長期凍存研究數(shù)據(jù)的缺乏，卵母細(xì)胞的凍存方案亟待進(jìn)一步優(yōu)化。

冷凍保存過程中細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累是引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要原因［5］。近年來，在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞冷凍保存過程中會(huì)使用一些抗氧化劑，如褪黑素、白藜蘆醇、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、槲皮素和甜菜堿等來改善保存效果。褪黑素是一種高效的抗氧化劑，它可以清除細(xì)胞內(nèi)的自由基，提高抗氧化酶的活性，減少細(xì)胞的氧化損傷，維持卵膜的通透性，從而改善卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎發(fā)育歷程［6-7］。谷胱甘肽作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激中，其分子中的巰基能夠與活性氧自由基結(jié)合，將體內(nèi)的有害毒物進(jìn)行無害轉(zhuǎn)化［8］。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠卵母細(xì)胞玻璃化、升溫或體外成熟培養(yǎng)基中補(bǔ)充谷胱甘肽可以減少卵母細(xì)胞受到的冷凍損傷，提高受精卵的發(fā)育能力［9］。甜菜堿具備抗氧化特性，能夠抑制ROS的產(chǎn)生，并清除部分氧化自由基［10］。研究發(fā)現(xiàn)，含有甜菜堿的CaCO3微?？梢蕴岣哓埪雅菥€粒體的活性、降低活性氧從而提高存活率［11］。然而，目前有關(guān)抗氧化劑在魚類卵母細(xì)胞冷凍保存中的研究尚不多見。

斑馬魚（Danio rerio）是一種常見的熱帶觀賞魚，其個(gè)體小、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大，并且具有胚胎體外受精、體外發(fā)育、胚體透明等特點(diǎn)，是重要的脊椎動(dòng)物模式生物之一，也是開展水產(chǎn)動(dòng)物基礎(chǔ)技術(shù)研究的重要模式生物。本試驗(yàn)在冷凍過程中分別添加褪黑素、谷胱甘肽和甜菜堿等3種抗氧化劑，通過檢測斑馬魚卵母細(xì)胞的活性氧（ROS）含量、總抗氧化能力（T-AOC）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量、琥珀酸脫氫酶（SDH）活性、凋亡基因表達(dá)水平以及存活率的變化，分析抗氧化劑種類及其濃度對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞冷凍保存效果的影響，以期為魚類卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)的的優(yōu)化提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑（來源）：褪黑素、L-15培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），谷胱甘肽（上海泰坦科技股份有限公司），甜菜堿（源葉生物科技有限公司），三卡因、甲醇、二甲基亞砜（賽默飛公司），蔗糖（上海百研科技生物有限公司），ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，S0033S），增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，S0027），T-AOC檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，A015-3-1），SDH檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，A022-1-1），TransScript Uni All-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Remo-val）（北京全式金生物技術(shù)有限公司，AU341），Perfectstart? Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，AQ601）。

主要儀器：體視顯微鏡（蔡司Stemi 2000），熒光定量PCR儀器（羅氏LightCycler48）。

1.2 斑馬魚卵母細(xì)胞的采集

挑選性成熟（腹部飽滿）的雌性斑馬魚，用質(zhì)量濃度為168 mg/L的三卡因溶液麻醉后置于冰上，解剖取出其兩側(cè)的卵巢并轉(zhuǎn)移到L-15培養(yǎng)基中。用外科鑷將卵巢分散，再使用5 mL無菌巴氏吸管對(duì)卵母細(xì)胞輕輕吹打，分離出單個(gè)卵母細(xì)胞。使用L-15培養(yǎng)基清洗后，將卵母細(xì)胞放在培養(yǎng)基中待用。

1.3 冷凍保護(hù)劑的配制

冷凍保護(hù)劑的基礎(chǔ)配方為：1.5 mol/L甲醇+5.5 mol/L二甲基亞砜+0.5 mol/L蔗糖。根據(jù)文獻(xiàn)［9，11-12］，在基礎(chǔ)配方上分別添加褪黑素（0、1×10-3、1×10-5、1×10-7 mol/L）、谷胱甘肽（0、5×10-4、2×10-3、4×10-3 mol/L）和甜菜堿（0、1×10-3、1×10-4、1×10-5 mol/L）制備成含有不同濃度抗氧化劑的冷凍保護(hù)液。

預(yù)平衡溶液：1.5 mol/L甲醇+2.75 mol/L二甲基亞砜，稀釋液為90%的L-15培養(yǎng)基。

1.4 卵母細(xì)胞的冷凍與復(fù)蘇

將卵母細(xì)胞分裝進(jìn)2 mL凍存管中，加入500 μL預(yù)平衡溶液。室溫預(yù)平衡15 min后，將預(yù)平衡溶液吸出，分別加入各濃度的冷凍保護(hù)劑200 μL，靜置90 s后，放進(jìn)液氮中冷凍。24 h后，將凍存管從液氮中取出，迅速在28 ℃水浴條件下解凍30 s。待玻璃化液解凍后，迅速將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，采用三步平衡法，依次在1.00、0.50、0.25 mol/L的蔗糖溶液中分別平衡1、3、5 min，再用L-15培養(yǎng)基洗滌2～3遍。

1.5 斑馬魚卵母細(xì)胞存活率的檢測

將4種凍存方案的卵母細(xì)胞解凍，每種取5管重復(fù)，每管取出至少100顆卵母細(xì)胞，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色5 min。使用顯微鏡觀察、拍照、計(jì)數(shù)，其中被染色的卵母細(xì)胞判定為死細(xì)胞，未被染色的細(xì)胞為活細(xì)胞，根據(jù)以下公式計(jì)算存活率。

細(xì)胞存活率＝未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%（1）

1.6 斑馬魚卵母細(xì)胞ROS含量和T-AOC水平檢測

將4種凍存方案凍存的卵母細(xì)胞解凍，每種取3管重復(fù)，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶6加入預(yù)冷的0.5 mol/L Tris-HCl，進(jìn)行勻漿。在4 ℃下以 3 500 g 離心10 min，用預(yù)冷的PBS緩沖液將上清稀釋100倍，檢測總蛋白濃度。在白色不透光酶標(biāo)板的每個(gè)孔內(nèi)加入20 μL樣品，再加180 μL濃度為 10 μmol/L的DCFH-DA（ROS熒光探針），28 ℃孵育2 h。使用488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長進(jìn)行檢測，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ROS含量。

將4種凍存方案凍存的卵母細(xì)胞解凍，每種取3管重復(fù)，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶4加入PBS緩沖液，進(jìn)行勻漿。在4 ℃下以3 500 g 離心10 min，取上清，按照總蛋白（TP）和T-AOC檢測試劑盒說明書檢測T-AOC水平。

1.7 斑馬魚卵母細(xì)胞ATP和SDH水平檢測

將4種凍存方案凍存的卵母細(xì)胞解凍，每種取3管重復(fù)，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶6加入預(yù)冷的裂解液，進(jìn)行勻漿。在4 ℃下以12 000 g離心5 min，取上清待測。按照ATP、總蛋白定量（TP）試劑盒說明書檢測ATP含量。

將4種凍存方案凍存的卵母細(xì)胞解凍，每種取3管重復(fù)，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9加入預(yù)冷的PBS緩沖液，進(jìn)行勻漿。在4 ℃以2 500 g離心10 min，取上清待測。按照SDH、總蛋白定量（TP）試劑盒說明書檢測SDH活性。

1.8 凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測

將4種凍存方案凍存的卵母細(xì)胞解凍，每種取3管重復(fù)，采用TRIzol法提取斑馬魚卵母細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA后，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。在NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)凋亡相關(guān)基因引物（見表1）。以β-actin為內(nèi)參，用相對(duì)定量方法（2-△△Ct）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用SPSS Statistics 26.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素分析方法（one-way ANOVA）檢驗(yàn)分析不同組別之間的顯著差異性，設(shè)顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同抗氧化劑最優(yōu)濃度的篩選

由圖1可見，與對(duì)照組（未添加組）相比，褪黑素添加濃度為1×10-3、1×10-5和1×10-7 mol/L的試驗(yàn)組均可顯著提高卵母細(xì)胞的存活率（P＜0.05），3個(gè)組的存活率分別為（84.04±1.45）%、（84.30±4.01）%和（87.88±2.55）%，分別提高了6.58%、6.84%和10.42%，但3個(gè)組間差異不顯著（P＞0.05）。谷胱甘肽添加濃度5×10-4、2×10-3 mol/L的試驗(yàn)組均可顯著提高卵母細(xì)胞的存活率（P＜0.05），與對(duì)照組相比分別提高了8.48%和7.60%，其中5×10-4 mol/L組卵母細(xì)胞的存活率最高，為（89.18±4.70）%。添加濃度1×10-3 mol/L甜菜堿的試驗(yàn)組可顯著提高卵母細(xì)胞的存活率（P＜0.05），其存活率為（85.88±8.75）%，與對(duì)照組相比提高了11.16%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，上述3種抗氧化劑均可以提高凍存斑馬魚卵母細(xì)胞的存活率，其最優(yōu)添加濃度分別為褪黑素1×10-3 mol/L，谷胱甘肽5×10-4 mol/L，甜菜堿1×10-3 mol/L。

2.2 不同抗氧化劑對(duì)凍存卵母細(xì)胞ROS含量和T-AOC水平的影響

由圖2可見，與對(duì)照組相比，添加褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿這3種抗氧化劑均可顯著降低卵母細(xì)胞的ROS含量（P＜0.05），3個(gè)添加組的ROS含量分別為（111.86±2.76）、（112.58±2.93）、（88.11±9.04）RFU/μg，分別降低了13.72%、13.17%、31.27%。褪黑素和甜菜堿可以顯著提高卵母細(xì)胞的T-AOC水平（P＜0.05），其T-AOC分別為（0.129±0.009）、（0.133±0.016）mmol/L，與對(duì)照組相比分別提高約35.79%、40.00%。

2.3 抗氧化劑對(duì)凍存卵母細(xì)胞ATP含量和SDH活性的影響

由圖3可見，與對(duì)照組相比，添加褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿3種抗氧化劑均可顯著提高斑馬魚卵母細(xì)胞的ATP含量，其中褪黑素組的ATP含量最高（P＜0.05），3個(gè)添加組的ATP含量分別為（5 515.74±1 189.94）、（4 086.64.62±369.72）、（3 717.11±167.18）nmol/mg，分別比對(duì)照組提高了140.98%、78.54%、62.40%。褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿3種抗氧化劑均可顯著提高斑馬魚卵母細(xì)胞的SDH活性（P＜0.05），3個(gè)添加組的SDH活性分別為（14.70±0.89）、（15.44±0.10）、（13.64±0.27）U/mg，分別比對(duì)照組提高了20.39%、26.45%、11.71%。

2.4 抗氧化劑對(duì)凍存卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖4可見，與對(duì)照組相比，褪黑素組斑馬魚卵母細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因caspase3、caspase9和bax的表達(dá)量顯著下降，bcl-2表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）；谷胱甘肽組斑馬魚卵母細(xì)胞的凋亡基因caspase3表達(dá)量顯著下降，bcl-2表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）；甜菜堿組斑馬魚卵母細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因caspase9和bax的表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。

2.5 抗氧化劑對(duì)復(fù)蘇后卵母細(xì)胞體外培育過程中存活率的影響

由圖5可見，復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞在體外培育30 min，褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿添加組卵母細(xì)胞的存活率分別為（76.02±1.28）%、（75.69±1.58）%、（76.35±3.57）%，3個(gè)添加組之間沒有顯著差異（P＞0.05）；體外培育60 min后，谷胱甘肽、甜菜堿組卵母細(xì)胞的存活率分別為（72.62±3.32）%、（73.28±1.88）%，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別比對(duì)照組提高了5.26%、5.92%；體外培育120 min后，褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿添加組卵母細(xì)胞的存活率分別為（43.37±4.59）%、（47.44±3.00）%、（49.23±3.31）%，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別比對(duì)照組提高了10.13%、14.20%、15.99%。

2.6 抗氧化劑對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞長期凍存存活率的影響

由圖6可見，與對(duì)照組相比，添加褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿均可顯著提高玻璃化凍存1 d、7 d、30 d、60 d、90 d后的卵母細(xì)胞的存活率（P＜0.05）。凍存1 d后，褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿組卵母細(xì)胞的存活率分別為（89.32±0.62）%、（89.19±1.93）%、（89.20±1.29）%，分別提高了4.98%、4.85%、4.86%；凍存7 d后，上述3組的存活率分別為（78.60±0.51）%、（74.37±2.95）%、（76.18±2.94）%，分別提高了16.54%、12.31%、14.12%；凍存30 d后，上述3組的存活率分別為（56.60±5.19）%、（58.58±4.07）%、（60.55±0.51）%，分別提高了7.88%、9.86%、11.83%；凍存60 d后，上述3組的存活率分別為（48.74±3.37）%、（46.00±4.59）%、（48.42±4.16）%，分別提高了10.18%、7.44%、9.86%；凍存90 d后，上述3組的存活率分別為（34.66±2.47）%、（32.95±3.59）%、（32.29±2.89）%，分別提高了9.05%、7.34%、6.68%。

3 討論

褪黑素、谷胱甘肽和甜菜堿等抗氧化劑已在人、小鼠、水貂、豬、貓等動(dòng)物配子的冷凍保存中得到應(yīng)用，但在魚類卵母細(xì)胞冷凍保存研究中尚未見相關(guān)報(bào)道［3，6-11］。本試驗(yàn)在斑馬魚卵母細(xì)胞冷凍保存和體外培育過程中分別添加1×10-3 mol/L的褪黑素、5×10-4 mol/L的谷胱甘肽和1×10-3 mol/L的甜菜堿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種濃度的抗氧化劑均可顯著提高復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞在體外培育120 min和長期凍存1、7、30、60、90 d的存活率。試驗(yàn)結(jié)果說明，在魚類卵母細(xì)胞冷凍保存過程中加入抗氧化劑同樣能改善保存效果，該方法在魚類卵母細(xì)胞冷凍保存中具有應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在冷凍保存過程中分別添加褪黑素、谷胱甘肽或甜菜堿可以顯著降低卵母細(xì)胞的ROS含量；褪黑素和甜菜堿組斑馬魚卵母細(xì)胞的T-AOC水平顯著升高。以上結(jié)果與褪黑素用于人卵母細(xì)胞冷凍保存［7］和甜菜堿用于貓卵泡冷凍保存［11］中的研究結(jié)果相一致。這說明上述抗氧化劑可以清除細(xì)胞內(nèi)的自由基，提高抗氧化酶的活性，對(duì)降低冷凍引起的卵母細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在冷凍保存過程中添加褪黑素、谷胱甘肽或甜菜堿可以顯著提高斑馬魚卵母細(xì)胞的ATP含量和SDH活性。線粒體數(shù)量減少和活性降低會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育障礙，影響其成熟、受精及早期胚胎發(fā)育，而線粒體的功能通?？梢杂葾TP含量和SDH活性來反映［13-14］。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠GV卵母細(xì)胞和人卵母細(xì)胞冷凍保存過程中加入褪黑素，能夠保護(hù)線粒體功能，提高ATP含量［15-16］。本研究結(jié)果表明，在魚類卵母細(xì)胞凍存中，添加褪黑素等抗氧化劑均可以增強(qiáng)其線粒體功能，促進(jìn)ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而提高凍存效率。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在冷凍保存過程中添加褪黑素、谷胱甘肽后，卵母細(xì)胞的caspase3表達(dá)量顯著降低；添加褪黑素、甜菜堿后，caspase9表達(dá)量顯著降低；添加褪黑素、甜菜堿后，bax表達(dá)量顯著降低；添加褪黑素、谷胱甘肽后，bcl-2表達(dá)量顯著提高。上述結(jié)果與Shirzeyli等［17］在冷凍保存中添加抗氧化劑可以降低bax/bcl-2比率和caspase3的mRNA相對(duì)表達(dá)量、降低細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。有研究表明，冷凍損傷會(huì)對(duì)線粒體功能造成負(fù)面影響，并且啟動(dòng)相關(guān)凋亡通路，線粒體損傷能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］。線粒體在細(xì)胞凋亡中通過釋放caspases激活因子，使caspase活化，最終使蛋白質(zhì)裂解和細(xì)胞解體死亡［19］，同時(shí)，BCL-2家族蛋白，包括抗凋亡bcl-2成員和促凋亡bax成員等通過相互作用來調(diào)節(jié)線粒體的外膜通透性，控制線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放的細(xì)胞死亡信號(hào)分子［20］。本試驗(yàn)表明，所用的3種抗氧化劑可改善線粒體功能，減少細(xì)胞凋亡，與添加3種抗氧化劑后斑馬魚卵母細(xì)胞ATP含量上升的試驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，在冷凍保存和體外培育斑馬魚卵母細(xì)胞時(shí)，在基礎(chǔ)冷凍保護(hù)液配方中添加1×10-3 mol/L的褪黑素或5×10-4mol/L的谷胱甘肽或1×10-3 mol/L的甜菜堿，能減少細(xì)胞氧化損傷，改善線粒體功能，降低細(xì)胞凋亡水平，從而提升卵母細(xì)胞的存活率。上述3種抗氧化劑均可提高斑馬魚卵母細(xì)胞冷凍保存的存活率，且三者的存活率較為接近。抗氧化相關(guān)指標(biāo)顯示，甜菜堿表現(xiàn)出最佳的抗氧化效果；線粒體功能相關(guān)指標(biāo)顯示，褪黑素對(duì)于卵母細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用最為明顯。綜合來看，3種抗氧化劑可能通過不同的機(jī)制對(duì)斑馬魚卵母細(xì)胞的冷凍保存起到了改善作用。本研究揭示了褪黑素、谷胱甘肽、甜菜堿作為魚類卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的可能性，為卵母細(xì)胞的冷凍保存提供了新的思路。

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Comparison of the effects of three antioxidants on the cryopreservation of zebrafish oocytes

HUANG Kejia ， CAI Xinqing ， GUO Bingyu ， ZHANG Quangen3， ZHANG Junfang ， HAN Bingshe

（1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，

Ministry of Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;

2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries

Science Education，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;

3. Shanghai Dianyuan Aquatic Seed Farm，Shanghai 201722，China）

Abstract： To investigate the effects of antioxidants on the cryopreservation of zebrafish oocytes，melatonin，glutathione and betaine were added to the basic cryoprotective solution in this study.The antioxidant capacity，mitochondrial function，expression of apoptosis-related genes and survival rate were tested.The results showed that the optimal concentration of the three antioxidants were melatonin 1×10-3 mol/L，glutathione 5×10-4 mol/L，and betaine 1×10-3 mol/L.ATP content and SDH activity were significantly increased in the three experimental groups（melatonin group，glutathione group and betaine group） supplemented with the optimal concentration of antioxidants，while ROS content was significantly decreased（P<0.05）.The level of T-AOC in betaine and melatonin groups significantly increased（P<0.05）.The expression of caspase3，caspase9 and bax genes in melatonin group significantly decreased，while the expression of bcl-2 significantly increased（P＜0.05）.The expression of caspase3 in glutathione group was significantly decreased，while the expression of bcl-2 was significantly increased.The expression of caspase9 and bax in betaine group was significantly decreased.The survival rate of oocytes in melatonin，glutathione and betaine groups increased by 10.13%，14.20% and 15.99%，respectively after 120 min vitro incubation.After 1，7，30，60 and 90 days of cryopreservation，the survival rate of oocytes in three experimental groups were significantly higher than that of the control group.After 90 days of cryopreservation，the survival rate was increased by 9.05%，7.34% and 6.68%，respectively.The results indicated that the addition of antioxidants melatonin，glutathione and betaine during zebrafish oocyte cryopreservation could protect mitochondrial function，reduce oxidative damage and cell apoptosis，and improve the quality of zebrafish oocytes.

Key words： cryopreservation; oocyte; zebrafish; antioxidant; melatonin; glutathione; betaine