胡麗君,李佳慧,翟艷玲

(青島大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266071)

0 引言

過氧化氫(H2O2)是一種常見的氧化劑,可參與許多化學(xué)、生物、制藥、臨床和環(huán)境過程[1-3]。H2O2是氧的一種不完全還原代謝物,在活細(xì)胞內(nèi)具有多種生理和病理作用[4]。因此,為了更好地了解H2O2的生物學(xué)效應(yīng),開展生物環(huán)境中H2O2的快速、靈敏、準(zhǔn)確的測定至關(guān)重要。目前對(duì)生化分析中H2O2的濃度的幾種測定方法有液相色譜[5]、化學(xué)發(fā)光[6]、熒光[7-9]、電化學(xué)技術(shù)[10]和比色法[11-13]等。這些分析技術(shù)中,比色法以其簡單、成本低、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。此外,比色法檢測分析物可通過肉眼觀察,無需任何儀器即可實(shí)現(xiàn)目視檢測[14]。大多數(shù)情況下,H2O2的比色檢測是基于酶促反應(yīng)中辣根過氧化物酶的催化活性[15]。過氧化物酶是最先進(jìn)的生物催化劑,它通過2H+/2e-轉(zhuǎn)化過程催化H2O2還原為H2O[16]。它們的活性位點(diǎn)是五配位血紅素系統(tǒng),包括一個(gè)組氨酸殘基作為軸向配體和一個(gè)卟啉輔助因子[17]。過氧化物酶獨(dú)特的幾何/電子結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)催化活性和選擇性方面起著關(guān)鍵作用[18]。然而,天然酶成本高、難回收、易失活等缺點(diǎn)限制了其實(shí)際應(yīng)用[19]。

在過去的幾年中,得益于納米技術(shù)、生物技術(shù)、催化科學(xué)和計(jì)算設(shè)計(jì)的快速發(fā)展,在用高性能納米材料模擬新的酶活性、調(diào)節(jié)納米酶活性、闡明催化機(jī)制和擴(kuò)大潛在應(yīng)用方面取得了重大進(jìn)展[16]。與傳統(tǒng)的類似酶相比,納米酶具有催化效率高、耐熱、耐酸堿穩(wěn)定性好、制備規(guī)模大、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。這些特點(diǎn)不僅彌補(bǔ)了天然酶昂貴、不穩(wěn)定的缺點(diǎn),也克服了以往類似酶催化效率低的問題[20],其中具有原子分散金屬位點(diǎn)的單原子納米酶可以模擬酶的活性中心。基于最大的原子利用效率和強(qiáng)的金屬負(fù)載相互作用,單原子納米酶的催化活性和選擇性顯著高于傳統(tǒng)的納米材料。此外,明確定義的活性金屬位點(diǎn)有利于深入理解構(gòu)效關(guān)系,這為在原子尺度上合理設(shè)計(jì)先進(jìn)的類酶催化劑提供了潛在的指導(dǎo)。因此,納米酶具有廣泛應(yīng)用的潛力,相關(guān)的應(yīng)用研究也在不斷引起關(guān)注[21]。此外,納米級(jí)材料具有獨(dú)特的納米級(jí)尺寸[22]、大的比表面積,可與其他物種結(jié)合用于生物識(shí)別。因此,基于比色法開發(fā)有效的模擬酶對(duì)于生物傳感和制藥過程具有重要意義。

本研究采用硬模板法合成了具有分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的Fe-N-C單原子納米酶,與不含F(xiàn)e的NC納米酶相比[23],Fe-N-C納米酶具有高效的過氧化物酶活性。所制備的Fe-N-C單原子納米酶具有良好的分散性和穩(wěn)定性。以Fe-N-C單原子納米酶作為過氧化物酶模擬物,開發(fā)了H2O2的比色檢測方法?；诤唵蜦e-N-C單原子納米酶的比色平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的高靈敏檢測,表明本工作所發(fā)展的Fe-N-C單原子納米酶在生物催化和生物分析方面具有很大的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及材料

3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和葡萄糖氧化酶(GOX)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化鋅(ZnCl2)、醋酸(HAc)、乙酸鈉(NaAc)、H2O2、四水氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)、氫氟酸(HF)、乙醇、氫氧化鈉(NaOH)均購自國藥化學(xué)試劑有限公司;膠體二氧化硅懸濁液購自默克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

通過冷凍干燥和煅燒進(jìn)行樣品的制備,將含有氨基葡萄糖鹽酸鹽(2 g)、ZnCl2(334 g)、FeCl2·4H2O(150 mg)、膠體二氧化硅懸浮液(5 mL,2 g SiO2)充分混合攪拌至均勻。然后,將溶液冷凍干燥得到Fe@SiO2粉末。在N2條件下加熱到900 ℃并保溫2 h。最后,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HF水溶液以及去離子水洗滌所得樣品,經(jīng)離心干燥得到Fe-N-C納米酶。為了對(duì)比,在同樣條件下不添加FeCl2·4H2O合成了N摻雜碳基納米酶,即NC納米酶[23]。

1.3 Fe-N-C納米酶的過氧化物酶活性和動(dòng)力學(xué)測定

1.4 材料表征和測試

用X射線衍射儀(XRD,D8 DISCOVER,德國布魯克)表征材料的物相組成。用日本電子株式會(huì)社的掃描電子顯微鏡(SEM,JSM-6010plus/LA)和透射電子顯微鏡(TEM,JEM-1400)表征材料微觀形貌;用X射線光電子能譜儀(XPS,Thermo ESCALAB 250XI,美國賽默飛世爾科技公司)表征材料的無毒組成和價(jià)態(tài)。

電化學(xué)測試使用傳統(tǒng)的三電極體系,電化學(xué)工作站的型號(hào)為CHI 660E(上海辰華)。電解液為0.1 mol/L N2飽和PBS(pH=7.4)溶液,參比電極為Ag/AgCl電極(飽和KCl溶液),對(duì)電極為碳棒,工作電極為制備的Fe-N-C納米酶[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌與結(jié)構(gòu)表征

使用日本電子株式會(huì)社JEM-1400透射電子顯微鏡對(duì)制備的Fe-N-C納米片進(jìn)行TEM和HRTEM表征。如圖1(a, b)所示,在TEM圖像中觀察到制備好的Fe-N-C樣品具有良好的多孔納米結(jié)構(gòu)以及豐富的褶皺形貌。圖1(c)是在像差校正的高角度環(huán)形暗場掃描TEM (AC-HAADFSTEM)圖像,可以識(shí)別出明亮和孤立的金屬原子,證實(shí)了單個(gè)鐵原子在Fe-N-C納米酶上的原子分散[23]。

圖1 Fe-N-C的(a)TEM圖像、(b)高分辨TEM圖像和(c)球差校正高分辨透射電子顯微鏡圖

通過XPS譜研究Fe-N-C的元素組成以及價(jià)態(tài)。如圖2(a)所示,Fe-N-C具有明顯的Fe特征峰,但是該Fe特征峰未在NC中出現(xiàn)。如圖2(b)所示,從Fe 2p的高分辨XPS譜圖分析可以得知,在711.3 eV和724.5 eV處的兩個(gè)峰,分別對(duì)應(yīng)Fe 2p3/2和Fe 2p1/2。此外,Fe 2P的XPS譜圖中還存在Fe2+2p3/2(710.8 eV),Fe3+2p3/2(714.2 eV),Fe2+2p1/2(273.2 eV)和Fe3+2p1/2(725.9 eV),這說明Fe-N-C材料中的同時(shí)存在Fe2+和Fe3+[25]。通過高分辨率N 1s譜來識(shí)別Fe-N-C中N的摻雜類型,如圖2(c)所示,397.9、398.5、399.1、400.1、403.3處的峰分別對(duì)應(yīng)于吡啶-N、FeNx、吡咯-N、石墨-N、氧化-N。從XPS譜圖可以看出Fe-N-C具有明顯的FeNx部分[26-28],說明Fe可以通過與芳香N絡(luò)合從而以單原子形式分散,原子利用率高、活性位點(diǎn)明確。從圖2(d)所示的C 1s譜中可明顯看出,納米酶Fe-N-C含有較多的sp3-C成分,這說明Fe-N-C的結(jié)構(gòu)中存在較多缺陷[29],反應(yīng)接觸面積大。

圖2 (a)Fe-N-C的XPS譜圖和Fe-N-C中(b)Fe 2p、(c)N 1s和(d)C 1s的譜圖

圖3為Fe-N-C和N-C的XRD譜圖。通過對(duì)比碳的XRD衍射卡片(JCPDS No. 26-1076),可以得到Fe-N-C的XRD圖譜中25°的衍射峰歸屬于石墨碳的(002)晶面。未觀察到鐵基納米顆粒相關(guān)的衍射峰,進(jìn)一步驗(yàn)證了Fe-N-C納米酶結(jié)構(gòu)中的Fe以單原子形式存在[30]。

圖3 Fe-N-C和N-C的XRD譜圖

2.2 比色法檢測H2O2

表1 Fe-N-C納米酶和NC納米酶對(duì)H2O2、TMB的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)結(jié)果

圖4 (a)Fe-N-C納米酶在不同濃度的H2O2中對(duì)TMB進(jìn)行氧化得到的紫外-可見吸收光譜以及(b)相應(yīng)校準(zhǔn)曲線; (c) Fe-N-C納米酶和HRP的耐溫性能;(d)Fe-N-C納米酶和HRP在1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH孵育1 h后的過氧化物酶活性比較;(e)Fe-N-C納米酶對(duì)不同底物的響應(yīng),五次實(shí)驗(yàn)平均值;(f)Fe-N-C納米酶的循環(huán)使用穩(wěn)定性

2.3 電化學(xué)檢測H2O2

圖5 (a)不同濃度H2O2存在時(shí)Fe-N-C和N-C納米酶的循環(huán)伏安曲線;(b)在-0.15 V下,i-t曲線; Fe-N-C和NC對(duì)不同濃度H2O2的安培響應(yīng);(c)-0.15 V時(shí),對(duì)Fe-N-C納米酶連續(xù)加入H2O2的安培響應(yīng)

3 結(jié)論

采用二氧化硅模板法合成了具有多孔結(jié)構(gòu)的Fe-N-C單原子納米酶,并且與對(duì)照樣品NC納米酶各自對(duì)H2O2進(jìn)行比色檢測。在檢測H2O2中,Fe-N-C納米酶催化H2O2氧化TMB的產(chǎn)生的吸光度與H2O2濃度之間存在較好的線性相關(guān)性。除此之外,作為一種概念應(yīng)用,將基于Fe-N-C的傳感器用于對(duì)H2O2的靈敏電化學(xué)檢測,在生物傳感器應(yīng)用中具有較好的應(yīng)用前景。