周立飛，鄭琳璐，李林青，王文藝，李建磊，，張萍萍，孫艷美，李亞麗*

(1.河北省人民醫(yī)院生殖遺傳科,石家莊 050000;2.華北理工大學(xué)研究生學(xué)院,唐山 063210;3.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院,張家口 075000;4.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,石家莊 050000)

卵巢儲(chǔ)備功能減退(DOR)作為女性最常見的不孕癥之一,通常是由于卵巢儲(chǔ)備功能下降導(dǎo)致的治療周期取消率高和受精率低[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),DOR在年輕女性中的發(fā)病率為10%,并且在不孕婦女中所占比例逐年增加,是造成女性不孕癥的重要原因之一,但DOR的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確,可能與年齡、遺傳因素、自身免疫因素、醫(yī)源性(手術(shù)、放療、化療)等有關(guān)[2]。DOR主要以卵泡發(fā)育成優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的潛能下降為特征,臨床主要表現(xiàn)為不孕、月經(jīng)不調(diào)、圍絕經(jīng)期綜合征和受精能力減弱等,因其卵巢對(duì)外源促性腺激素的反應(yīng)力低和妊娠丟失率高的特點(diǎn)是女性生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。目前對(duì)DOR的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：周期第2～5天卵泡刺激素(FSH)>10 U/L,抗苗勒管激素(AMH)水平<0.5～1.1 ng/ml,或小于5個(gè)2～10 mm的早期竇狀卵泡[3]。近年來(lái)隨著技術(shù)的發(fā)展,基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)DOR的發(fā)病機(jī)制研究中取得了一定的進(jìn)展,疾病的發(fā)生與發(fā)展是動(dòng)態(tài)變化的?，F(xiàn)就近年來(lái)有關(guān)DOR病因?qū)W的研究進(jìn)行綜述,以期為早期診斷、干預(yù)和治療DOR患者提供新思路。

一、與DOR發(fā)生相關(guān)的基因

1.FMR1基因：FMR1基因位于性染色體Xq27.3上,其5′端UTR區(qū)(CGG)n的重復(fù)數(shù)在前突變(50～200)的個(gè)體患DOR的風(fēng)險(xiǎn)增加,主要是未被翻譯的mRNA與其相關(guān)蛋白形成包涵體的蓄積會(huì)影響女性的卵巢功能。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在性腺中高度表達(dá)的多功能RNA結(jié)合蛋白Sam68在顆粒細(xì)胞中被隔離,很可能是通過(guò)與擴(kuò)增的CGG重復(fù)轉(zhuǎn)錄物的相互作用導(dǎo)致可用于卵泡刺激素受體(FSHR)前體轉(zhuǎn)錄物加工的游離Sam68減少,引起FSHR轉(zhuǎn)錄物成熟的失調(diào),從而導(dǎo)致卵巢對(duì)FSH刺激反應(yīng)性降低[2,4-5]。FMR1的基因突變與卵巢功能障礙相關(guān),一般通常為月經(jīng)規(guī)律、卵巢儲(chǔ)備功能下降、卵泡數(shù)量減少、生育力減退[4]。FMR1重復(fù)序列的分布因種族而有差異,西方國(guó)家DOR患者中攜帶FMR1前突變的患者較多,然而在亞洲國(guó)家攜帶者較少。在一項(xiàng)關(guān)于DOR女性的AMH水平與FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)的研究中,證實(shí)在DOR的患者中,似乎FMR1基因CGG重復(fù)數(shù)≥35次女性的AMH隨年齡的增長(zhǎng)比CGG重復(fù)數(shù)<35次者下降得更快[2,4]。這種基因檢測(cè)方法可能未來(lái)會(huì)被應(yīng)用于識(shí)別DOR患者,為未來(lái)預(yù)防和治療DOR提供新思路。

2.HFM1基因：HFM1基因是卵巢早衰(POF)的候選基因,也被稱為POF9,位于染色體1q22,由39個(gè)外顯子組成,編碼在生殖系細(xì)胞中特異表達(dá)的減數(shù)分裂解旋酶1(HFM1),最早在卵巢早衰(POF)患者中報(bào)道。有研究者在一個(gè)有DOR且體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠結(jié)局差的家系中發(fā)現(xiàn)了HFM1基因的兩種新的復(fù)合雜合子剪接變異[6]。在一項(xiàng)特異性敲除小鼠卵母細(xì)胞中HFM1的研究中,證實(shí)了HFM1基因?qū)π∈舐殉猜雅輧?chǔ)備耗竭和生育力的作用,特別是在被敲除的小鼠卵母細(xì)胞中容易觀察到異常紡錘體、染色體排列不齊、皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白帽丟失、小鼠卵巢卵泡儲(chǔ)備耗竭加速和極體排出失敗的現(xiàn)象,進(jìn)一步的研究表明,HFM1可能參與MAPK信號(hào)通路調(diào)控紡錘體遷移和不對(duì)稱分裂[7]。更重要的是,一項(xiàng)通過(guò)植入前遺傳學(xué)檢測(cè)評(píng)估整倍體率的研究顯示,與卵巢儲(chǔ)備正常(NOR)不孕婦女相比,DOR女性的非整倍體胚胎百分比升高23 %,這也是導(dǎo)致胚胎停滯的原因之一[8]。

3.GREM1基因：GREM1是生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)的下游基因,由卵巢顆粒細(xì)胞(GCs)分泌,是在卵泡發(fā)育信號(hào)通路中發(fā)揮交互作用的重要調(diào)節(jié)分子,位于染色體15q13-15q15,由2個(gè)外顯子及1個(gè)內(nèi)含子組成[9]。最早被確定為骨形態(tài)發(fā)生蛋白的拮抗劑在惡性腫瘤中報(bào)道,通常會(huì)因啟動(dòng)子高甲基化而沉默,參與多種腫瘤的進(jìn)展,其中在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)GREM1上調(diào),誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。GREM1參與調(diào)節(jié)與胚胎發(fā)育相關(guān)的GDF9和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)的平衡,GDF9、BMP15和BMP6目前被認(rèn)為是負(fù)責(zé)排卵期間卵丘GCs擴(kuò)增的卵母細(xì)胞調(diào)控的最佳候選分子,這對(duì)于體內(nèi)正常卵母細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮重要的作用[11]。為了研究GREM1是否參與DOR的發(fā)病及多卵巢GCs的影響,研究者在年輕DOR女性的卵丘細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GREM1基因表達(dá)下調(diào)[12]。隨后研究者證實(shí)了GREM1通過(guò)調(diào)節(jié)GCs擴(kuò)展過(guò)程影響卵泡發(fā)育和卵巢儲(chǔ)備功能,GCs擴(kuò)展相關(guān)基因的表達(dá)隨著外源性GREM1蛋白濃度的增加而提高,且有濃度依賴性[9,12]。雖然因果關(guān)系尚不清楚,但這些觀察結(jié)果可能反映了GDF9或其他卵丘生理學(xué)卵母細(xì)胞分泌介質(zhì)的潛在缺陷,值得進(jìn)一步挖掘研究。GREM1基因可能為未來(lái)預(yù)防和治療DOR提供新的靶點(diǎn)。

因此FMR1、HFM1、GREM1基因與女性生殖和DOR密切相關(guān),但具體相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步挖掘。最近,通過(guò)全外顯子測(cè)序技術(shù)在POF家族中確定了一系列新基因包括STAG3、GDF9、MCM8、SGO2和NUP107[13]。有關(guān)DOR遺傳因素的研究雖取得了一定的進(jìn)展,但相關(guān)機(jī)制仍不清楚,目前仍有一些候選基因有待發(fā)現(xiàn),需開展更為深入的研究和探索。

二、與DOR發(fā)生相關(guān)的RNA

1.長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)：是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)氨基酸但不編碼蛋白質(zhì)的在人類生理、病理調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用的功能性RNA分子,其中一些lncRNA被確定在卵泡的形成和發(fā)育中起著重要的作用[14]。在一項(xiàng)病例對(duì)照研究中,通過(guò)收集、檢測(cè)DOR與NOR不孕患者GCs中的lncRNA,篩選出與DOR相關(guān)的466個(gè)差異表達(dá)的lncRNA,其中有244個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào),222個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)的lncRNA與細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)消化吸收、胚胎發(fā)育和甲狀腺激素信號(hào)通路等有關(guān),與DOR疾病的發(fā)展密切相關(guān)[15]。但這些lncRNA如何調(diào)控DOR的機(jī)制尚不清楚,還需要進(jìn)一步反復(fù)研究和驗(yàn)證。

2.微小RNA(miRNA)：miRNA是由22～24個(gè)核苷酸組成的一類小的非編碼RNA,在細(xì)胞增殖和卵泡發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用,廣泛參與正常和疾病狀態(tài)[16]。最近在DOR與NOR患者GCs差異表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn),DOR婦女GCs中miR-484水平升高,并伴有人類GCs中Yes相關(guān)蛋白亞型1(YAP 1)水平降低和人類GCs功能受損以及miR-484在GCs中的表達(dá)水平與基礎(chǔ)FSH水平呈正相關(guān);隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用si-YAP1轉(zhuǎn)染的GCs呈現(xiàn)出更高的氧化應(yīng)激損傷以及早期和晚期凋亡細(xì)胞百分比增加,這些結(jié)果與過(guò)表達(dá)miR-484的GCs的表型一致;推測(cè)YAP 1是miR-484在GCs中的直接靶點(diǎn),miR-484通過(guò)YAP 1介導(dǎo)的線粒體功能和凋亡調(diào)節(jié)GCs功能,從而降低卵巢儲(chǔ)備功能[17]。呂清媛等[18]在卵巢儲(chǔ)備功能異常(DOR、POF)患者血漿差異表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn),miR-15b、miR-22的表達(dá)顯著下降,二者可能與DOR的病情發(fā)展有著密切的聯(lián)系,但在卵巢病理、生理中的機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步深入分析。Wei等[19]研究中發(fā)現(xiàn)DOR的高齡女性miR-221-3p的表達(dá)顯著低于NOR的年輕女性,隨后實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明了FOXO1是miR-221-3p的直接靶基因,miR-221-3p的下調(diào)可能上調(diào)FOXO1表達(dá),通過(guò)促進(jìn)卵巢GCs凋亡而促進(jìn)DOR的發(fā)病機(jī)制。此外,miRNA還通過(guò)影響GCs在女性生殖系統(tǒng)疾病如多囊卵巢綜合征(PCOS)和卵巢早衰(POF)中發(fā)揮重要作用,系統(tǒng)地鑒定GC特異性miRNA將有助于研究者更好地了解卵巢疾病相關(guān)的潛在機(jī)制,從而為進(jìn)一步研究GCs和卵泡的功能奠定基礎(chǔ)。

外泌體是直徑約30～150 nm由多種細(xì)胞分泌的,在免疫應(yīng)答、胞間通訊、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞間物質(zhì)交換中發(fā)揮巨大作用的膜性囊泡[20]。一項(xiàng)通過(guò)研究DOR患者和NOR患者的卵泡液外泌體miRNA的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn),與NOR組相比,DOR患者卵泡液中存在80個(gè)有明顯表達(dá)差異的miRNA,其中hsa-miR-4792、hsa-miR-184等31個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào),hsa-miR-136-3p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-335-5p等49個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào),其對(duì)相關(guān)靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)與脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路和卵泡或卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)通路有關(guān)[21]。因此我們推斷外泌體miRNA通過(guò)與靶基因靶向結(jié)合在DOR中發(fā)揮著重要作用,但其涉及的生物學(xué)通路需要進(jìn)一步深入研究。

三、與DOR發(fā)生相關(guān)的代謝組學(xué)研究

氧化應(yīng)激是DOR患者生育力下降的主要原因之一。卵泡液是卵母細(xì)胞的微環(huán)境,在卵母細(xì)胞的成熟及胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。

有研究者比較了DOR患者與正常婦女卵泡液中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的差異表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物主要富集在膽堿代謝、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染和葉酸生物合成中[22];另有研究發(fā)現(xiàn)DOR組脂肪酸、2-羥色酮、孕酮-3-葡萄糖醛酸苷的表達(dá)顯著降低,2-羥雌酮是雌激素及其衍生物的有機(jī)化合物,存在于所有脊椎動(dòng)物中,具有刺激細(xì)胞生長(zhǎng),并阻斷可能致癌的更強(qiáng)雌激素的作用[23-25];還有研究比較了DOR與NOR卵泡液中的氧化脂質(zhì)差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOR患者卵泡液中有15種氧脂素代謝產(chǎn)物含量低于NOR組,這些差異氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物中有9種與獲卵數(shù)和受精率有關(guān),有8種與FSH水平呈負(fù)相關(guān),有1種與優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(guān),但均與花生四烯酸代謝途徑密切相關(guān)[24],研究者由此認(rèn)為在這些氧脂素代謝物中,花生四烯酸代謝發(fā)生了可能與卵母細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的顯著變化,導(dǎo)致DOR患者生育能力下降。何瑞芬等[26]采用非靶向代謝組學(xué)分析技術(shù)對(duì)18例DOR患者和18例NOR患者的卵巢GCs進(jìn)行了代謝組學(xué)研究,鑒定出的差異代謝物與炎癥反應(yīng)和類固醇物質(zhì)有關(guān),可影響類固醇合成通路,進(jìn)而引起類固醇物質(zhì)合成豐度下降,從代謝水平闡明了類固醇激素對(duì)疾病的相關(guān)性。

脂質(zhì)代謝物的發(fā)現(xiàn)為DOR的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索,為反復(fù)移植失敗患者卵泡液中的代謝變化提供了新的檢測(cè)途徑和治療靶點(diǎn)。

四、與DOR發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1.血液蛋白質(zhì)組學(xué)：一項(xiàng)確定非肥胖DOR患者血清視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)濃度與卵巢儲(chǔ)備之間關(guān)系的橫向研究中,發(fā)現(xiàn)了DOR患者血清RBP4水平降低,血清hs-CRP水平升高,而且血清RBP4水平與AMH水平呈正相關(guān)[27],因此得出了氧化應(yīng)激在DOR中起作用的事實(shí),維生素A參與了DOR患者卵巢儲(chǔ)備的恢復(fù)的可能性,為卵巢儲(chǔ)備調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制提供了新的見解。

2.卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)：卵泡液中含有生物活性分子影響著卵母細(xì)胞質(zhì)量、受精和胚胎發(fā)育。卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究描繪了一種新的分子生化過(guò)程,在描述生物標(biāo)志物的輪廓方面具有重要影響,為分析人類卵泡液提供了一種新思路,可用于卵母細(xì)胞質(zhì)量評(píng)估和改善體外受精-胚胎移植技術(shù)結(jié)局[28]。

在一項(xiàng)卵巢低反應(yīng)性蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究中,發(fā)現(xiàn)了66種差異表達(dá)蛋白下調(diào)、65種差異蛋白上調(diào),其中3種蛋白質(zhì)(妊娠區(qū)蛋白、腎素和含sushi重復(fù)蛋白SRPX)的差異表達(dá)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[29];隨后有研究還發(fā)現(xiàn)了卵巢低反應(yīng)組的血管生長(zhǎng)因子表達(dá)增加,但卵泡液中血管生長(zhǎng)因子的水平與胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)[30]。有研究者分析了DOR患者與正常受試者卵泡液中的差異表達(dá)蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)了31個(gè)差異表達(dá)蛋白,包括10個(gè)上調(diào)蛋白、21個(gè)下調(diào)蛋白,這些差異表達(dá)蛋白主要與細(xì)胞增殖和細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān);后來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)了DOR患者卵泡液中人前列腺酸性磷酸酶(PAP)水平降低和CD5抗原樣蛋白(CD 5L)水平升高[31]。

這些差異表達(dá)蛋白的發(fā)現(xiàn)為卵母細(xì)胞質(zhì)量的測(cè)量提供了新的思路。但目前關(guān)于DOR患者的卵泡液蛋白質(zhì)研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足,我們期待建立更加完整的卵泡液蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò),為發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)進(jìn)而為靶向治療提供新依據(jù)。

3.卵巢GCs蛋白質(zhì)組學(xué)：近期有研究者進(jìn)行了一項(xiàng)比較行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的DOR患者與正常女性卵巢GCs中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白水解酶3(caspase-3)、細(xì)胞色素c和熱休克蛋白70(Hsp 70)的表達(dá)水平與妊娠結(jié)局的前瞻性研究[32],發(fā)現(xiàn)在DOR組中,Hsp70表達(dá)水平與D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(guān)、與雌二醇水平呈負(fù)相關(guān),而細(xì)胞色素c的表達(dá)水平與D3優(yōu)質(zhì)胚胎的數(shù)量呈負(fù)相關(guān);卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物中卵丘細(xì)胞擴(kuò)展較差患者與凋亡蛋白表達(dá)水平升高、抗凋亡蛋白表達(dá)水平降低以及有或無(wú)DOR婦女的ICSI臨床結(jié)局較差相關(guān)。

有必要進(jìn)行更多的組織病理學(xué)和遺傳分子學(xué)研究,以探討不同的凋亡相關(guān)生物標(biāo)志物在接受ICSI治療的婦女卵巢GCs中的功能作用。

4.T淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)：有研究者比較了DOR患者與NOR患者中的T淋巴蛋白的差異表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOR患者卵泡內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加,CD8+/CD4+T細(xì)胞比例升高,趨化因子配體5(CCL 5)和γ干擾素(IFN-γ)水平升高,這些變化可能涉及GCs的凋亡、卵母細(xì)胞質(zhì)量降低和卵泡閉鎖[33]。隨后在GCs與CD8+T細(xì)胞體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞抑制GCs增殖并通過(guò)內(nèi)在的細(xì)胞凋亡途徑促進(jìn)其凋亡,同時(shí)凋亡的GCs產(chǎn)生并釋放大量的CCL5,而CCR5與GCs相互作用,將CD8+T淋巴細(xì)胞重新吸引至卵泡[33-34]。

有關(guān)T淋巴細(xì)胞蛋白在DOR發(fā)病進(jìn)程中如何發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究,為DOR的臨床診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)。

綜上所述,目前蛋白質(zhì)組學(xué)在DOR疾病中的應(yīng)用主要集中在探索發(fā)病機(jī)制、刪選診斷標(biāo)記物等方面,差異表達(dá)蛋白主要影響了細(xì)胞增殖和細(xì)胞信號(hào)通路,研究所用的樣本主要是血液、卵泡液、GCs、淋巴細(xì)胞和組織等。

五、結(jié)論與展望

近年來(lái),基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)被越來(lái)越多地應(yīng)用于生殖疾病的病因?qū)W研究,取得了豐碩的研究成果。首先,目前DOR發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在生物分子水平上,基因?qū)用娴难芯可俣稚?許多基因參與的具體方式尚不明確;其次,蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用尚存在較多困難與挑戰(zhàn),在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的選擇上存在著較大差異,這會(huì)導(dǎo)致不同研究成果出現(xiàn)的可能。就現(xiàn)有研究而言,缺乏大數(shù)據(jù)、大樣本的理論證據(jù),但相關(guān)證據(jù)依然加深了我們對(duì)DOR病因?qū)W的認(rèn)識(shí)和了解。臨床中多采用調(diào)節(jié)雌孕激素來(lái)增加獲得卵母細(xì)胞的數(shù)量,已有褪黑激素具有抗DOR活性從而保護(hù)卵母細(xì)胞質(zhì)量的報(bào)道[35],但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究;雖然沒(méi)有直接檢測(cè)卵巢儲(chǔ)備的方法,但多采用一些生物標(biāo)志物,如AMH、FSH和抑制素B(INH B)作為臨床實(shí)踐中生殖潛力的預(yù)測(cè)因子[36]。然而,因個(gè)體差異,因DOR原因?qū)е屡圆辉械谋壤琅f很高。鑒于DOR的發(fā)生對(duì)患者本人和輔助生殖結(jié)局的影響,深入進(jìn)行DOR確切發(fā)病機(jī)制的研究仍然是輔助生殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。