余朝陽，李慕軍

(1.廣西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,南寧 530021;2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院廣西生殖醫(yī)學研究中心,南寧 530021)

早發(fā)性卵巢功能不全(POI)是一種以高促性腺激素低雌激素閉經(jīng)為特征的生殖內(nèi)分泌疾病,以不孕和圍絕經(jīng)期癥狀為常見臨床表現(xiàn),其診斷標準[1]為：年齡<40歲,出現(xiàn)少經(jīng)或閉經(jīng)至少4個月;間隔1個月兩次測血清基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)>25 U/L。卵巢功能衰退是一個漸進發(fā)展的過程,通常認為卵巢儲備功能低下(DOR)是卵巢功能障礙的初始階段,持續(xù)發(fā)展可轉(zhuǎn)變成POI,而卵巢早衰(POF)被認為是POI的終末階段[2]。POI的病因具有高度異質(zhì)性,從自發(fā)性到特定原因包括遺傳因素如染色體異常、自身免疫性疾病、感染、醫(yī)源性因素如手術(shù)及放化療等,還有90%被診斷為病因不明[3]。臨床上以FSH>25 U/L作為POI的客觀診斷標準,但FSH對卵巢儲備功能下降的反應(yīng)并不敏感[4],且目前尚無確切有效的可逆轉(zhuǎn)卵巢功能的藥物。此外,由于缺乏雌激素的保護作用,許多遠期并發(fā)癥例如心血管疾病、骨質(zhì)疏松、認知障礙、神經(jīng)功能障礙等風險也隨之增加。基于POI缺乏診斷標志物以及不可逆的后果,確定可靠的生物標志物和治療靶點對于POI的診治至關(guān)重要。

代謝組學是對生物體中細胞、組織及體液的低分子量代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析,并尋找鑒定生理和病理狀態(tài)的關(guān)鍵差異代謝物及相關(guān)關(guān)系的一門學科。相比于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學,代謝組學作為“后起之秀”更能反映生物體表型的變化,代謝物作為分子調(diào)控的最終產(chǎn)物也能直接揭示基因和蛋白的功能[5]。目前代謝組學在多囊卵巢綜合征、卵母細胞以及胚胎質(zhì)量評估的研究中已取得一定的進展[6-7]。POI屬于生殖內(nèi)分泌疾病,通過代謝組學可以揭示POI的內(nèi)分泌代謝特征并篩選具有診斷價值的代謝標志物。因此,本文從代謝組學概述、POI的代謝特征、代謝標志物與代謝通路等方面歸納總結(jié)近年來POI的代謝組學研究進展,旨在從代謝角度探索POI的潛在代謝標志物和參與疾病機制的代謝通路,為臨床診療提供新的見解。

一、代謝組學概述

代謝物的變化與疾病的表型最為相關(guān),因此被認為是研究表型的強大工具[8]。代謝組學的研究方法主要分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。非靶向代謝組學是通過獲得樣本的所有代謝物表達譜,比較不同組間的樣本代謝產(chǎn)物種類與豐度的差異,具有高通量的優(yōu)點,但缺點是靈敏度低且難以檢測低豐度的代謝物,通常用于比較兩種生物條件下(如健康vs. 疾病、治療前vs. 治療后)代謝物的差異,因此更適合作為一種篩查差異代謝物的工具。而靶向代謝組則是利用標準品對少量目標代謝物進行檢測和定量,其優(yōu)點是可以做到絕對定量,但是通量低,主要用于檢測已知具有類似化學結(jié)構(gòu)的代謝物種類如脂質(zhì)、肉堿、氨基酸等,是一種更精準的定量工具[9]。

代謝組學的分析技術(shù)方法主要包括液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)以及核磁共振法(NMR)。而目前最常用的是液-質(zhì)聯(lián)用的方法,其具有操作簡單、適用范圍廣和靈敏度高等優(yōu)點,其高靈敏度可用于識別數(shù)千種代謝物特性[10]。目前各種分析技術(shù)都有其優(yōu)勢和局限性,單一的分析方法難以實現(xiàn)全部代謝物的分析,而多種技術(shù)的聯(lián)用可作為相互補充,從而更全面精準地分析代謝物的表達和特征。

二、POI的代謝特征

女性在圍絕經(jīng)期會因為激素變化導致糖脂代謝紊亂,包括血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低,以及血糖和胰島素異常[11]。類似的,POI引起的卵巢功能過早衰退會導致更早更嚴重的代謝改變,有研究報導POI是缺血性心肌病和心血管疾病的獨立風險因素[12]。既往Meta分析提示早絕經(jīng)(年齡<45歲)和POI均與Ⅱ型糖尿病風險增加有關(guān)[13]。

國內(nèi)外關(guān)于POI代謝特征的研究目前缺乏統(tǒng)一的結(jié)論。近期國內(nèi)浙大婦產(chǎn)醫(yī)院一項包含303名POI患者的病例對照研究顯示,與年齡匹配的健康對照組相比,POI女性血清甘油三酯、葡萄糖、尿素水平升高,血清HDL-C和腎小球濾過率水平降低[14]。而來自北京婦產(chǎn)醫(yī)院的病例對照研究提示POI組與對照組相比甘油三脂、LDL-C以及空腹胰島素顯著升高(P<0.05),但兩組間總膽固醇、HDL-C、空腹血糖以及胰島素抵抗指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)[15]。除了糖脂代謝紊亂以外,POI對骨骼健康也有長期的負面影響。研究表明POI會引起骨密度降低,在長期的生活中會增加骨質(zhì)疏松及骨折的風險[16]。

總之,由于研究人群和檢測方法的異質(zhì)性,各項研究的結(jié)果不完全一致,但總體均提示POI會出現(xiàn)不利的代謝改變。

三、基于代謝組學鑒定POI的代謝標志物和富集通路

1.外周血：最近一項關(guān)于POI患者的血漿代謝組學研究提示130種差異代謝物主要參與咖啡因代謝、泛醌和其他萜類醌的生物合成等途徑[17]。泛醌即輔酶Q10,大量研究表明輔酶Q10可以改善卵母細胞質(zhì)量和臨床妊娠率[18-19]。花生四烯酰酰胺、3-羥基-3-甲基丁酸、二己基壬二酸、18-羥基二十碳四烯酸(18-HETE)、胱氨酸和磷脂酰甘油(PG)(16∶0/18∶1)等6種差異代謝物的曲線下面積(AUC)值大于0.8,被認為是POI的診斷標志物[19]。Chen等[20]關(guān)于POF患者的血清代謝組學分析提示,差異代謝物主要富集于ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白依賴通路、蛋白質(zhì)消化吸收通路、癌癥中樞碳代謝通路、礦物質(zhì)吸收通路、皮質(zhì)醇合成分泌通路,且ROC曲線表明了6種差異代謝物包括單甲基硫酸酯、核黃素、氧戊二酸、4-羥基苯甲酸、N-乙酰去甲基硫代膦和L-半胱氨酸在區(qū)分多囊卵巢綜合征(PCOS)和POF方面具有巨大潛力,有望成為PCOS和POF的診斷標志物[20]。Jiang等[21]為了研究POI患者腸道微生物菌群和循環(huán)代謝物之間的潛在聯(lián)系,采用非靶向代謝組學方法分析了健康對照組、POI組以及激素治療組之間的血清代謝譜,結(jié)果提示大多數(shù)差異代謝物與血清轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平呈正相關(guān)而與雌二醇呈負相關(guān),KEGG提示富集程度最高的代謝通路是ABC轉(zhuǎn)運蛋白[21],這與上述Chen等[20]的研究結(jié)果一致。ABC轉(zhuǎn)運蛋白是生物體中最大的跨膜蛋白家族之一,它在線粒體平衡和膽固醇代謝等細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[22],這些轉(zhuǎn)運蛋白的功能障礙與囊性纖維化有關(guān)[23];TGF-β1是纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動因子同時也是過度炎癥抑制物,它被認為與纖連蛋白和膠原蛋白的產(chǎn)生有關(guān)[24]。POI患者血清TGF-β1水平升高提示機體內(nèi)纖維化水平較高,而經(jīng)過激素替代治療可以逆轉(zhuǎn)這種升高趨勢,表明POI患者的腸道微生物群、血清代謝物和血清TGF-β1之間的相互作用可能在POI的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[21]。曾麗華等[25]進行的POI大鼠外周血代謝組學分析表明,甘油磷脂類、中鏈脂肪酸類、膽汁酸類等54種代謝物在POI組中表達量升高,而不飽和脂肪酸類、甘氨酸類以及甘油三酯類等39種代謝物在POI組中表達量下降,提示這些差異代謝物可能與POI的發(fā)病機制相關(guān)。

與其他樣本相比,外周血采集是最小創(chuàng)傷的方式,因此在探索POI代謝標準物上具有良好的前景。然而,POI的靶向器官是卵巢,外周血的代謝物變化是否直接反映卵巢功能仍有待進行多樣本多組學聯(lián)合分析(如顆粒細胞、卵泡液),代謝物的診斷潛力仍需進行更大隊列的前瞻性驗證。

2.卵泡液：Liang等[26]采用靶向代謝組學分析DOR患者和正常對照組的卵泡液中的氧脂蛋白代謝特征,結(jié)果提示DOR組卵泡液中的15種氧磷脂代謝產(chǎn)物包括前列腺素F2α(PGF2α)、20-羧基花生四烯酸(20-COOH-AA)、20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)、前列腺素A2(PGA2)、前列腺素D2(PGD2)等顯著低于對照組,富集分析提示這15種差異氧化脂質(zhì)代謝物與花生四烯酸代謝途徑密切相關(guān);而Li[27]等的代謝組學研究表明花生四烯酸隨著卵母細胞減數(shù)分裂的進展而下降,提示卵母細胞質(zhì)量可能與花生四烯酸酸代謝相關(guān)。先前的研究表明人卵泡液中高濃度的花生四烯酸衍生物顯著降低了卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)后卵母細胞形成原核的能力[28]。作為細胞信號中間體,花生四烯酸及其衍生物通過調(diào)節(jié)cAMP激活、Ca2+內(nèi)流、MAPK和PI3K/Akt通路從而影響細胞的生長、增殖和分化[29]。此外,花生四烯酸調(diào)節(jié)牛顆粒細胞的存活、基因表達、脂質(zhì)形成、類固醇產(chǎn)生和細胞內(nèi)信號通路并對卵母細胞減數(shù)分裂其關(guān)鍵作用[27,30],進一步表明卵泡液中的花生四烯酸可直接影響顆粒細胞功能,從而調(diào)節(jié)濾泡發(fā)育和排卵。

Xiao等[31]通過擬靶代謝組學研究六味地黃丸改善DOR患者體外受精結(jié)局的作用機制,結(jié)果共鑒定了21種潛在的代謝生物標志物,其中DOR組的睪酮、孕酮、磷酰膽堿、癸酰肉堿、六氫吡啶羧酸、13,14-二氫視黃醇、膽堿、丙烯酰胺、異丁酰-l-肉堿等代謝物水平下調(diào),而N-乙酰色氨酸、2-丙烯基1-(1-丙烯基亞磺?；?丙基二硫化物、二十碳三烯酸、20α-二氫孕酮、17-十八碳烯酸的水平上調(diào)。亞麻酸對體外培養(yǎng)的山羊卵母細胞產(chǎn)生有益影響,促進胚胎的發(fā)育并調(diào)節(jié)凋亡基因的表達[32],并且保護體外脂毒條件下成熟的牛卵丘-卵母細胞復合體的發(fā)育能力[33];肉堿可以影響線粒體功能,調(diào)節(jié)牛卵母細胞衍生的旁分泌因子,并增加類固醇激素的產(chǎn)生,從而提高成熟卵母細胞的質(zhì)量和改善體外胚胎發(fā)育[34]。低水平的基礎(chǔ)睪酮是卵巢刺激后獲取卵母細胞數(shù)量低下的重要危險因素,可能對體外受精的妊娠率產(chǎn)生不利影響[35]。這些研究發(fā)現(xiàn)同時也提示了卵泡液中這些代謝物的改變可能會影響卵母細胞的質(zhì)量。

3.動物細胞和組織：除了人的外周血和卵泡液等標本,代謝組學在動物模型和細胞中的研究應(yīng)用也取得了一定的進展。Zhao等[36]的研究提示POI小鼠卵巢的代謝物水平發(fā)生了顯著變化,尤其是脂質(zhì)、甘油磷脂、類固醇和氨基酸,而POI小鼠在接受臍帶血干細胞治療后卵巢功能和代謝物恢復到接近對照組的水平,提示干細胞通過激活PI3K通路,提高游離氨基酸水平,從而改善脂質(zhì)代謝、降低單糖濃度,進而恢復卵巢功能。鞘氨脂是激活PI3K通路的重要信號分子[37],而絲氨酸是合成鞘氨脂的必要成分[38]。因此,POI小鼠卵巢中絲氨酸的顯著減少,可能下調(diào)鞘磷脂的產(chǎn)生,進一步抑制PI3K/Akt通路影響顆粒細胞及卵巢功能。Li等[27]通過研究小鼠卵母細胞在不同減數(shù)分裂階段的代謝譜特征,表明花生四烯酸是減數(shù)分裂成熟作用的關(guān)鍵靶點,并證明了絲氨酸-甘氨酸-碳途徑參與了成熟卵母細胞表觀遺傳標記的控制。Chen等[39]基于核磁共振代謝組學探索了電針對POF小鼠肝腎代謝及卵巢功能的影響,結(jié)果表明經(jīng)過電針療法后小鼠肝臟中賴氨酸、葡萄糖、磷膽堿、?；撬?、甘氨酸和甘油的相對水平升高,而谷氨酸和肌酸的相對水平降低;在小鼠腎臟中乳酸和甘油的相對水平增加,而谷氨酸、肌酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸和賴氨酸的相對水平降低。這些差異代謝物主要與能量代謝和神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān),從而可以推測針刺療法主要通過調(diào)節(jié)肝臟和腎臟中能量和神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的代謝途徑來治療POF[39]。然而,核磁共振代謝組學的局限性在于不能定量檢測代謝物,因此在未來還需擴大樣本量采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)加以驗證。

四、代謝組學的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

我們總結(jié)了代謝組學在POI各類樣本中的應(yīng)用與研究進展,發(fā)現(xiàn)POI中大多數(shù)標本(包括血漿、卵泡液和卵巢組織)中的大多數(shù)差異代謝物都與脂質(zhì)和氨基酸相關(guān),脂類和氨基酸代謝紊亂可能參與了POI的病理機制。其次,多項研究提示差異代謝物顯著富集于ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白依賴通路和花生四烯酸酸通路,提示這些代謝通路在POI的發(fā)生發(fā)展中具有不可忽視的作用。

綜上所述,代謝組學作為強大的表型工具,具有許多重要的優(yōu)勢：(1)通過研究代謝物的變化可以反映基因及蛋白的功能,差異代謝物所調(diào)控的通路可能參與了疾病的發(fā)病機制;(2)差異代謝物是生理和病理狀態(tài)之間的分水嶺,可作為疾病診斷和風險預測的生物標志物;(3)相比于轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學,代謝組學的樣本(生物體液或組織)可以在門診環(huán)境中取得,檢測成本更低,有望在臨床大規(guī)模開展;(4)通過代謝組學可評估藥物療效、毒性及不良反應(yīng),還可用于新生兒代謝性疾病篩查、腫瘤靶向治療及細菌鑒定等領(lǐng)域。

然而,代謝組學研究也面臨一定的局限性和挑戰(zhàn)：(1)代謝物極易受到機體內(nèi)部和外部因素影響而發(fā)生改變?nèi)缢幬?、疾病、采血時機及檢測方法等,因此需制定嚴格的病例和對照納入標準以及排除標準,盡可能減少研究的異質(zhì)性;(2)非靶向代謝組學只能作為代謝標志物的初篩,未來需進行更大隊列的靶向代謝組學驗證評估代謝物的診斷潛能;(3)代謝物組由數(shù)千種不同的化學物質(zhì)組成,這意味著單一的檢測方法難以全面地反映樣本中代謝物的變化,因此更全面和精確的代謝物鑒定需要多種互補技術(shù)和設(shè)備的結(jié)合。隨著高通量技術(shù)的快速發(fā)展,未來應(yīng)用多組學聯(lián)合研究能夠更全面地揭示POI的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和發(fā)病機制,而代謝組學在其中將發(fā)揮重要的作用。