汪陽，張凌，金映紅，汪萍，薛晶，梁芊芊，李曉卓，鄭啟銘，劉文鍇，韓翔舒，夏俊*

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830000；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動物疫病防控重點實驗室(部省共建)，新疆 烏魯木齊 830000；3. 新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/動物臨床醫(yī)學研究中心，新疆 烏魯木齊 830000；4. 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832061)

巴氏桿菌病主要是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起的一種人畜共患傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率，以肺炎或多臟器出血為主要特征，呈世界性分布，對羊養(yǎng)殖業(yè)具有嚴重危害[1]。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同將Pm分為A、B、D、E和F 這5種血清型。不同血清型的Pm功能相似，但是其宿主特異性及流行性具有顯著差異。PmA常與禽霍亂有關(guān)；PmB、PmD和PmE常與豬、牛等動物的敗血癥或肺炎有關(guān)；PmF常與火雞有關(guān)[2]。

Pm引起的巴氏桿菌病常使用抗生素治療，但是按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定的《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案(2021—2025年)》要求，應(yīng)落實減抗、無抗養(yǎng)殖行動，做到規(guī)范科學用藥。由于抗生素會引起耐藥性、藥物殘留等生物和食品安全等諸多問題[3]，采用預(yù)防性和治療性疫苗才是最為安全有效的防治方法。

滅活疫苗屬于傳統(tǒng)疫苗，是目前Pm防治常用的免疫疫苗，其制備技術(shù)成熟，使用過程安全性高。研究表明，Pm滅活苗具有較高的同源保護效力，但其不同血清型之間的交叉保護力較弱，并且滅活苗通常都需要添加佐劑來刺激機體免疫系統(tǒng)反應(yīng)[4]。對此，研究者們試圖改進Pm疫苗，以消除目前疫苗的缺點。Pm的外膜蛋白(Omps)和菌毛蛋白等的重組疫苗對牛、山羊或小鼠都具有一定的保護作用，其中OmpH以同源三聚體的形式存在于多個血清型，核苷酸序列比對不同血清型之間具有較高的同源性[5]。Muenthaisong等[6]研究顯示PmB型重組OmpH通過滴鼻免疫對?；蛩＞哂斜Ｗo能力，并能誘導抗體和細胞介導的免疫反應(yīng)。Sthitmatee等[7]也證實在禽中OmpH蛋白具有很強的同源性和交叉保護作用。馬建偉[8]也證實牛源Pm A型OmpH蛋白對PmA和PmB型的具有交叉保護性。所有的感染動物(牛、禽、豬、兔和羊等)Pm分離株基本都含有OmpH蛋白[9]，因此，OmpH蛋白很可能是羊源不同血清型Pm的潛在交叉保護因子。

本研究從綿羊的肺中分離到1株P(guān)m，采用分離鑒定、PCR鑒定、藥敏試驗等方法初步研究其生物學特性，并制備其滅活疫苗和OmpH重組疫苗，評價不同疫苗的免疫保護性，為新疆地區(qū)綿羊巴氏桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從新疆某地采集的病死犢羊肺臟，于4 ℃低溫環(huán)境下運回實驗室。PmA-XJ3、PmD-XJ3、PmF-XJ3和Pm未知血清型菌株，均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動物疫病防控重點實驗室(部省共建)保存。

1.2 主要試劑

馬丁氏肉湯培養(yǎng)基、白油佐劑、鋁鹽佐劑、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和BL21感受態(tài)細胞，購自于Thermo公司；IPTG、非預(yù)染蛋白Marker、預(yù)染蛋白Marker、一抗鼠抗His標簽抗體、二抗羊抗鼠抗體、聚二乙醇20000(PEG20000)和500 mmol/L咪唑等，購自于生工生物有限公司；PCR相關(guān)試劑、DNA分子質(zhì)量標準和PCR凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司；pET-28a(+)-OmpH重組質(zhì)粒，由本實驗室制備。

1.3 細菌的分離鑒定

無菌條件下取病灶交界處約25 g，劃線接種至馬丁固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，同時將其置于馬丁肉湯培養(yǎng)基37 ℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h。次日，以馬丁肉湯培養(yǎng)液(菌液)為模板，同時采用Pm特異性基因(Kmt)和5個莢膜血清型特異基因(hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、febD)進行PCR擴增，檢測是否含有Pm及其分型，擴增后均采用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。引物信息見表1。

表1 Pm特異性檢測引物和5個莢膜血清型鑒定引物信息

將PCR檢測陽性菌液劃線接種至馬丁固體培養(yǎng)基，挑取5～10個菌落，進行PCR擴增，將陽性菌落純化2次后進行革蘭染色鏡檢，分離純化的細菌以1∶1置于60%甘油，-20 ℃保存。

1.4 最適培養(yǎng)條件的篩選

將純化菌株分別接種至馬丁肉湯和BHI培養(yǎng)基，分別75 r/min和250 r/min、1%和0.1%接種量條件下37 ℃培養(yǎng)24 h，參考文獻[10]的方法測量菌液濃度，繪制生長曲線，篩選純化菌株的最適培養(yǎng)條件。

1.5 藥物敏感性試驗

采用紙片擴散法(K-B)，檢測分離菌對11種臨床常見藥物(阿米卡星、頭孢曲松、氧氟沙星、阿齊霉素、氟苯尼考、頭孢他啶、林可霉素、克林霉素、慶大霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星)的敏感性。

1.6 耐藥相關(guān)基因檢測

PCR檢測氨基糖苷類耐藥基因aadA、aadB，氯霉素類耐藥基因floR，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaOXA、blaCTX-M-2、blaSHV、ermA，喹諾酮類耐藥基因qnrS、qnrA、qnrB，共13種，引物信息見表2。擴增后均采用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表2 耐藥相關(guān)基因引物信息

1.7 毒力相關(guān)基因檢測

PCR檢測鐵離子攝取相關(guān)基因exbB、exbD、hgbA、tonB、fur，黏附素相關(guān)基因fimA，外膜蛋白相關(guān)基因Oma87、OmpH、Psl，SOD相關(guān)基因sodA、sodC、tbpA和毒素相關(guān)基因toxA，共13種毒力基因，引物信息見表3。擴增后均采用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表3 毒力相關(guān)基因引物信息

1.8 小鼠致病性試驗

按照1.4篩選的最適培養(yǎng)條件復蘇保存菌株，活菌計數(shù)法及分光光度計測定細菌群落約為1.1×1011CFU/mL。選擇新疆醫(yī)科大學動物試驗中心6周齡、體重18～20 g的昆明小鼠20只，分為5組，試驗第1、2、3、4組每只腹腔接種2.2×107、2.2×106、2.2×105、2.2×104CFU活菌，另設(shè)1組陰性對照組(注射無菌PBS)。每日觀察和記錄小鼠死亡情況，計算最小致死菌量，同時解剖所有死亡小鼠，取心血進行回歸檢測。

1.9 滅活疫苗的制備

1.9.1 最佳滅活條件的篩選

按照1.4篩選的最適培養(yǎng)條件對保存菌株進行復蘇后，按照1%的接種量接種至5份含有20 mL馬丁肉湯的無菌試管中，37 ℃ 75 r/min培養(yǎng)10 h后分別加入菌液總體積的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的甲醛進行滅活，充分混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔4 h抽取100 μL菌液涂布于馬丁肉湯固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細菌生長。

1.9.2 最佳佐劑的篩選

選40只小鼠分為4組，每組10只(雌雄各半)。取1.9.1最佳滅活條件的滅活液，試驗第1組為不添加佐劑的甲醛滅活液，第2組為鋁鹽佐劑和滅活液以1∶5的比例混合的混合液，第3組為白油佐劑和滅活液以1∶1的比例混合的混合液，陰性對照組為無菌PBS。背部皮下分別注射相應(yīng)制劑400 μL，21 d后每只背部皮下接種2.2×105CFU活菌，每天觀察并記錄小鼠的死亡情況。

1.9.3 安全性檢測

取最適滅活條件和最佳佐劑制備的疫苗液100 μL涂布至馬丁固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細菌生長，并取500 μL腹腔注射小鼠，對照組腹腔注射無菌PBS，觀察14 d，記錄小鼠有無臨床反應(yīng)，第14天剖檢免疫小鼠，觀察有無病變情況。

1.10 重組蛋白疫苗的制備

1.10.1 重組蛋白的誘導表達

重組pET-28a(+)-OmpH質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)細胞，42 ℃熱激后涂布至含有30 μg/mL卡那霉素的平板上，37 ℃培養(yǎng)8 h，挑取單克隆菌落至液體培養(yǎng)基(30 μg/mL卡那霉素)中培養(yǎng)。當OD600值達到0.6時，加入誘導劑IPTG(0.5 mmol/L)，分別于20 ℃過夜培養(yǎng)和37 ℃培養(yǎng)6 h；4 000 r/min離心10 min，棄上清液；沉淀(菌體)用緩沖液A(1×PBS，pH=7.4)懸浮，超聲破碎儀完全溶解。離心收集上清液和沉淀，沉淀使用緩沖液B(8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0的300 mmol/L NaCl)溶解，對上清液和沉淀分別制樣并采用SDS-PAGE檢測。

1.10.2 蛋白純化

擴大培養(yǎng)細菌后收集菌體進行親和純化。將細胞菌體用緩沖液C (8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0的300 mmol/L NaCl，pH=8.0的0.1% TritonX-100)溶解，超聲破碎，離心收集上清液獲得粗蛋白；取5 mL Ni-NTA，5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液清洗平衡柱；粗蛋白與平衡柱填料孵育1 h并收集流出物；將粗蛋白和流出組分進行SDS-PAGE檢測。純化后的組分透析到蛋白保存緩沖液(50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，0.1%十二烷基肌氨酸鈉，pH=8.0的2 mmol/L DTT)中，透析后用PEG20000濃縮，0.45 μm濾膜過濾后分裝，-80 ℃凍存。

1.10.3 目的蛋白檢測

對純化后的蛋白樣品進行處理，制樣，12%分離膠，5%濃縮膠跑膠，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達。將上述膠進行轉(zhuǎn)印，以鼠抗His標簽抗體為一抗，羊抗鼠抗體為二抗進行Western blot分析。

1.10.4 安全性檢測

將純化驗證后的蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1的比例進行乳化，乳化后多點注射小鼠300 μL，陰性對照組注射同等劑量的無菌PBS，觀察14 d，記錄小鼠有無臨床癥狀，第14天剖檢免疫小鼠，觀察有無病變情況。

1.11 免疫攻毒保護試驗

滅活疫苗：準備50只小鼠(雌雄各半)，均取最適滅活條件和佐劑制備的疫苗液400 μL進行背部皮下注射，21 d后將小鼠隨機分為5組，每組10只。每組分別接種實驗室保存菌株P(guān)mA-XJ3、PmD-XJ3、PmF-XJ3和Pm未知血清型4.4×105CFU，陰性對照組注射無菌PBS。每天觀察記錄小鼠的死亡情況。

重組疫苗：準備60只小鼠(雌雄各半)，按照600 μg/mL的蛋白濃度，首免以蛋白∶弗氏完全佐劑為1∶1的比例，每只小鼠200 μL的劑量進行背部皮下注射；2周后重復1次；2周后再重復1次。3次免疫后7 d，將小鼠分為a～e組和陰性對照組共6組，每組10只。a～e組分別接種實驗室保存菌株P(guān)mA-XJ3、PmD-XJ3、PmF-XJ3、Pm未知血清型和本研究分離菌PmD 2.2×105CFU，陰性對照組注射無菌PBS。每天觀察記錄小鼠的死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定與培養(yǎng)特性觀察

PCR鑒定結(jié)果顯示，Kmt基因擴增產(chǎn)物大小約為500 bp，D型特異性基因擴增產(chǎn)物大小約為690 bp，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。革蘭染色鏡檢見兩端鈍圓，呈球狀或桿狀，單個、成對、短鏈狀排列的革蘭陰性菌。由此表明從肺臟中分離到的細菌是PmD。

M．DL2000 DNA Marker；1. Kmt基因；2～6. 依次為A、B、D、E、F型特異性基因；N.空白對照。

2.2 藥敏試驗

游標卡尺測量抑菌圈直徑，結(jié)果顯示(表4)，PmD對阿米卡星、頭孢曲松、阿齊霉素、頭孢他啶、林可霉素、克林霉素、慶大霉素7種藥物耐藥，為7重耐藥菌。

表4 藥敏試驗結(jié)果

2.3 耐藥相關(guān)基因檢測

分離菌中未檢測到氨基糖苷類(aadA、aadB)，氯霉素類(floR)，四環(huán)素類(tetA、tetB)，β-內(nèi)酰胺類(blaTEM、blaOXA、blaCTX-M-2、blaSHV、ermA)和喹諾酮類(qnrS、qnrA、qnrB)耐藥基因。

M. DL2000 DNA Marker；1. exbB(283 bp)；2. exbD(247 bp)；3. hgbA(726 bp)；4. tonB(261 bp)；5. fur(244 bp)；6. fimA(806 bp)；7. Oma87(703 bp)；8. OmpH(649bp)；9. Psl(400 bp)；10. sodA(405 bp)；11. sodC(249 bp)；12. tbpA(728 bp)；13. toxA(864 bp)。

2.4 毒力相關(guān)基因檢測

由圖2可見，在分離菌中檢測到鐵離子攝取相關(guān)基因(exbB、exbD、hgbA、tonB)，黏附素相關(guān)基因(fimA)，外膜蛋白相關(guān)基因(Oma87、OmpH、Psl)，SOD相關(guān)基因(sodA、sodC、tbpA)，毒素相關(guān)基因(toxA)，共12種毒力基因。

2.5 最適培養(yǎng)條件篩選

由圖3可以看出PmD最佳培養(yǎng)條件為于馬丁肉湯培養(yǎng)基，以1%接種量37 ℃ 75 r/min培養(yǎng)16～18 h。

A. 轉(zhuǎn)速；B. 培養(yǎng)基；C. 接種量。

2.6 致病性試驗

剖檢結(jié)果可見，死亡小鼠心臟充血、心包和胸腔積液，肺臟淤血，肝臟腫大、有大量出血點，最小致死菌量為2.2×105CFU，小鼠心血回歸檢測結(jié)果與攻毒菌株一致。

2.7 滅活疫苗的制備

2.7.1 最佳滅活條件的篩選

不同滅活濃度的菌液在24 h后的生長結(jié)果顯示，0.3%、0.4%、0.5%的滅活液在8 h時就沒有菌落生長，因此最佳滅活條件為0.3%的甲醛滅活8 h。

2.7.2 最佳佐劑的篩選

使用不同佐劑的滅活液對小鼠進行攻毒保護試驗發(fā)現(xiàn)，鋁鹽佐劑的滅活液對本研究分離菌株P(guān)mD的免疫保護率達到80%，免疫保護效果較好(表5)，確定鋁鹽佐劑為最佳佐劑。

表5 分離菌株P(guān)mD最佳佐劑的篩選

2.7.3 滅活疫苗的安全性檢測

用疫苗液涂布的馬丁固體培養(yǎng)基上無細菌生長，小鼠在14 d內(nèi)無明顯的臨床反應(yīng)，食飲欲均正常，剖檢免疫小鼠，小鼠各器官無明顯病變。表明滅活疫苗安全性良好。

2.8 重組蛋白疫苗的制備

2.8.1 蛋白表達與純化檢測

蛋白表達結(jié)果顯示，在20 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下，獲得35 ku的目的蛋白條帶，該蛋白以包涵體的形式存在(圖4A)。蛋白純化結(jié)果顯示，500 mmol/L咪唑洗脫組分得到了較純的目的蛋白(如圖4B)。

M.蛋白Marker；1.誘導前總蛋白；2.20 ℃上清液；3.20 ℃沉淀；4.37 ℃上清液；5.37 ℃沉淀；6.上樣；7.流出；8.平衡；9～11. 分別為20、50和500 mmol/L咪唑洗脫組分。

2.8.2 融合目的蛋白驗證

對融合蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在理論分子量附近有明顯的條帶(如圖5A)，可初步判斷融合蛋白純化成功。用TMB顯色試劑盒顯色，Western blot結(jié)果顯示，在相應(yīng)位置出現(xiàn)1條明顯條帶(如圖5B)，表明該蛋白為目的蛋白。

M.蛋白Marker；1.融合目的蛋白。

2.8.3 重組蛋白疫苗的安全性檢測

小鼠背部皮下多點注射蛋白疫苗，48 h后注射區(qū)域有明顯肉芽腫出現(xiàn)，屬于接種疫苗后常見的反應(yīng)，無其他臨床癥狀，食飲欲均正常。第14天進行剖檢，臟器無明顯病變，表明重組蛋白疫苗安全性良好。

2.9 免疫攻毒保護試驗

滅活疫苗免疫攻毒保護試驗結(jié)果顯示(表6)，第2組小鼠48 h內(nèi)死亡2只，其余小鼠均存活，保護率為80%；第1、4組小鼠24 h內(nèi)全部死亡，保護率為0；第3組小鼠48 h內(nèi)死亡8只，2只狀態(tài)良好，保護率為20%；陰性對照組小鼠狀態(tài)均良好。解剖死亡小鼠，心血培養(yǎng)后進行常規(guī)細菌檢查，確認與注射菌一致。結(jié)果表明，本研究分離菌PmD滅活疫苗對相同血清型Pm的免疫保護效果較好，對不同血清型Pm的免疫保護效果差。

表6 鋁鹽佐劑滅活疫苗對小鼠的免疫保護效果評價

OmpH重組疫苗對小鼠的免疫保護效果表明(表7)：18 h內(nèi)b組和d組小鼠精神狀態(tài)良好，a組、c組和e組均死亡2只，其他組精神狀態(tài)良好；48 h內(nèi)a組2只死亡，b、e組3只死亡，d組1只死亡；72 h內(nèi)a組全部死亡，b組3只死亡，c組4只死亡，d組全部死亡；5 d后b組3只死亡，e組4只死亡，c組全部死亡，對照組精神狀態(tài)良好。解剖死亡小鼠，心血培養(yǎng)后進行常規(guī)細菌檢查，確認與注射菌一致。結(jié)果表明，蛋白疫苗對小鼠的免疫保護效果差，但與滅活疫苗小鼠死亡時間相比，蛋白疫苗可以延遲小鼠的死亡時間，在臨床研究中可為患病動物爭取治療時間。

表7 OmpH重組疫苗對小鼠的免疫保護效果評價

3 討論

羊產(chǎn)業(yè)是我國規(guī)劃在“十四五”期間大力發(fā)展的產(chǎn)業(yè)。新疆作為我國肉羊生產(chǎn)的主力地區(qū)，提高產(chǎn)羔數(shù)和保障羔羊存活率是非常重要的。Pm是對羔羊具有嚴重危害的病原微生物，本研究從病死羔羊肺臟中分離到1株強毒力PmD菌株，該菌具有7重耐藥性，與張繼紅[11]研究的結(jié)果相似。分離菌株未檢測到耐藥基因，與耐藥表型的結(jié)果不一致，王子杰等[12]分析Pm和溶血性曼氏桿菌(Mh)的耐藥性，發(fā)現(xiàn)Pm和Mh均對青霉素耐藥，但并未檢測到相關(guān)耐藥基因；王鐳[13]的研究表明，PmA和PmD菌株均對多種藥物耐藥，但耐藥基因與耐藥表型并不能完全吻合。這表明Pm菌株對某種抗生素的耐藥是由多種機制共同作用的結(jié)果，由多種因素決定，如外界環(huán)境的誘導、耐藥基因的突變等[14]。由于我國羊肉的消費類型從成年羊轉(zhuǎn)向羔羊[15]，羔羊肉抗生素易殘留又是目前非常嚴峻的食品安全問題，因此，對該菌的控制不能再單純地依賴于抗生素。Pm疫苗則是避免嚴重疾病發(fā)生的最佳途徑，也可避免生物和食品安全問題。

滅活疫苗因其制備技術(shù)成熟，使用過程安全性高，是目前Pm防控最常用的疫苗種類之一。但是迄今為止，Pm商品化疫苗僅具有針對豬、牛、兔和禽的滅活疫苗，目前暫無用于羊的任何類型商品化疫苗。因此，本研究制備了PmD滅活疫苗，其對同血清型菌株(PmD)的保護率達到80%，對異型菌株的保護率較低，這與Odugbo等[16]的研究結(jié)果一致，說明Pm的交叉保護率較低。

由于Pm不同血清型間具有一些同源性較高的保護因子，因此，本研究進一步研究了OmpH新型重組蛋白疫苗，即采用羊源Pm OmpH蛋白制備重組蛋白疫苗，結(jié)果顯示其保護率極低，僅對PmD型菌株有10%的保護率，這與其他源OmpH重組蛋白疫苗的結(jié)果相差較大[5-8]。但是也發(fā)現(xiàn)該疫苗能延緩小鼠的發(fā)病和死亡時間，這與楊成凱[17]研究的豬源Pm OmpH重組蛋白疫苗的研究結(jié)果一致。OmpH重組蛋白疫苗保護率較低的主要原因可能是重組蛋白也需要佐劑的輔助，不同的佐劑能夠非特異性地增強或改變機體對抗原的免疫應(yīng)答，對免疫原本身的影響較大；其次可能是OmpH通過原核表達后極易形成包涵體，其復性后對蛋白的功能產(chǎn)生了一定的影響，具體原因還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從犢羊的肺中分離到1株強毒力的PmD菌株，該菌具有7重耐藥，提示對羊場進行日常治療Pm感染時應(yīng)謹慎使用抗生素。本研究評價了由PmD菌株制備的滅活疫苗與OmpH重組蛋白疫苗的免疫保護性，提示使用PmD滅活疫苗對同血清型菌株的免疫保護效果較好，對不同血清型的Pm交叉保護性較差，而OmpH重組蛋白疫苗對各種血清型菌株保護效果均不理想，因此，對于羊多殺性巴氏桿菌病的防控還需進一步研究多價疫苗和新型疫苗。