沈晨濤,夏亞林,盛燁萍,褚培培,李建琴

原發(fā)免疫性血小板減少癥(immunologic thrombocytopenic purpura,ITP)也稱特發(fā)性血小板減少性紫癜,該病是一組以血小板生成減少、清除率增加為表現(xiàn)的出血性疾病,在兒童中高發(fā),尤其以4～6歲兒童較為常見,該病發(fā)病率約8.4人/10萬[1-2]。目前ITP的診斷仍基于臨床排除法和骨髓穿刺等實驗室檢查,在排除其他原因所致血小板減少后,才能確診為ITP,骨髓穿刺可對機體造成創(chuàng)傷,不適用于早期篩查[3],因此有必要采取其他方法以篩查ITP。雖然ITP的發(fā)病機制尚未完全明確,但現(xiàn)有的研究[4]證明血小板生成抑制及血小板破壞是引起血小板減少的直接原因,輔助性T淋巴細胞1/輔助性T淋巴細胞2(helper T cells 1/helper T cells 2,Th1/Th2)相關(guān)趨化因子的異常表達在ITP患者免疫異常中發(fā)揮了重要作用,可能是ITP的發(fā)病因素之一;另有研究[5]發(fā)現(xiàn)ITP患兒自身抗原的異常表達所引起自身反應(yīng)性T淋巴細胞亞群被激活,促進體內(nèi)血小板抗體分泌也可能是ITP發(fā)生的原因之一。該研究選擇淋巴細胞亞群及趨化因子進行分析,探討上述指標聯(lián)合檢測對兒童ITP診斷價值,以期為兒童ITP的早期篩查診斷提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 將2021年1月—2023年2月蘇州市吳江區(qū)兒童醫(yī)院與蘇州大學附屬兒童醫(yī)院接診的132例擬診為ITP的患兒納入本次研究。納入標準:① 有不同程度的出血表現(xiàn);② 經(jīng)連續(xù)2次以上檢血小板計數(shù)(blood platelet,PLT)<100×109/L;③ 無血小板減少癥相關(guān)治療史;④ 年齡在14歲及以下;⑤ 研究對象家屬已簽署知情同意書。排除標準:① 采血前1個月內(nèi)有免疫抑制劑治療史的患者;② 近1個月內(nèi)有疫苗接種史或輸血史的患者;③ 人類免疫缺陷病毒感染者;④ 繼發(fā)性血小板減少癥患者。

1.1.2主要試劑和儀器 CD4、CD8及CD3單克隆抗體[法國 IMMUNOTECH S.A.S(美國貝克曼庫爾特有限公司法國分公司)],貨號:A07752、A07758、A07749);流式細胞分析用溶血素(美國碧迪生物科學公司,貨號:349202);PBS緩沖液(北京百奧萊博生物科技有限公司,貨號QP0342);人CC類趨化因子配體5(chemokine (C-C motif) ligand 5,CCL5)、人單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1) ELISA試劑盒(上海臻科生物科技有限公司,貨號:ZK-1781、ZK-0748)、人CC類趨化因子配體11[recombinant chemokine (C-X-C motif) Ligand 1,CXCL11]ELISA試劑盒(上海禹紹生物科技有限公司,貨號:YS-F11805)。多功能酶標儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號:Multiskan FC);流式細胞儀(美國BD公司,型號:FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1淋巴細胞亞群及趨化因子的檢測 取患兒空腹外周血6 ml,分2管。其中1管1 ml置含EDTA抗凝劑試管中,避光孵育熒光標記的CD4、CD8及CD3單克隆抗體20 min后加入溶血素繼續(xù)孵育8 min,PBS洗滌、離心2次(3 000 r/min,15 min)后重懸,以流式細胞儀對CD4+、CD8+及CD3+水平進行檢測。另1管5 ml,置無菌Eppendorf試管中,以3 000 r/min冷凍離心15 min后分取血清,以酶聯(lián)免疫吸附法對CCL5、CXCL11、MCP-1水平進行檢測,操作均專業(yè)人員按試劑盒說明書進行。

1.2.2ITP的診斷 參照《諸福棠實用兒科學(第8版)》[6]兒童ITP的診斷標準:>2次血常規(guī)檢測顯示PLT<100×109/L,無脾臟增大表現(xiàn)或僅輕度增大,骨髓穿刺檢查顯示巨核細胞增多或正常,排除自身免疫性疾病、甲狀腺疾病等其他繼發(fā)性血小板減少癥。根據(jù)上述標準診斷結(jié)果將患兒分為ITP組與非ITP組。

2 結(jié)果

2.1 ITP組與非ITP組一般資料比較本次納入的患兒中男72例,女60例;年齡4～14歲,平均(6.13±1.74)歲;BMI指數(shù)18.92～24.17 kg/m2,平均(21.33±3.04)kg/m2。132例患兒中確診為ITP共88例,44例非ITP組患者中再生障礙性貧血30例,急性白血病14例。ITP組與非ITP組患者性別、年齡、BMI指數(shù)及PLT水平差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 ITP組與非ITP組一般資料的比較

2.2 ITP組與非ITP組淋巴細胞亞群及趨化因子水平比較ITP組患者CD4+、CD3+淋巴亞群比率均低于非ITP組,CD8+淋巴亞群比率、CCL5、CXCL11、MCP-1水平均高于非ITP組(均P<0.01)。見表2。

表2 ITP組與非ITP組淋巴細胞亞群及趨化因子水平比較

2.3 ITP組患者淋巴細胞亞群和趨化因子與PLT相關(guān)性分析結(jié)果相關(guān)性分析結(jié)果顯示ITP組患者CD4+、CD3+與PLT呈正相關(guān),CD8+、CCL5、CXCL11和MCP-1與PLT呈負相關(guān)關(guān)系(均P<0.05)。見表3。

表3 ITP組患者淋巴細胞亞群聯(lián)合趨化因子與PLT相關(guān)性分析

2.4 ROC分析結(jié)果ROC分析結(jié)果顯示,CD4+、CD8+、CD3+、CCL5、CXCL11和MCP-1對兒童ITP診斷的截斷值分別為27.13%、24.02%、59.88%、41.02 ng/L、30.18 ng/L和188.27 ng/L,AUC分別為0.893、0.880、0.629、0.801、0.892和0.751,六者并聯(lián)診斷(指并聯(lián)檢測時CD4+、CD3+中的一項及以上低于截斷值和/或CD8+、CCL5、CXCL11和MCP-1中的一項及以上高于截斷值)的AUC為0.967,其診斷效能高于各指標單獨檢測(Z=2.011、2.164、4.521、2.286、2.012、2.788,P=0.044、0.030、0.000、0.022、0.044、0.005)。見圖1、表4。

圖1 淋巴細胞亞群聯(lián)合趨化因子診斷ITP的ROC曲線

表4 淋巴細胞亞群聯(lián)合趨化因子診斷ITP的ROC分析

3 討論

ITP為自發(fā)性出血性疾病的一種,兒童出血性疾病中ITP占比較高[7],臨床實踐中發(fā)現(xiàn)ITP較多具有自限性,病程多為4～6周,但較大齡的兒童及青少年中患有慢性ITP的可能性更高[8]。ITP發(fā)病機制目前尚不明確,但研究[9]表明免疫應(yīng)答紊亂與該病的發(fā)生密切相關(guān),細胞免疫及體液免疫異常均有可能誘發(fā)ITP,尤以細胞免疫異常較為常見。T淋巴細胞亞群檢測在臨床中常用于自身免疫疾病、血液疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病的輔助診斷;趨化因子在細胞遷移、細胞凋亡調(diào)控、白細胞聚集及細胞因子產(chǎn)生等方面發(fā)揮重要作用,同時還在多種疾病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[10]。

正常情況下,CD4、CD8等T淋巴細胞間相互制約并誘導形成T細胞網(wǎng)絡(luò),對于維持機體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的意義。本研究結(jié)果顯示,ITP組患者CD4+、CD3+淋巴亞群比率均低于非ITP組,CD8+淋巴亞群比率高于非ITP組,與先前的研究相一致[11]。CD4+為免疫反應(yīng)中起主要反應(yīng)的T細胞,并有增強、擴大其他免疫細胞作用的功能,因而CD4+水平下降意味著患兒的免疫功能下降;CD8+則具有抑制T細胞活化及B細胞抗體產(chǎn)生的作用,其水平升高反而預(yù)示著患兒的免疫功能降低[12]。本研究進一步經(jīng)相關(guān)性分析結(jié)果顯示,ITP組患者PLT與CD4+、CD3+呈正相關(guān)關(guān)系,與CD8+呈負相關(guān)關(guān)系;考慮可能與ITP患兒CD4+、CD3+淋巴亞群比率下降,CD8+淋巴亞群比率升高使機體中參與免疫反應(yīng)的細胞隨之下降,導致機體免疫平衡被破壞進而影響機體免疫功能,進一步導致自身反應(yīng)性T細胞被激活,引起B(yǎng)細胞活化、增殖并產(chǎn)生相應(yīng)抗體,引起細胞、體液免疫異常破壞血小板有關(guān)[13]。

在ITP發(fā)病過程中免疫細胞的異常分化需經(jīng)血小板的趨化運動才可發(fā)揮相應(yīng)的生物學效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),ITP組患者CCL5、CXCL11和MCP-1水平均高于非ITP組,CCL5為趨化因子受體CCR5的高親和力配體,CXCL11則為CXCR3受體高親和力配體。研究[14]發(fā)現(xiàn)上述兩種受體均在Th1細胞表面高表達,CCL5、CXCL11可通過與相應(yīng)受體結(jié)合而引起Th1細胞紊亂,引起自身反應(yīng)性B細胞分泌抗血小板抗體進而破壞血小板。MCP-1為單核巨噬細胞的趨化因子,其可通過提高單核巨噬細胞活性而破壞血小板[15]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CCL5、CXCL11和MCP-1與血小板計數(shù)呈負相關(guān),可能與隨著CCL5、CXCL11和MCP-1水平的升高,其介導的Th1細胞、單核巨噬細胞趨化運動更強,增強了Th1細胞及單核巨噬細胞對血小板破壞作用有關(guān)。

本研究進一步ROC分析結(jié)果顯示,六者并聯(lián)診斷的診斷效能高于各指標單獨檢測,可能與不同指標僅能反映各自的部分功能有關(guān),而并聯(lián)檢測可將不同指標所反映的機體狀況整合,使診斷效能更高。需要注意的是,本研究結(jié)果仍需結(jié)合血常規(guī)、臨床診斷指標才能起到最佳的篩查效果,兒童ITP確診仍需行骨髓穿刺,本研究結(jié)果可用于提高早期篩查敏感度,在出血癥患兒中精準識別出ITP高風險人群,減少不必要的骨髓穿刺檢查。

綜上所述,CD4+、CD8+、CD3+、CCL5、CXCL11和MCP-1均可用于兒童ITP的診斷,各指標并聯(lián)檢測可提高檢測效能。因本研究僅對比了ITP與再生障礙性貧血、急性白血病等非ITP患兒的上述指標,未設(shè)置健康兒童作為對照,后續(xù)的研究中將增加指標、增加中心、擴大樣本量,并增設(shè)健康對照組以進一步證實本研究結(jié)果。