馬立聰,閻小霞,高 芳,董文杰,李迎澤,賈彥彬

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)也稱大腸癌,是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率均位于常見(jiàn)惡性腫瘤的第五位[1]。結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已達(dá)中晚期,手術(shù)切除是治療結(jié)直腸癌常見(jiàn)的手段之一,但術(shù)后常出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移,5年生存率不足10%[2-3]。因此,早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是防治結(jié)直腸癌的關(guān)鍵,尋找經(jīng)濟(jì)有效的結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物對(duì)于尋找結(jié)直腸癌高危人群至關(guān)重要。

哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)是Hippo腫瘤抑制通路中的上游分子,前期研究[4]報(bào)道,在胃腸道腫瘤中,MST1往往表達(dá)降低。研究[5]證明,結(jié)直腸癌的發(fā)病過(guò)程與單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)相關(guān)。目前,缺乏對(duì)于MST1SNPs與結(jié)直腸癌相關(guān)性的研究,本研究通過(guò)病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究的方法,在包頭地區(qū)漢族人群中檢測(cè)MST1基因多態(tài)性及其單體型,同時(shí)研究其與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性,并對(duì)疾病進(jìn)行分層分析,明確MST1SNPs與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,旨在為結(jié)直腸癌早期診斷和治療找到新的突破口。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2018年9月—2019年10月在包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌的患者390例(直腸癌:216例,結(jié)腸癌:174例)為病例組,納入標(biāo)準(zhǔn)為:新發(fā)病例,尚未接受過(guò)放化療,無(wú)其他既往癌癥病史。收集同期于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行正常體檢的人群413例為對(duì)照組,納入標(biāo)準(zhǔn)為:無(wú)消化系統(tǒng)疾病和遺傳病史。所有患者和體檢人群要求為漢族,無(wú)與其他民族通婚史,在包頭市生活5年以上,采用EDTA抗凝管留取2 ml外周血。所有參與者均提供知情同意書(shū),該項(xiàng)目獲包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò):包醫(yī)倫理人體2021第(007)號(hào)。

1.2 SNP的篩選和基因分型SNP的篩選方法已在其他文章中詳細(xì)描述[6],簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō):根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心-人類單體型圖數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中國(guó)漢族人群遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,篩選范圍包括基因第一個(gè)外顯子上游20 kb和最后一個(gè)外顯子下游10 kb的序列,以保證包含了基因的調(diào)控序列,要求篩選的SNP在中國(guó)漢族人群中的最小等位基因頻率(minor allele requency,MAF)>5%,連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD) 相關(guān)系數(shù)r2>0.8。采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司,貨號(hào):YDP348-03)提取所有血液樣本的基因組DNA。采用Taqman探針?lè)▽?duì)篩選出的SNPs進(jìn)行分型,并隨機(jī)選取5%DNA樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),基因分型由北京賽默百合生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)檢測(cè)各SNP的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,以檢驗(yàn)本研究所選的樣本在群體中是否具有代表性;秩和檢驗(yàn)比較年齡因素在病例組和對(duì)照組之間的分布差異;卡方檢驗(yàn)比較性別因素以及單體型頻率在病例組和對(duì)照組之間的分布差異;Logistic回歸計(jì)算經(jīng)年齡、性別調(diào)整后的比值比(odds ratio,OR)以及95%置信區(qū)間(confidence interval,CI),用以評(píng)估四個(gè)SNP在共顯性、顯性、超顯性、隱性四種遺傳模型下與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián),以及評(píng)估單體型與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián),并對(duì)疾病進(jìn)行分層分析。計(jì)算赤池信息準(zhǔn)則(akaike information criterion,AIC)和貝葉斯信息準(zhǔn)則(Bayesian information criterion,BIC)來(lái)評(píng)價(jià)模型擬合優(yōu)良性,AIC 和 BIC 的值越小,則表示模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合度越好此,模型則為最佳模型。采用SHEsis軟件對(duì)篩選出的MST1基因的SNP按照其在基因上的位置順序構(gòu)建單體型,并計(jì)算經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的連鎖不平衡系數(shù)D′值和r2值用于評(píng)估連鎖不平衡狀態(tài)。當(dāng)D′=0,r2=0時(shí),處于完全連鎖平衡狀態(tài);當(dāng)D′=1,r2=1時(shí),處于完全連鎖不平衡狀態(tài)。D′值和r2值越接近1,連鎖不平衡程度越高。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況的比較病例組中,男性234人(60.0%),女性156人(40.0%),平均年齡(60.82±10.94)歲。對(duì)照組中,男性261例(63.2%),女性152例(36.8%),平均年齡(57.24±10.78)歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,各病例組平均年齡較正常人組更高,年齡因素在正常人組和結(jié)直腸癌組(Z=-5.007,P<0.001)、正常人組和結(jié)腸癌亞組(Z=-3.585,P<0.001)以及正常人組和直腸癌亞組(Z=-4.491,P<0.001)間的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常人比較,結(jié)腸癌組女性患者比例更高,分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.860,P=0.027),正常人組與結(jié)直腸癌組和直腸癌亞組之間的性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.867、0.266,均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象一般情況的比較

2.2 SNP篩選和基因分型結(jié)果本研究共篩選出MST1基因4個(gè)SNPs,即rs8000,rs2234197,rs2267853,rs6073629。基因分型結(jié)果見(jiàn)表2。分型成功率均大于95%,5%樣本的重復(fù)實(shí)驗(yàn)一致率為100%。

表2 基因分型結(jié)果[n(%)]

圖1 MST1 4個(gè)SNPs的單體型構(gòu)建圖(以結(jié)直腸癌為結(jié)局變量)

表3 四種遺傳模型下各SNP與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的Logistic 回歸分析結(jié)果

表4 MST1單體型與結(jié)直腸癌的關(guān)聯(lián)分析

2.4 各SNP及單體型與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果Logistic 回歸分析結(jié)果顯示,MST1SNP rs2234197 AG基因型在共顯性和超顯性遺傳模型下均與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)(均P<0.05)。因超顯性遺傳模型AIC和BIC值最小,提示超顯性遺傳模型為最適遺傳模型,與攜帶GG+AA基因型者相比,攜帶AG基因型者直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低[OR(95%CI)=0.657(0.442～0.976)]。見(jiàn)表5。以直腸癌為結(jié)局變量構(gòu)建單體型,并分析單體型與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果顯示,共構(gòu)建出5個(gè)單體型,即AGAG,AGGT,GAGG,GGAG和GGGT,各單體型與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均無(wú)關(guān)聯(lián)(均P>0.05)。見(jiàn)表6。rs6073629與rs8000(D′=0.991,r2=0.460)和rs2267853與rs8000(D′=0.936,r2=0.288)之間分別存在強(qiáng)連鎖不平衡,構(gòu)成單體型塊。見(jiàn)圖2。

圖2 MST1 4個(gè)SNPs的單體型構(gòu)建圖(以直腸癌為結(jié)局變量)

表5 四種遺傳模型下各SNP與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性的Logistic 回歸分析結(jié)果

表6 MST1單體型與直腸癌的關(guān)聯(lián)分析

2.5 各SNP及單體型與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果Logistic 回歸分析結(jié)果顯示,MST1SNP rs8000在隱性遺傳模型下與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),與攜帶TT+GT基因型者相比,攜帶GG基因型者結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低[OR(95%CI)=0.425(0.182～0.992)]。見(jiàn)表7。以結(jié)腸癌為結(jié)局變量構(gòu)建單體型,并分析單體型與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果顯示,共構(gòu)建出5個(gè)單體型,即AGAG,AGGT,GAGG,GGAG和GGGT,各單體型與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均無(wú)關(guān)聯(lián)(均P>0.05)。見(jiàn)表8。rs6073629與rs8000(D′=1.000,r2=0.471)和rs2267853與rs8000(D′=0.931,r2=0.281)之間分別存在強(qiáng)連鎖不平衡,構(gòu)成單體型塊。見(jiàn)圖3。

圖3 MST1 4個(gè)SNPs的單體型構(gòu)建圖(以結(jié)腸癌為結(jié)局變量)

表7 四種遺傳模型下各SNP與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性Logistic 回歸分析結(jié)果

表8 MST1 單體型與結(jié)腸癌的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程復(fù)雜,是性別、年齡、飲食、吸煙、環(huán)境和遺傳等多因素作用的結(jié)果[7],目前,MST1與腫瘤的關(guān)系已被少量報(bào)道[8-10]。在胃腸道腫瘤中,MST1表達(dá)減少,下調(diào)了對(duì)下游大腫瘤抑制激酶1/2以及效應(yīng)因子Yes相關(guān)蛋白/PDZ結(jié)合域轉(zhuǎn)錄共刺激因子的磷酸化作用,導(dǎo)致組織過(guò)度生長(zhǎng)和腫瘤的發(fā)生[11]。腸道增生性腺瘤是結(jié)直腸癌癌前病變的最常見(jiàn)形式,Qin et al[12]通過(guò)特異性條件敲除小鼠的MST1基因發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)小鼠腸絨毛結(jié)構(gòu)紊亂,未分化細(xì)胞膨脹,可見(jiàn)異常增生的上皮細(xì)胞和腺瘤形成。Wu et al[13]研究發(fā)現(xiàn),重組的MST1能夠抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480的增殖,并誘導(dǎo)其凋亡。遺傳因素是影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的主要因素,并且有明確的文獻(xiàn)[7]報(bào)道,基因的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)病相關(guān)。Gong et al[5]發(fā)現(xiàn)KBTBD11基因SNP rs11777210與其附近的MYCSNP rs6983267之間存在交互作用,并且與攜帶 rs6983267 TT-rs11777210 TT基因型人群相比,攜帶rs6983267 GG-rs11777210 CC 基因型者結(jié)直腸癌易感性提高2.83倍。

本研究對(duì)MST1基因SNP與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究,并對(duì)疾病進(jìn)行分層分析。在對(duì)疾病分層前,并未發(fā)現(xiàn)MST1各SNP與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。隨后,本研究將結(jié)直腸癌分層為直腸癌和結(jié)腸癌,分析結(jié)果顯示,當(dāng)以直腸癌為結(jié)局變量時(shí),SNP rs2234197與直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),與攜帶GG+AA基因型者相比,攜帶AG基因型者直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低,提示rs2234197 AG基因型或許是直腸癌的保護(hù)性因素。目前有關(guān)該SNP與疾病的關(guān)聯(lián)研究尚無(wú)報(bào)道,本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為其他學(xué)者對(duì)該SNP的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。當(dāng)以結(jié)腸癌為結(jié)局變量時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)SNP rs8000與結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),與攜帶TT+GT 基因型者相比,攜帶GG基因型者結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低,提示rs8000 GG基因型可能是結(jié)腸癌的保護(hù)性因素。關(guān)于rs8000的研究報(bào)道非常有限,目前僅有Shen et al[14]研究了rs8000與肝細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)性,但并未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在關(guān)聯(lián),這提示MST1SNP rs8000在不同消化系統(tǒng)腫瘤中所起的作用可能不同。分層分析結(jié)果說(shuō)明同一SNP在不同部位的腸癌中的作用可能不同。

總之,本研究通過(guò)篩選MST1基因潛在致病的SNP位點(diǎn),并分析了SNPs與結(jié)直腸癌、直腸癌及結(jié)腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)了MST1基因SNP rs2234197 AG基因型和SNP rs8000 GG基因型可能分別是直腸癌和結(jié)腸癌的保護(hù)性因素,該發(fā)現(xiàn)可能為結(jié)直腸癌患者的診治提供依據(jù)。本研究尚存在一些不足之處。第一,本研究基于基因水平,所研究的SNP是否影響其編碼的蛋白MST1的表達(dá)水平和功能,并影響Hippo信號(hào)通路中位于其下游的分子的表達(dá)和功能,進(jìn)一步導(dǎo)致了疾病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚,未來(lái)需要進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本文中所研究的SNP位點(diǎn)的功能。第二,研究樣本納入量較小,且納入人群僅為漢族,因此還需擴(kuò)大樣本量在不同的人群中進(jìn)一步證實(shí)本研究的發(fā)現(xiàn)。第三,雖然已嚴(yán)格限制樣本的納入條件,但病例組和對(duì)照組的樣本來(lái)源于不同的醫(yī)院,這可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚。