張雅婷,杜玉菲,汪樂,肖漪,周一鳴

510120 廣州,中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

腎癌每年影響全球近四十萬人,導(dǎo)致超過十萬人死亡,在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率普遍較高[1-2]。根據(jù)2022年第五版WHO分類對腎癌進(jìn)行分類,腎癌可大致分為幾種亞型:透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、嫌色性腎細(xì)胞癌、集合管癌、分子定義的腎細(xì)胞癌和其他腎細(xì)胞癌,主要由生活方式、病史、環(huán)境和遺傳風(fēng)險等致病因素引起[3]。目前腎癌的治療方案主要是在早期癌癥未轉(zhuǎn)移時進(jìn)行手術(shù)切除,但手術(shù)后極有可能發(fā)生轉(zhuǎn)移,五年生存率比較低[4]。涉及手術(shù)、放療和化療的傳統(tǒng)治療方法存在重大缺陷,許多患者仍然面臨著復(fù)發(fā)的結(jié)果[5-7]。目前,免疫細(xì)胞療法成為癌癥治療的新型治療方案。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)作為一種細(xì)胞表面受體蛋白,在被嵌入免疫細(xì)胞膜后,使免疫細(xì)胞具備靶向特定抗原蛋白的能力,CAR的結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外靶抗原結(jié)合域、 跨膜結(jié)合域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。細(xì)胞外靶抗原結(jié)合域主要負(fù)責(zé)識別并特異性結(jié)合抗原,識別位點為單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv),跨膜結(jié)合域負(fù)責(zé)將CAR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接起來,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和共刺激信號結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[8],主要負(fù)責(zé)給T細(xì)胞提供激活信號。以嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimericantigen receptor T cell,CAR-T)為主的免疫細(xì)胞治療對某些B細(xì)胞白血病或淋巴瘤亞群有明顯的臨床反應(yīng)[9],但研究發(fā)現(xiàn)其在實體瘤的應(yīng)用中仍然存在很大的局限性,這與腫瘤微環(huán)境的抑制性和實體瘤本身的異質(zhì)性有關(guān)[10]。一方面,因為腫瘤免疫微環(huán)境十分復(fù)雜,實體瘤腫瘤微環(huán)境相比轉(zhuǎn)移性腫瘤微環(huán)境,具有更強(qiáng)的免疫抑制特性,免疫抑制細(xì)胞或抑制因子會限制T細(xì)胞的免疫殺傷反應(yīng)[11-12];另一方面,實體瘤具有高度異質(zhì)性,對靶向單一抗原的CAR-T細(xì)胞療法有很大的限制,免疫細(xì)胞向病灶部位的募集減少,同時減少T淋巴細(xì)胞對腫瘤的浸潤程度。目前,嵌入CAR分子的巨噬細(xì)胞(CAR-macrophage,CAR-M)有望突破實體瘤的治療[13],通過分泌促炎型細(xì)胞因子改變腫瘤微環(huán)境,從而更好地靶向吞噬腫瘤細(xì)胞,同時還能將腫瘤抗原提呈給T細(xì)胞,募集和激活T細(xì)胞對腫瘤的免疫反應(yīng)[14]。CD70分子是一種跨膜蛋白,屬于腫瘤壞死因子超家族[15],在腎透明細(xì)胞癌中呈高表達(dá)狀態(tài),被認(rèn)為是腎癌的特異性標(biāo)志物[16-17],靶向CAR-M并有效殺傷CD70高表達(dá)的腎癌細(xì)胞,是當(dāng)前腎癌治療的一個新策略。本研究擬構(gòu)建靶向人CD70蛋白的CAR-M,探討 CAR-M對表達(dá)CD70的腎癌細(xì)胞的殺傷作用,為CAR-M治療腎癌的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 腎癌細(xì)胞系(ACHN、786-O、OS-RC-2)和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自武漢普諾賽生物科技有限公司。RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基,腎癌細(xì)胞系(ACHN、786-O、OS-RC-2)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中均加入10%胎牛血清及1%青-鏈霉素溶液,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和實驗儀器 DMEM高糖、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司,慢病毒促感染試劑、CD70-CAR慢病毒、陰性對照病毒購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司,qRT-PCR引物購自廣州生工股份有限公司,流式抗體APC Rat Anti-CD11b購自美國BD公司,RNA快速提取試劑盒購自上海奕杉生物科技有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green購自日本TaKaRa公司,FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司,實時熒光定量PCR儀購自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA數(shù)據(jù)庫得到腎癌細(xì)胞系相關(guān)資料,分析CD70在人體腫瘤組織中的表達(dá)情況。

1.2.2 抗CD70 CAR載體構(gòu)建及鑒定 CD70 scFv序列來源于之前的文獻(xiàn)[18-19],我們通過基因重組技術(shù)將抗CD70-scFv、CD8α、4-1BB和CD3zeta合成DNA序列靶向CD70的CAR基因片段。重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,提取質(zhì)粒后用BamH1內(nèi)切酶進(jìn)行酶切、瓊脂糖凝膠鑒定后送檢測序驗證并留存(此質(zhì)粒命名為CD70-CAR慢病毒質(zhì)粒),對照組(不含人CD70 scFv序列,NC-CAR)慢病毒采用相同操作驗證。

1.2.3 慢病毒感染構(gòu)建CAR-M 于96孔板每孔鋪1.0×104個RAW264.7細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,每孔加入MOI為50的慢病毒稀釋液和促感染試劑,感染12～16 h后,觀察細(xì)胞狀態(tài)。若細(xì)胞狀態(tài)良好,在24 h內(nèi)更換新鮮培養(yǎng)基,于72～96 h后,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞,看綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表達(dá)。

1.2.4 流式多克隆分選CAR-M并用qRT-PCR檢測感染效率 擴(kuò)培慢病毒感染后的CAR-M后,胰酶消化,制備成單細(xì)胞懸液,PBS清洗,流式分選儀篩選出GFP陽性細(xì)胞,并用流式檢測GFP陽性率。用RNA快速提取試劑盒提取CD70-CAR-M和NC-CAR-M的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用SYBR Green進(jìn)行qRT-PCR檢測人CD70-CAR基因的表達(dá)情況。引物序列如下:CD70-CAR正向引物序列: 5′-TCGCTCCCGTTTCTCTGTTG-3′,反向引物序列:5′-CTTCTCGGCTTTCCCCCCAT-3′;CD70正向引物序列:5′-AGGAGGGCCATCTGCGTAT-3′,反向引物序列:5′-AGGCGCTGTAATGCCACTG-3′;GAPDH正向引物序列:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向引物序列:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.5 CD70-CAR-M對腎癌細(xì)胞系類器官的體外殺傷實驗 將1.0×104個腎癌細(xì)胞加入96孔V型細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行3D懸浮培養(yǎng)48 h,使細(xì)胞聚合成球體,拍照記錄球體變化,第3天以1∶1的比例分別加入NC-CAR-M和CD70-CAR-M。共培養(yǎng)3天后,顯微鏡拍攝記錄白光和熒光圖片,小心取出類器官,用Accutase消化液在37 ℃消化30 min,期間用移液器不斷吹打,使其盡可能消化成單細(xì)胞懸液,PBS清洗,1 000 rpm離心5 min,加入5 μL CD11b抗體,混勻放置冰上,避光孵育30 min,再次用PBS清洗,洗去抗體,加入200 μL PBS,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測熒光。檢測結(jié)果采用FlowJo軟件分析。

1.2.6 Transwell共培養(yǎng)實驗 將3.0×105個RAW 264.7、CD70-CAR-RAW264.7和NC-CAR-RAW264.7分別接種在Transwell小室底面培養(yǎng),加入高糖DMEM培養(yǎng)基,將3.0×104個786-O接種在小室內(nèi),加入RPMI-1640培養(yǎng)基,小室內(nèi)外培養(yǎng)基液面齊平,共培養(yǎng)3天后,收集RAW264.7、NC-CAR-RAW264.7和CD70-CAR-RAW264.7細(xì)胞,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞的表型變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0,均進(jìn)行3次重復(fù)實驗,取其均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的組間采用獨立樣本t檢驗,P值<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 CD70分子在腎癌細(xì)胞系中高表達(dá)

GEPIA數(shù)據(jù)庫中顯示CD70在腎癌中表達(dá)水平顯著高于其他癌癥類型,但是對患者的生存率無明顯影響。這些結(jié)果提示CD70可能為腎透明細(xì)胞癌的診斷標(biāo)記物及識別靶點(圖1A～C),通過qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)相較于ACHN和OS-RC-2,786-O的CD70表達(dá)水平最高 (圖1D),提示CD70可以作為腎透明細(xì)胞癌特異性的作用靶點。

圖1 CD70在不同癌癥中的表達(dá)情況

2.2 設(shè)計和構(gòu)建人CD70-CAR慢病毒表達(dá)質(zhì)粒

慢病毒載體利用的是pLV-EF1α-EGFP-WPRE質(zhì)粒,由EF1α作為啟動子,并同時表達(dá)GFP(圖2A)。CD70-CAR的基因片段組成依次為:CD8α信號肽、CD70-scFv、CD8α鉸鏈區(qū)、CD8α跨膜區(qū)、CD28、4-1BB和CD3zeta分子信號分析(圖2B)。NC-CAR序列由慢病毒空載體構(gòu)建,GFP通過P2A鏈接和CAR的序列鏈接,目的是讓表達(dá)CAR的細(xì)胞會同時表達(dá)綠色熒光,用于后期的鑒定和篩選。

圖2 慢病毒載體質(zhì)粒和CD70-CAR結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 成功構(gòu)建CD70-CAR-M細(xì)胞

利用滴度MOI為50的對照和CD70-CAR慢病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,制備NC-CAR-M和CD70-CAR-M,熒光顯微鏡下可見,NC-CAR-M和CD70-CAR-M帶有綠色熒光(圖3),經(jīng)過流式分選出GFP陽性細(xì)胞培養(yǎng)后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測 NC-CAR和CD70-CAR慢病毒的感染效率可達(dá)80%以上(圖4A～B)。通過qRT-PCR檢測了CD70-CAR基因在NC-CAR-M和CD70-CAR-M中的表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)其在CD70-CAR-M中特異性高表達(dá),證明CD70-CAR-M細(xì)胞構(gòu)建成功(圖4C)。

圖3 CD70-CAR慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞

圖4 流式和qRT-PCR檢測CD70-CAR-M

2.4 嵌入CD70-CAR分子引起巨噬細(xì)胞的標(biāo)志基因改變

將Transwell小室放入六孔培養(yǎng)板中,上室內(nèi)培養(yǎng)786-O細(xì)胞,下室內(nèi)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞,上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。共培養(yǎng)3天后,收集下層巨噬細(xì)胞并提取其RNA逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR檢測。我們發(fā)現(xiàn)相較于NC-CAR-M組,CD70-CAR-M組的TNF-α顯著性上調(diào)而TGF-β顯著性下調(diào)(圖5),說明巨噬細(xì)胞表達(dá)CD70的CAR后向促炎型巨噬細(xì)胞方向分化。

圖5 qRT-PCR檢測CAR-M中細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化

3D細(xì)胞培養(yǎng)利用V型細(xì)胞培養(yǎng)板,是一種可以模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀況及環(huán)境,使細(xì)胞在體外條件下進(jìn)行三維生長的培養(yǎng)方法,能更加準(zhǔn)確的檢測CD70-CAR-M的殺傷效果。我們將1.0×104個不同類型的腎癌細(xì)胞,包括786-O、ACHN和OS-RC-2分別鋪于96孔V型細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)兩天后,觀測到細(xì)胞形成球形腫瘤類器官。在第3天按1∶1的比例分別加入NC-CAR-M和CD70-CAR-M細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),共培養(yǎng)5天后,在光學(xué)和熒光顯微鏡下觀察腫瘤球體的形態(tài)變化(圖6)。和加入了NC-CAR-M相比,加入CD70-CAR-M的腫瘤球體結(jié)構(gòu)更加松散,提示CD70-CAR-M巨噬細(xì)胞能更好地浸潤到CD70表達(dá)高的靶點腫瘤球體內(nèi)部結(jié)構(gòu),具有更好的殺傷效果。共培養(yǎng)后將腫瘤類器官解離成單細(xì)胞懸液并計數(shù),流式檢測出巨噬細(xì)胞所占比例(圖7),計算腫瘤細(xì)胞存活數(shù)量,發(fā)現(xiàn)相比對照組,786-O的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,說明CD70-CAR-M對786-O有明顯的殺傷效果。

圖6 和CAR-M共培養(yǎng)后不同腎癌細(xì)胞的形態(tài)

圖7 CD70-CAR-M顯著降低腎癌細(xì)胞的數(shù)量

3 討 論

腎癌包括多種不同類型,具有不同的組織學(xué)、臨床過程和治療反應(yīng)的特征,主要作為實體瘤治療,具有一定的困難性,因此,找到更為創(chuàng)新有效的腎癌治療方法尤為重要,目前研究表明免疫細(xì)胞療法在治療腫瘤中具有很大的前景。

過繼細(xì)胞療法是一種針對癌癥的細(xì)胞免疫療法,利用來自人體自身免疫系統(tǒng)的細(xì)胞來消除癌癥,目前主流和新興的細(xì)胞免疫療法包括TIL、TCR-T、CAR-T、CAR-NK、CAR-M、DC、iNKT等。CAR免疫細(xì)胞療法是將患者的T細(xì)胞導(dǎo)入CAR,構(gòu)建出穩(wěn)定的CAR-T細(xì)胞,回輸至患者體內(nèi),從而殺死腫瘤細(xì)胞。但CAR-T細(xì)胞對于一些實體瘤治療效果并不理想[20],治療實體腫瘤的CAR-T細(xì)胞治療的主要挑戰(zhàn)之一是CAR-T細(xì)胞滲透到腫瘤腫塊中的效率低下。目前,研究表明嵌合抗原受體巨噬細(xì)胞療法已經(jīng)取得臨床進(jìn)展,HER2-CAR-M(CT-0508)是用人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor,HER2)為靶點,主要針對HER2陽性的實體瘤患者治療,2020年7月,CT-0508細(xì)胞療法獲FDA批準(zhǔn)開展I期多中心臨床實驗研究,2021年3月,CAR-M細(xì)胞療法首次用于人體研究[21],Carisma公司完成首例靶向HER2的CAR-M細(xì)胞療法(CT-0508)受試者給藥。CAR-M在實體瘤治療領(lǐng)域中帶來了嶄新的希望。

CD70是一種在惡性腫瘤和實體腫瘤中被調(diào)節(jié)的泛癌靶標(biāo),使其成為CAR細(xì)胞療法具有吸引力的治療靶標(biāo),在本研究中,構(gòu)建了靶向CD70的CAR-M細(xì)胞系,在體外利用3D培養(yǎng)技術(shù),充分驗證了CAR-M的殺傷和吞噬效率,在3D培養(yǎng)過程中,我們發(fā)現(xiàn),根據(jù)CD70表達(dá)水平的差異,CAR-M細(xì)胞對腎癌類器官有不同程度的浸潤,共培養(yǎng)后786-O的結(jié)構(gòu)更加松散,此外,在共培養(yǎng)后我們發(fā)現(xiàn)CD70-CAR-RAW264.7可以促使巨噬細(xì)胞增加TNF-α表達(dá),同時減少TGF-β表達(dá),使其向促炎型巨噬細(xì)胞分化,從而具備更充分的腫瘤殺傷微環(huán)境。靶向CD70的CAR-M構(gòu)建為腎癌治療提供了新的治療途徑,對786-O顯現(xiàn)出有效的殺傷腎癌細(xì)胞的作用,綜上所述,CAR-M在驅(qū)動實體瘤的抗癌免疫方面具有巨大潛力。然而CAR-M治療也面臨一些尚未解決的難題,巨噬細(xì)胞是細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要來源,可導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放綜合征[22],由于巨噬細(xì)胞分布在全身,使用CAR-M可能會導(dǎo)致脫靶毒性并限制療效。然而在本研究中,靶向CD70的CAR-M對ACHN和OS-RC-2殺傷作用不顯著,在光學(xué)顯微鏡下觀察到其吞噬作用不強(qiáng),與之前報道的文獻(xiàn)靶向HER2的CAR-M細(xì)胞療法殺傷效果有一定的差異,一方面,這個結(jié)果或許跟CD70的scFv的序列級或者腫瘤細(xì)胞自身特性相關(guān),另一方面,也可能和體外實驗的條件相關(guān),相比786-O,3D培養(yǎng)條件下的OS-RC-2成瘤效率不是很好。因此,需要進(jìn)一步研究和優(yōu)化CD70-CAR-M效率并確保其安全性。雖然CAR-M技術(shù)作為癌癥免疫療法仍處于發(fā)展的早期階段,仍然存在很大的挑戰(zhàn),但巨噬細(xì)胞作為治療劑的潛力仍在繼續(xù)挖掘和探索,關(guān)于這一領(lǐng)域的新突破將對各種疾病的新療法的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。

總之,本研究結(jié)果表明CD70-CAR-M在治療CD70陽性的腎癌上具有一定的臨床潛力,并為實體瘤治療帶來了新的希望。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任;并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存,可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測。

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審,達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書等協(xié)議。