左 娣,郝世杰,楊 盼,李 苗,任曉璠,丁 娜,馬文倩,王盼盼,王詩雨,戎偉芳,劉昆梅

(寧夏醫(yī)科大學(xué)1. 顱腦疾病重點實驗室、2. 臨床醫(yī)學(xué)院、3. 口腔醫(yī)學(xué)院,寧夏 銀川 750004;4. 上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 200025)

癲癇是一類腦部神經(jīng)元異常放電引起自發(fā)、反復(fù)性發(fā)作的疾病?？拱d癇藥物是癲癇治療的主要方式[1],但約30%的患者對藥物治療反應(yīng)差,這類癲癇被稱為“難治性癲癇”,顳葉癲癇即臨床常見的難治性癲癇之一。因此,深入開展顳葉癲癇發(fā)病機制研究,對其治療方式的拓展及抗癲癇藥物的開發(fā)具有重要意義。隨著轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)的進步,轉(zhuǎn)錄組測序變得越來越便捷和準(zhǔn)確,可以結(jié)合蛋白互作等研究手段,篩選出更加特異、作用顯著的靶蛋白。轉(zhuǎn)錄測序可為完善癲癇發(fā)病機制研究提供有力的生物信息學(xué)支持,為抗癲癇藥物篩選提供潛在靶點。

近年來研究發(fā)現(xiàn),雌激素與癲癇有緊密聯(lián)系[2],高濃度雌激素會加劇癲癇發(fā)作,而低濃度雌激素具有抗癲癇效應(yīng),雌激素還有降低癲癇持續(xù)狀態(tài)死亡率效應(yīng)。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(G-protein coupled estrogen receptor 1,GPER1)與17β-雌二醇特異性結(jié)合后,引起cAMP合成,促進鈣動員、激活酪氨酸激酶Src,促進肝素結(jié)合表皮生長因子(heparin binds to epidermal growth factor,HB-EGF)分泌,促進EGFR反式激活,進而激活下游PI3K/Akt和ERK/MAPK信號通路。GPER1發(fā)揮調(diào)控記憶認知[3-4]、神經(jīng)保護[5]等作用,參與阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、缺血性腦損傷、腦部腫瘤等病理過程。課題組之前研究表明,GPER1表達水平降低或功能被抑制時,能夠明顯提高顳葉癲癇易感性和癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作嚴(yán)重程度[6-7],然而GPER1調(diào)控癲癇發(fā)作的分子機制并不清楚。本研究分別以野生型(wild type,WT)、Gper1敲低(Gper1-knockdown,Gper1-KD)大鼠海馬組織為樣本,使用二代真核轉(zhuǎn)錄組測序方法,對GPER1敲低對轉(zhuǎn)錄組影響進行分析,以期獲得關(guān)鍵的基因及調(diào)控通路,豐富GPER1在癲癇中作用的基礎(chǔ)研究。

1 材料

1.1 實驗動物SD大鼠,體質(zhì)量(230～280) g,♂,6～8周齡,購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(寧)2020-0001。所有大鼠飼養(yǎng)于恒溫恒濕、12 h ∶12 h光暗循環(huán)SPF級環(huán)境中,均自由飲水飲食。實驗中使用的Gper1-KD基因鼠由上海交通大學(xué)戎偉芳教授惠贈,該鼠為Gper1基因全身性敲低動物模型。用于轉(zhuǎn)錄組測序的鼠分為WT、Gper1-KD組,每組為含6只鼠海馬組織的混合樣品。用于qPCR驗證的鼠分為WT、Gper1-KD、野生型癲癇后8h癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)組(WT SE)、Gper1敲低癲癇后8h癲癇持續(xù)狀態(tài)組(Gper1-KD SE),每組包括4～6個獨立海馬組織樣品。所有動物實驗經(jīng)過寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(寧醫(yī)大倫理第2021-N0122號)。

1.2 試劑TRIzol RNA提取試劑,購自Thermo Fisher科技公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:KR118-02),購自北京天根生物公司;熒光定量PCR試劑盒(貨號:RR820A),購自TaKaRa生物技術(shù)公司。

2 方法

2.1 二代真核轉(zhuǎn)錄組測序方法取新鮮大鼠腦組織,冰上分離出海馬腦區(qū)。提取海馬組織RNA,并進行RNA質(zhì)量鑒定、濃度檢測,分裝后保存在-80 ℃。加入Fragmentation Buffer將Oligo(dT)磁珠富集之后mRNA打斷,然后以此打斷的mRNA作為模板,進行cDNA兩條鏈的合成。將合成的cDNA進行純化,添加多聚腺苷酸尾,之后與測序接頭連接,PCR反應(yīng)進行文庫構(gòu)建,通過IlluminaHiSeq平臺開展測序工作。將Gper1-KD組與WT組相比,根據(jù)差異表達基因條件倍數(shù)變化(fold change,FC)>2,且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.01進行篩選,此二代真核轉(zhuǎn)錄組測序由北京百邁客生物科技公司協(xié)助完成。

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將所得FPKM(Fragments Per Kilobase per Million reads)數(shù)值,作為評價基因表達水平的一項重要指標(biāo)。使用軟件DESeqR分析兩組樣品間差異基因表達,運用Benjamini和Hochberg計算方法來控制P值,以降低錯誤率,只有FC≥2,FDR<0.05的基因才被認定為表達水平差異基因。使用STRING數(shù)據(jù)庫將所有差異基因表達蛋白構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),并對核心和關(guān)鍵蛋白進行進一步互作分析,應(yīng)用Cytoscape軟件將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

2.3 熒光定量PCR(RT-qPCR)驗證分離新鮮大鼠海馬組織,提取RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法步驟進行cDNA合成。每個反應(yīng)體系包括1 μL cDNA,上、下游引物各1 μL,使用SYBR GREEN熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增。PCR儀設(shè)置程序為:95 ℃預(yù)反應(yīng)5 min,95 ℃變性10 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,從第2個步驟開始進行40個循環(huán)。以GAPDH轉(zhuǎn)錄表達水平為內(nèi)參,基因表達相對值根據(jù)2-ΔΔCt計算。引物序列見Tab1。

Tab1 Primers used in real-time PCR

3 結(jié)果

3.1Gper1-KD組與WT組差異基因及癲癇相關(guān)基因?qū)per1-KD組與WT組相比,根據(jù)差異表達基因篩選條件(FC>2且FDR<0.01)進行篩選,共檢測到DEGs 2 253個,其中上調(diào)基因1 380個,下調(diào)基因873個,從DEGs中對癲癇相關(guān)基因進行篩選分析,見Tab2。

Tab2 Analysis of epilepsy-related gene expression

3.2Gper1-KD組多個生物過程及信號通路發(fā)生變化GO富集結(jié)果顯示,DEGs富集的主要生物過程有淋巴細胞趨化性、細胞分泌、巨噬細胞趨化性、中性粒細胞趨化性、血管生成正向調(diào)控等(Fig1A);DEGs主要涉及的細胞組分有蛋白性細胞外基質(zhì)、細胞表面、郎飛氏結(jié)、軸突起始段等(Fig1B);DEGs主要涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、趨化因子活動、清道夫受體活性、整合蛋白結(jié)合等分子功能(Fig1C)。KEGG富集結(jié)果顯示,DEGs所涉及的分子信號通路主要有腫瘤信號通路、PI3K-Akt、腫瘤蛋白聚糖相關(guān)通路、黏著斑相關(guān)通路、MAPK信號通路等(Fig1D)。

Fig1 GO and KEGG enrichment of DEGs between WT and Gper1-KD samples

3.3Gper1-KD組與WT組樣品差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)對Gper1-KD組與WT組樣品DEGs表達蛋白進行互作分析,形成1個929個節(jié)點,10 592個互作關(guān)系的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(Fig2A)。對其中關(guān)鍵RNA和富集的信號通路繪制網(wǎng)絡(luò)圖,網(wǎng)絡(luò)通路以大圓點顯示。結(jié)果表明,關(guān)鍵差異蛋白主要在TNF信號通路、TGF-β信號通路、FoxO信號通路等,位于蛋白網(wǎng)絡(luò)核心的蛋白主要有Mlkl、FoxO3、Mapk12、Pdpk1、Pik3cg、Cdh1等(Fig2B),其中位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中心的Mlkl、Pdpk1和Cdh1蛋白與癲癇發(fā)生密切相關(guān)。

Fig2 Proteininteraction analysis between WT and Gper1-KD group

3.4Gper1-KD組與WT組關(guān)鍵差異基因RT-qPCR驗證根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果,選取篩選出的關(guān)鍵基因進行驗證。實驗結(jié)果表明(Fig3、4),與WT組相比,Gper1-KD組Mapk12、Pdpk1、Foxo3、Camk2d、Pik3cg、Gper1基因表達水平差異具有顯著性,Pik3cb、Cdh1、Rac2基因表達水平差異無顯著性。此外,Gper1-KD組與WT組相比,Camk2d和Pik3cg表達水平差異有顯著性,然而,Gper1-KD SE組與WT SE組相比,Camk2d和Pik3cg表達差異無顯著性,可能與癲癇持續(xù)狀態(tài)時,Camk2d和Pik3cg基因表達水平迅速升高有關(guān)。雌激素處理后,Rac2基因表達水平下調(diào)[8],本實驗結(jié)果表明,Gper1-KD SE組與WT SE組相比,Rac2表達水平明顯升高,表明雌激素對Rac2基因表達的調(diào)控可能是通過GPER1。Rac2參與軸突的生長和引導(dǎo)[9],因此,GPER1可能通過調(diào)節(jié)Rac2基因表達改變,影響癲癇后神經(jīng)元形態(tài)和功能。

Fig3 Detection of relative mRNA expression of key genes using n=4-6)

Fig4 Detection of relative mRNA expression of key genes using n=4-6)

4 討論

本研究對WT、Gper1-KD組大鼠海馬組織進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析,KEGG富集結(jié)果顯示,PI3K-Akt、MAPK信號通路調(diào)控效果明顯。之前研究證實,mTOR能維持GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元的平衡,而GABA能和谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)的失衡是癲癇形成的關(guān)鍵原因。PI3K/Akt下游mTORC1復(fù)合物活性提高時,會提高神經(jīng)元興奮性,mTOR和炎癥信號通路被抑制時,能起到降低發(fā)作,延遲或者抑制癲癇發(fā)展的作用[10]。另外,抑制PI3K和Akt可以阻止mTOR激活,與直接抑制mTOR起到一樣的效應(yīng),即可以降低發(fā)作活動和細胞死亡數(shù)目。對創(chuàng)傷后癲癇海馬類器官進行培養(yǎng),可以發(fā)現(xiàn)一系列抗癲癇發(fā)生生物過程和神經(jīng)保護活動,發(fā)現(xiàn)這個過程中mTOR被PI3K-Akt信號通路激活,并且短暫地抑制mTOR可以對癲癇產(chǎn)生持續(xù)的效應(yīng)[11]。目前,關(guān)于mTOR信號通路在癲癇中作用的臨床前研究越來越多,未來有望對難治性癲癇的治療提供一定的幫助[12-13]。

長期反復(fù)性癲癇發(fā)作可能導(dǎo)致慢性癲癇、認知和行為障礙,在這個過程中,突觸可塑性改變起到重要作用。長時程增強,即突觸強度持續(xù)提高,對學(xué)習(xí)和記憶過程至關(guān)重要。針對癲癇小鼠認知障礙和突觸可塑性改變的研究發(fā)現(xiàn),此過程與促炎因子和PI3K/Akt通路密切相關(guān)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),癲癇損傷學(xué)習(xí)和記憶能力,長時程增強減少,海馬區(qū)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平提高,而使用IL-1β受體拮抗劑后,長時程增強得以提高,通過PI3K/Akt信號通路改善小鼠癲癇后學(xué)習(xí)記憶障礙[16]。說明癲癇后分泌的IL-1β可以通過PI3K/Akt信號通路,影響海馬區(qū)突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶過程。因此,PI3K/Akt信號通路在癲癇發(fā)作、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等過程中均有重要作用,本研究通過轉(zhuǎn)錄組比較也發(fā)現(xiàn),多個PI3K-Akt信號通路基因存在明顯的表達差異。

研究發(fā)現(xiàn),激活小膠質(zhì)細胞GPER1可通過NF-κB/MAPK信號通路,保護神經(jīng)元免于興奮性毒性[17]。MAPK家族包含3條信號通路,ERK、p38、JNK信號通路。ERK通過調(diào)節(jié)NMDA受體活性導(dǎo)致癲癇發(fā)生。MAPK在多種化學(xué)藥物誘發(fā)癲癇動物模型中均發(fā)揮作用,提示MAPK通路參與癲癇發(fā)生過程。課題組之前研究也證實,p38 MAPK信號通路在癲癇后被激活,而且在GPER1調(diào)控下影響癲癇后炎癥反應(yīng)[6]。提示GPER1可能通過MAPK和PI3K-Akt-mTOR信號通路調(diào)控癲癇發(fā)病過程。

蛋白質(zhì)互作結(jié)果提示,在WT、Gper1-KD海馬組織中,差異蛋白富集的TGF-β通路是影響癲癇的關(guān)鍵信號通路。FoxO信號通路位于PI3K-Akt信號通路下游,可能通過PI3K-Akt信號通路在GPER1介導(dǎo)癲癇發(fā)作的過程中起作用。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中心的PDPK1蛋白激酶,靶蛋白包括PKB、SGK1、PAK1等,之前研究證實PDPK1與癲癇發(fā)生密切相關(guān)[18],PDPK1可能在GPER1調(diào)控癲癇易感性中起關(guān)鍵作用。

WT與Gper1-KD組蛋白互作結(jié)果提示TNF信號通路有明顯差異,這也與GPER1在神經(jīng)炎癥中有重要作用相符合,與我們之前GPER1敲減影響癲癇后炎癥反應(yīng)的研究結(jié)果相一致[6]。Pik3cg表達有明顯差異,Pik3cg是屬于PI3/PI4-kinase家族的一類激酶,PI3K/Akt/mTOR信號通路對癲癇發(fā)作有重要調(diào)控作用,因此Pik3cg蛋白在GPER1調(diào)控癲癇發(fā)作易感性過程中的作用也值得深入研究。