崔玉娟,趙 輝,蘇東霞,張 瑩,胡丹東

(1. 西北師范大學生命科學學院,甘肅 蘭州 730070;2. 北京市延慶區(qū)疾病預防控制中心,北京 102100;3. 北京市延慶區(qū)市場監(jiān)管檢驗檢測監(jiān)控中心,北京 102100)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)屬于副粘病毒科、肺病毒屬,是一種含有包膜的反義單鏈RNA病毒,在全球范圍內(nèi)具有高度的流行性,發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,存在較大的威脅。RSV主要感染者為兒童和老人,感染后的癥狀以支氣管炎或者其他下呼吸道疾病、發(fā)燒為主,隨著感染加劇可引起不同的組織病變,特別是引發(fā)肺炎等嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。黃連素(berberine,BE)為從小檗屬植物中分離得到的生物堿,具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌等多種作用,在抗病毒領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可適用于治療多種病毒感染性疾病,其機制與BE調(diào)節(jié)MAPK途徑、PI3K/AKT、AMPK/mTOR、NF-κB信號通路以及自噬密切相關(guān)[2]。不僅如此,BE還被發(fā)現(xiàn)可以支持宿主的免疫反應(yīng),提高機體內(nèi)代謝能力,進一步強化對病毒的清除能力。由于BE毒性低、人體耐受性好,因此在抗病毒治療領(lǐng)域具有一定的潛力。

NRAV是近年來發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNAs)家族成員之一,可通過抑制干擾素刺激基因(ISGs)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)抗病毒的活性,病毒的感染可以誘導宿主細胞NRAV的差異性轉(zhuǎn)錄,在免疫信號通路中發(fā)揮抗病毒作用,并介導病毒的復制,減少對宿主細胞病毒感染后的抗病毒先天免疫反應(yīng)[3]。有研究表明,NRAV的過表達可促進體外RSV的復制,宿主細胞可能通過降低NRAV水平抑制RSV病毒感染[4]。PI3K/AKT信號通路與細胞的生長、分裂、存活有關(guān),研究發(fā)現(xiàn),病毒為了入侵細胞,并在細胞內(nèi)進行有效的復制,通過激活該通路的方式對宿主細胞采取了抑制凋亡的策略,促使感染細胞逃避先天免疫反應(yīng)而短期生存,從而使病毒在細胞凋亡前進行有效的復制,在不同類型的病毒感染過程中,均發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。本研究旨在探究LncRNA NRAV與PI3K/AKT信號通路在BE減輕RSV病毒感染致HEp-2細胞損傷中的作用及相關(guān)機制,為RSV感染性疾病的治療和藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人喉表皮樣癌細胞(HEp-2)、RSV病毒株購自美國ATCC公司。BE購自北京索萊寶科技有限公司(CAS號:2086-83-1,分子量:336.36,純度:≥98%)。NRAV過表達質(zhì)粒(pc-DNA3.1-NRAV)、NRAV低表達質(zhì)粒(sh-lncRNA NRAV)、NRAV陰性對照質(zhì)粒(NC-lncRNA NRAV)、空白質(zhì)粒(pc-DNA3.1),購自湖南普拉特澤生物科技有限公司;PI3K激活劑740Y-P(M00988)購自北京百奧菜博科技有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)(200-664-3)、MitoSOX工作液(1821370-28-8),購買自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;CCK-8試劑(HY-K0301)購自德國默克公司;一抗抗體PI3K、AKT、NLRP3、ASC、caspase-1、PINK1、Parkin、P62、Beclin1、LC3 I、LC3 II、BNIP3購自美國Cell Signaling Technology公司;IL-1β(SEKH-0002)、IL-6(SEKH-0013)、IL-8(SEKH-0016)、TNF-α(SEKH-0047)ELISA檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;PBA緩沖液、JC-1試劑盒(C2005)、ATP試劑盒(S0026)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。流式細胞分析儀(CytoFLEX型)購自美國美國貝克曼庫爾特公司;酶標儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;全自動蛋白印跡系統(tǒng)(Qblot型)購自上海曼博生物醫(yī)藥科技有限公司;激光共聚焦顯微鏡(OLS5100型)購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分組及處理 HEp-2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期HEp-2細胞按照1×105/孔接種于6孔板中,細胞生長度達80%～90%時備用。取適量BE在DMSO溶液中充分溶解,配置濃度分別為5、10、15 μmol·L-1的BE溶液,RSV處理劑量為200 pfu/孔。將HEp-2細胞隨機分為:pcDNA3.1-NRAV組(細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NRAV,RSV處理)、sh-lncRNA NRAV組(細胞轉(zhuǎn)染sh-lncRNA NRAV,RSV處理)、NC-lncRNA NRAV組(細胞轉(zhuǎn)染NC-lncRNA NRAV,RSV處理)、Control組(不用RSV和BE處理)、RSV組(RSV處理)、RSV+5 μmol·L-1-BE組(RSV和5 μmol·L-1的BE處理)、RSV+10 μmol·L-1-BE組(RSV和10 μmol·L-1的BE處理)、RSV+15 μmol·L-1-BE組/RSV+BE組(RSV和15 μmol·L-1的BE處理),RSV+BE+740Y-P組(RSV、15 μmol·L-1的BE和50 μg·L-1的740Y-P處理)、RSV+BE+pcDNA3.1組(細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1,且RSV、15 μmol·L-1的BE處理)、RSV+BE+pcDNA3.1-NRAV組(細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NRAV,且RSV、15 μmol·L-1的BE處理)對照組和感染組則加入DMSO 20 μL,BE處理組加入相應(yīng)濃度的BE溶液20 μL。各組細胞在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,收集細胞檢測相應(yīng)指標。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 細胞在60 mm培養(yǎng)皿中以3.0×105個/皿的密度培養(yǎng)24 h。然后,使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1-NRAV、sh-lncRNA NRAV、NC-lncRNA NRAV、pcDNA3.1質(zhì)粒3 μg轉(zhuǎn)染至HEp-2細胞中,在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3qRT-PCR檢測mRNA表達水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞,用TRIzol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進行PCR,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法定量NRAV、RSV-F、NS2的相對表達水平。

1.2.4Western blot檢測HEp-2細胞相關(guān)蛋白表達 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞,用RIPA裂解液提取總蛋白,用BCA法測濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),并轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶粉封閉,加入相應(yīng)一抗(1 ∶1 000),4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h。ECL顯色、暗室曝光。以GAPDH為內(nèi)參,利用Quantity One軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值×100%。

Tab1 Primer sequences

1.2.5CCK-8實驗檢測HEp-2細胞存活率 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞,加入100 μL CCK-8試劑,37 ℃孵育1 h,檢測450 nm處的吸光度值,計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測HEp-2細胞凋亡率和線粒體膜電位 HEp-2細胞培養(yǎng)48 h后,收集細胞,用冰冷的PBS洗滌兩次,并在70%冰冷的乙醇中在4 ℃下固定過夜。在PBS中再水化15 min后,將細胞在黑暗中用PI溶液染色30 min,通過流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率。HEp-2細胞培養(yǎng)24 h后,2 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入500 μL的JC-1工作液,37 ℃下孵育20 min。2 000 r·min-1離心5 min,棄上清,緩沖液洗滌細胞,并重懸,用流式細胞儀分析各組HEp-2細胞線粒體膜電位。線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中,形成聚合物,呈紅色熒光。線粒體膜電位較低時,JC-1為單體,不能聚集在線粒體基質(zhì)中,呈綠色熒光。線粒體膜電位用紅色熒光細胞的比例表示。

1.2.7檢測HEp-2細胞中ATP水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞的培養(yǎng)液上清,加入ATP檢測溶液,用多功能酶標儀測量發(fā)光強度。隨后根據(jù)標準曲線計算ATP含量(nmol·mg-1蛋白)。

1.2.8MitoSOX染色檢測線粒體活性氧(mtROS)水平 HEp-2細胞培養(yǎng)24 h后,加入終濃度5 μmol·L-1的MitoSOX工作液,37 ℃避光孵育20 min,PBS洗滌,加入DAPI工作液,室溫避光孵育15 min,PBS洗滌,激光共聚焦顯微鏡下觀察。紅色為mtROS,藍色為細胞核。

1.2.9ELISA檢測HEp-2細胞炎性因子分泌水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組HEp-2細胞的培養(yǎng)液上清,按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA NRAV對RSV感染HEp-2細胞的影響qRT-PCR檢測LncRNA NRAV的轉(zhuǎn)染效率,pcDNA3.1-NRAV組中NRAV表達水平明顯高于sh-lncRNA NRAV組與NC-lncRNA NRAV組(P<0.05),而sh-lncRNA NRAV組最低(P<0.05)(Fig1A)。過表達NRAV使RSV活性基因RSV-F、NS2明顯升高(P<0.05),敲低NRAV后活性降低(Fig1B)。pcDNA3.1-NRAV組細胞活性最低,凋亡率最高(P<0.05),sh-lncRNA NRAV組結(jié)果相反(Fig1C-E)。過表達NRAV可以抑制感染RSV的HEp-2細胞的活性,促進病毒復制,并促進感染細胞凋亡。

Fig1 Effect of LncRNA NRAV on RSV infection in HEp-2 cells

2.2 BE對RSV感染HEp-2細胞中NRAV和PI3K/AKT信號通路的影響RSV感染后明顯降低了HEp-2細胞中的NRAV表達水平,BE處理后進一步降低了NRAV的表達水平,且呈劑量依賴性(P<0.05)(Fig2A)。信號通路檢測結(jié)果顯示,RSV感染HEp-2細胞后,細胞中PI3K、AKT蛋白的表達水平成功上調(diào),PI3K/AKT信號通路被激活,Control組HEp-2細胞中PI3K、AKT的表達水平最低(P<0.05)。與RSV組相比,BE組干預的3組細胞中PI3K、AKT蛋白表達水平均下降,且隨濃度的增加其表達量呈劑量依耐性降低(P<0.05)(Fig2B、C)。

Fig2 Effect of BE on NRAV and PI3K/AKT signaling pathways in RSV infected HEp-2 cells

2.3 過表達NRAV、激活PI3K/AKT通路逆轉(zhuǎn)BE引起的通路抑制RSV感染HEp-2細胞后,BE抑制了由病毒感染引起的PI3K/AKT信號通路激活(P<0.05)。PI3K激活劑740Y-P處理后,逆轉(zhuǎn)了BE對RSV感染HEp-2細胞中PI3K/AKT信號通路的抑制作用,PI3K、AKT的表達水平明顯升高(P<0.05)。過表達NRAV同樣可以逆轉(zhuǎn)BE對RSV感染HEp-2細胞中PI3K/AKT信號通路的抑制作用,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與740Y-P處理組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(Fig3)。

Fig3 Overexpression of NRAV and activation of PI3K/AKT pathway reverse pathway inhibition caused by BE

2.4 過表達NRAV、激活PI3K/AKT通路加重線粒體損傷RSV感染降低了HEp-2細胞的ATP、線粒體膜電位(P<0.05),并明顯增加了HEp-2細胞的mtROS水平(P<0.05)。BE處理則增加了RSV感染HEp-2細胞的ATP、線粒體膜電位(P<0.05),并降低了HEp-2細胞的mtROS水平(P<0.05)。PI3K激活劑740Y-P處理、過表達NRAV均可逆轉(zhuǎn)BE對RSV感染HEp-2細胞ATP、線粒體膜電位、mtROS水平的影響(P<0.05),加重了線粒體損傷(Fig4)。

Fig4 Overexpression of NRAV and activation of PI3K/AKT pathway exacerbate mitochondrial damage

2.5 過表達NRAV、激活PI3K/AKT通路降低線粒體自噬水平BE干預明顯增加了RSV感染HEp-2細胞線粒體自噬標志蛋白PINK1、Parkin、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、BNIP3的表達水平(P<0.05),降低了p62的表達水平(P<0.05),誘導PINK1/Parkin、BNIP3途徑共同介導了線粒體自噬,減輕細胞損傷。PI3K激活劑740Y-P處理、過表達NRAV則逆轉(zhuǎn)了BE對自噬標志蛋白的影響(Fig5)。

Fig5 Overexpression of NRAV and activation of PI3K/AKT pathway reduce mitochondrial autophagy levels

2.6 過表達NRAV、激活PI3K/AKT通路增加凋亡率、加重炎癥反應(yīng)RSV組凋亡率為27.22%,與Control組相比細胞損傷嚴重(P<0.05)。BE干預后,細胞活性升高,細胞凋亡率降低至9.75%(P<0.05)。通路激活劑740Y-P和過表達pcDNA3.1-NRAV質(zhì)粒干預后,細胞活性降低,而細胞凋亡率又分別上升至18.58%和22.98%,細胞損傷嚴重(P<0.05)(Fig6A-C)。BE干預后明顯抑制了炎性小體的活性(P<0.05),而通路激活劑740Y-P和過表達pcDNA3.1-NRAV質(zhì)粒的干預,逆轉(zhuǎn)了BE的作用效果,炎性小體被再次活化,加重了細胞的炎癥反應(yīng)(Fig6D-F)。

3 討論

RSV是在人類中廣泛流行的病原體,目前尚缺乏特效的藥物,嚴重威脅人類健康,對RSV抗病毒分子機制的研究將為未來抗病毒藥物的研發(fā)提供新靶點和新方向。BE作為一種傳統(tǒng)的中藥提取物,在多種病毒感染性疾病中表現(xiàn)出顯著的抗病毒功效。研究表明,BE可以有效地靶向抑制宿主AP1和阻斷病毒蛋白,發(fā)揮對HPV的抗病毒能力[6],并通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性抑制HIV的復制[7],通過誘導線粒體自噬,降低線粒體ROS的產(chǎn)生,進而抑制IAV引發(fā)的炎癥反應(yīng)[8]。眾所周知,病毒感染過程及許多抗病毒藥物的藥理機制還涉及LncRNAs的調(diào)控,NRAV在RSV、IAV感染期間明顯下調(diào),過表達NRAV可促進RSV在A549和BEAS-2B細胞中的復制,促進IAV的復制和毒力,NRAV的下調(diào)可能是宿主抗病毒先天免疫反應(yīng)的一部分[4,9]。而我們過往的研究還發(fā)現(xiàn),BE可以通過NRAV、RAB5C靶向競爭結(jié)合miR-299-3p,抑制JNK/p38 MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路提高HSV-1感染HEp-2細胞的存活率,并降低凋亡率[10]?；谏鲜鼋Y(jié)果,本研究從過表達NRAV和激活PI3K/AKT信號通路入手,探究BE對RSV感染HEp-2細胞的影響。

在本研究中,過表達NRAV后,感染RSV的HEp-2細胞活性降低,凋亡率增加,促進了病毒復制,而敲低NRAV則出現(xiàn)了完全相反的結(jié)果。NRAV的過表達,能夠使RSV大量增殖,破壞宿主的正常細胞結(jié)構(gòu),促使細胞的加速凋亡,從而造成一系列的炎癥反應(yīng)與病理損傷產(chǎn)生。RSV感染細胞后,宿主激活先天免疫反應(yīng)使NRAV的表達水平明顯降低,BE干預處理可進一步降低RSV感染的HEp-2細胞NRAV表達水平,結(jié)果表明NRAV可能參與BE的抗病毒過程。

研究發(fā)現(xiàn),在許多病毒感染期間PI3K/AKT信號通路會被病毒激活,并進一步促進病毒入侵和復制[11]。在病毒感染早期,進入宿主細胞后病毒為了在宿主細胞內(nèi)有效的增殖,采取了激活PI3K/AKT信號通路促進感染細胞生存的策略,使病毒在細胞死亡之前能夠大量增殖。細胞的抗病毒先天免疫反應(yīng)通過抑制PI3K/AKT信號通路促進感染細胞凋亡[5],抑制病毒的復制。研究發(fā)現(xiàn)NRAV的表達水平隨BE濃度的增加而降低,PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達水平隨BE濃度的增加而降低,推測BE通過上述分子機制發(fā)揮對RSV的抗病毒作用。進一步用PI3K激活劑740Y-P處理后,在BE的作用下通路蛋白的表達水平仍然明顯升高,逆轉(zhuǎn)了BE對病毒感染HEp-2細胞中PI3K/AKT信號通路的抑制作用,而過表達NRAV也得到了同樣的抑制結(jié)果。通過上述實驗可知,在過表達NRAV以及激活PI3K/AKT信號通路后,BE對PI3K/AKT信號通路的抑制作用被逆轉(zhuǎn),BE則可能通過下調(diào)NRAV并抑制PI3K/AKT信號通路抑制RSV的感染能力。

病毒感染致細胞損傷與線粒體受損有關(guān)。受損線粒體的膜電位降低進一步導致ATP合成受阻,且釋放ROS,導致ROS大量積累,進而誘導細胞與組織損傷[12]。線粒體損傷受線粒體自噬的調(diào)控,線粒體自噬是一種專一降解損傷或老化線粒體的選擇性自噬,其對維持線粒體數(shù)量及正常功能、保持線粒體ROS平衡非常重要[13],并且在抵御病原體感染中發(fā)揮重要作用。PINK1/Parkin通路和BNIP3通路的激活均可介導自噬小體對損傷線粒體的識別和包裹,進而誘導線粒體自噬[14-15]。在本研究中,RSV感染HEp-2細胞后,線粒體內(nèi)膜兩側(cè)外正、內(nèi)負的線粒體膜電位下降,線粒體膜電位的異常影響氧化磷酸化和線粒體ATP合成,同時釋放了大量的ROS,導致HEp-2細胞的線粒體嚴重受損。PINK1在線粒體外膜積累,進一步招募Parkin并泛素化受體蛋白和適配器蛋白,PINK1/Parkin和介導的線粒體自噬被激活。在BE干預后,線粒體功能得到了恢復,線粒體膜電位升高、ATP水平升高、ROS水平降低,PINK1/Parkin和BNIP3介導的線粒體自噬均被激活,BE改善了線粒體功能,維持了線粒體的穩(wěn)定。而740Y-P處理和過表達NRAV后,在BE的作用下線粒體膜電位降低、ATP合成減少、細胞中ROS水平升高,線粒體功能仍然受損,線粒體自噬蛋白水平降低,自噬通路被抑制,逆轉(zhuǎn)了BE對RSV感染HEp-2細胞線粒體功能的改善作用。過表達NRAV對線粒體功能損傷的程度要大于740Y-P激活PI3K/AKT信號通路后對線粒體的損傷程度。有文獻顯示[16],抑制PI3K/AKT信號通路可通過促進線粒體自噬,促進線粒體功能恢復,進而減輕細胞損傷。因此,結(jié)合本次研究的結(jié)果可知,BE可能通過下調(diào)NRAV并抑制PI3K/AKT信號通路提高線粒體膜電位、提高ATP水平、降低mtROS水平,激活線粒體自噬,改善RSV導致的線粒體功能障礙和細胞損傷。

為進一步研究NRAV與PI3K/AKT信號通路在BE抗RSV病毒過程中的作用,本研究進行了細胞增殖、凋亡水平、炎癥反應(yīng)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BE處理可增加RSV感染HEp-2細胞的存活率并降低凋亡率。740Y-P處理或過表達NRAV可逆轉(zhuǎn)BE對RSV感染的HEp-2細胞增殖、凋亡的影響。表明NRAV與PI3K/AKT信號通路可促進RSV感染導致的HEp-2細胞損傷。BE減輕RSV致HEp-2細胞損傷的機制可能與BE下調(diào)NRAV和PI3K/AKT信號通路通路有關(guān)。NLRP3炎性小體能被多種類型的病原體或危險信號激活,在機體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有重要作用,是機體介導免疫炎癥的關(guān)鍵調(diào)控因子。病毒感染后,線粒體損傷會釋放大量ROS,進而使NLRP3炎性小體過度活化,促進IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子成熟釋放,誘導細胞高炎癥狀態(tài),導致細胞損傷,進而發(fā)生細胞凋亡[17]。大量的研究證明,NLRP3炎性小體的過度活化是病毒感染導致細胞損傷的重要原因之一[18]。研究顯示,RSV感染可明顯提高HEp-2細胞內(nèi) NLRP3、ASC、caspase-l蛋白表達及IL-1β、L-6、IL-8、TNF-α分泌水平,導致 NLRP3 炎性小體過度活化,使感染細胞的存活率降低,這與既往病毒感染的結(jié)果相似。BE干預可降低RSV感染HEp-2細胞內(nèi)NLRP3、ASC、caspase-l蛋白表達及炎性因子分泌水平,抑制NLRP3 炎性小體活化。740Y-P處理或過表達NRAV可再次激活炎性小體、促進炎性因子分泌,逆轉(zhuǎn)了BE抑制RSV感染的HEp-2細胞炎癥反應(yīng)的作用。結(jié)果提示BE可能通過下調(diào)NRAV并抑制PI3K/AKT信號通路抑制NLRP3炎性小體活化對RSV感染HEp-2細胞起保護作用。

綜上所述,過表達NRAV和激活PI3K/AKT信號通路可以逆轉(zhuǎn)BE改善線粒體功能、激活線粒體自噬、增加細胞活性、降低細胞凋亡率、減輕炎癥反應(yīng)等作用。BE減輕RSV感染所致HEp-2細胞損傷,其機制可能與BE下調(diào)NRAV和PI3K/AKT信號通路,進而激活線粒體自噬、降低線粒體損傷與炎癥反應(yīng)有關(guān)。然而,BE的抗病毒作用可能不僅僅是通過上述機制進行的,可能是由其他細胞機制共同作用的結(jié)果,針對這一點將在后續(xù)的研究中進行更多的驗證,以全面了解BE對RSV的抗病毒分子機制。