楊 凡, 邵軼群, 賈默然, 聶偉東, 王田田, 彭 煜

(上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,上海 200080)

膀胱癌(bladder cancer, BC)是世界上最常見的一種泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。目前,BC的治療包括根治性膀胱切除術、放療和化療。然而,約有5%的患者在診斷時有遠處轉移。晚期或轉移性BC的治愈效果差、預后差,接受一線鉑類化療的患者1年總生存率僅為36%[2]。因此,迫切需要有效抑制BC而又有較低毒副作用的藥物。

重樓皂苷Ⅶ(paris saponin Ⅶ, PSII)是一種從傳統(tǒng)中草藥延齡草中分離出來的甾體皂苷,已經成為了一種潛在的抗癌劑。PSII通過抑制小鼠肺腺癌的基質金屬酶來抑制肺癌轉移,激活caspase-2和線粒體的功能障礙誘導HT-29細胞的凋亡[3-4]。然而,目前PSII對BC發(fā)生的影響及其內在機制仍不清楚。在這項研究中,我們的目的為探究PSII在體外對BC細胞的潛在細胞毒性作用及其作用機制,以期為BC的治療和新藥開發(fā)提供理論依據。

1 材料

T24和5637細胞株購于上海中科院細胞庫。PSII購于四川省維克奇;N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine, NAC)、 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)購于MedChemExpress;細胞凋亡檢測試劑盒,DCFH-DA熒光探針購于上海翌圣;Bax、Bcl-2、LCB-II、Beclin 和P62一抗購買于Cell signing technology;MitoSOXTM線粒體超氧化物指示劑購買于賽默飛。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)T24和5637細胞培養(yǎng)于用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素),細胞培養(yǎng)于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱。

2.2 CCK-8法檢測細胞活力 PSII處理24 h后使用CCK-8檢測細胞活力。

2.3 克隆形成實驗細胞接種于12孔板,過夜貼壁后,加入PSII進行干預;培養(yǎng)12 d后,用4%多聚甲醛固定,隨后加入結晶紫溶液染色,拍照。

2.4 流式細胞檢測細胞凋亡PSII處理24 h后,加入Annexin V和PI染液,孵育15 min后,上流式細胞儀檢測。

2.5 GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉細胞株構建按照說明書轉染構建GFP-mRFP-LC3B穩(wěn)轉細胞株。加入PSII后,使用共聚焦進行拍照。

2.6 Western blot檢測使用RIPA裂解細胞,BCA試劑盒測定總蛋白的濃度。使用SDS-PAGE凝膠電泳方法分離蛋白,轉移至PVDF膜上,使用5% BCA封閉1 h,4 ℃孵育一抗過夜。

2.7 流式細胞檢測細胞ROS和線粒體ROS不同濃度PSII孵育24 h。收集細胞,加入DCFH-DA或MitoSox Red (5 μmol·L-1),37 ℃孵育30 min,流式細胞儀檢測。

2.8 ROS抑制劑NAC干預實驗預給藥PSII 2 h,隨后NAC干預22 h。實驗結束后每孔加入CCK-8檢測細胞活力。

3 結果

3.1 PSII增強BC細胞毒PSII處理后,顯著降低細胞存活率,并且具有濃度依賴性。IC50值分別為7.76、9.88 μmol·L-1。同時,與對照組相比,PSII明顯降低細胞克隆形成能力。

3.2 PSII誘導BC細胞凋亡與空白組相比,PSII組細胞凋亡增加。Western blot結果顯示, PSII組細胞Bax與Bcl-2的比值明顯減少(P<0.05)。

3.3 PSII增強T24細胞中自噬流PSII處理后細胞顯示明顯的熒光信號,誘導細胞發(fā)生自噬。

3.4 PSII刺激BC細胞自噬相關蛋白表達水平PSII處理后,顯著增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達,降低p62蛋白表達(P<0.05)。

3.5 PSII誘導T24細胞中及線粒體ROS產生PSII促進T24細胞及線粒體產生ROS,且具有顯著性差異(P<0.05)。

3.6 清除ROS減輕PSII誘導的T24細胞凋亡和自噬NAC干預后,PSII的促細胞凋亡效果被減弱。與PSII組比較,PSII+NAC組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達明顯降低(P<0.05),P62蛋白表達明顯增加(P<0.05)。

4 討論

過度的自噬被認為是一種潛在的腫瘤抑制途徑,能夠誘導癌細胞的程序性死亡[5]。在自噬體的形成過程中,LC3-Ⅰ被修飾并轉化為LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比例與自噬程度有關。Beclin1調控自噬體的形成和成熟。同時,P62蛋白在自噬體的形成過程中被降解,P62蛋白的表達與自噬活性呈負相關關系。腺病毒感染的目標細胞可以有效地表達紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)和LC3B蛋白的融合蛋白[6]。通過觀察GFP-mRFP-LC3B融合蛋白的顏色,顯示細胞的自噬流。有證據表明,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的過度產生會誘導氧化應激啟動凋亡途徑,從而導致BC細胞的死亡[7]。因此,ROS水平可能是大量導致癌細胞凋亡的抗腫瘤化合物的關鍵指標。

綜上所述,PSII能夠顯著抑制BC細胞的增殖,誘導其凋亡和自噬,其機制與ROS密切相關。該研究擴展了對PSII在抗腫瘤方面的研究,為進一步研究和開發(fā)PSII提供了參考。