金 晶,李佩雙,丁志玲,彭佳華,劉淑娟,梁瑞寧,5

(1. 江西中醫(yī)藥大學研究生院,江西 南昌 330004;2. 江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006;3. 江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)婦產(chǎn)科學研究所,江西 南昌 330006;4. 江西中醫(yī)藥大學附屬生殖醫(yī)院,江西 南昌 330001;5. 江西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一類高度異質(zhì)性疾病,以雄激素過高、排卵障礙和卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕R床特征,是導致育齡期女性月經(jīng)失調(diào)和不孕的重要原因。目前,治療PCOS大多采用激素、手術或生活方式干預,但存在治療周期長、并發(fā)癥多、療效欠佳等問題。中醫(yī)藥在治療PCOS中有獨特的優(yōu)勢,主要通過中藥口服,結(jié)合針灸治療、針藥結(jié)合、中醫(yī)綜合療法以及中西醫(yī)結(jié)合治療等多種方法,整體而觀,辨證論治,因人制宜,從“因”調(diào)節(jié)內(nèi)分泌,補充西醫(yī)治療的不足,其療效確切且副作用小,更有助于緩解PCOS癥狀[1]。

PCOS屬中醫(yī)“閉經(jīng)”、“不孕”、“癥瘕”等范疇,本課題組結(jié)合多年的臨床治療,認為PCOS病機多為腎虛兼濕熱、痰濁、瘀血,也即腎虛為本,痰瘀濕濁等為標,致沖脈血氣“逆盛”[2]。前期研究發(fā)現(xiàn),滋腎清熱利濕化瘀方(Zishen Qingre Lishi Huayu Prescription,ZQLHP)(簡稱滋腎方)能有效提高PCOS患者自主排卵率及有排卵月經(jīng)的發(fā)生率,并能改善痤瘡及降低血清睪酮水平[3]。盡管滋腎方體現(xiàn)了中藥復方多靶點的優(yōu)勢,但其主要發(fā)揮作用的化學成分或其作用機制尚不明確。網(wǎng)絡藥理學作為一種能夠有效預測中藥以及中醫(yī)復方靶點的研究方法,為中醫(yī)復方研究提供了新的視角?；诖?本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學、分子對接技術及實驗驗證探索滋腎方干預PCOS的機制,為滋腎方的臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 雌性C57BL/6J小鼠40只,SPF級,3周齡,體質(zhì)量(10±2)g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2藥物 滋腎方(知母10 g,山茱萸10 g,丹參10 g,桃仁10 g,薏苡仁15 g,白芥子10 g,黃柏10 g,玄參10 g,甘草6 g),購自于江西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院。枸櫞酸氯米芬片,購自高特制藥有限公司,批號:Q1102。

1.1.3試劑與儀器 來曲唑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號:211130KL)。白介素-6(interleukin-6,IL-6)(批號2209M31)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)(批號2209M18)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)(批號2209M29)購于江蘇酶免實業(yè)有限公司。磷酸化蛋白激酶(phosphorylation AKT serine/threonine kinase,p-AKT)抗體(批號P2215051),AKT抗體(批號:A3321120),磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylation mitogen-activated protein kinase p38,p-p38MAPK)抗體(批號8690S),p38MAPK抗體(批號9216s),磷酸化信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylation signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)抗體批號ab76315),STAT3抗體(批號ab68153),分別購于翌圣和Abcam公司。伯樂電泳儀(Biorad公司);凝膠成像系統(tǒng)(Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1網(wǎng)絡藥理學分析

1.2.1.1 滋腎方活性成分及靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和BATMAN數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)檢索滋腎方有效成分。在TCMSP中檢索與成分相關的靶基因,預測藥物有效成分的作用靶點。

1.2.1.2 PCOS靶點的預測 分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、DisGENET(https://www.disgenet.org/)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(http://www.pharmgkb.org)、DRUGBANK(https://go.drugbank.com/)搜索“Polycystic ovary syndrome”檢索疾病靶點。

1.2.1.3 篩選共同靶點 將藥物與疾病獲得的相關靶點輸入微生信在線平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/),得到共同靶點,繪制Venn圖。

1.2.1.4 藥物-活性成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡圖構(gòu)建 將滋腎方中藥有效成分及方藥疾病交集靶點導入Cytoscape 3.9.0軟件,構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在作用靶點”可視化網(wǎng)絡圖,Network Analyzer插件行網(wǎng)絡拓撲分析,篩查滋腎方治療PCOS的核心活性成分。

1.2.1.5 構(gòu)建潛在作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡 將滋腎方與PCOS的交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫,建立蛋白互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡。將結(jié)果導入Cytoscape 3.9.0并應用CytoNCA 插件對網(wǎng)絡進行拓撲分析,按照節(jié)點的Degree值調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中節(jié)點的屬性。

1.2.1.6 GO富集與KEGG通路分析 將滋腎方治療PCOS潛在作用靶點導DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),制作GO功能和KEGG富集分析。篩選出前20名KEGG通路和前10名GO生物學功能進行可視化。

1.2.1.7 分子對接驗證 根據(jù)“藥物-活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡,將重要活性成分與PPI中前3位核心靶點進行分子對接驗證。應用PubChem數(shù)據(jù)庫中下載活性成分2D結(jié)構(gòu),PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中下載靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)。在ChemBio3D軟件優(yōu)化活性成分并存為“mol2”格式。AutoDockVina與PyMOL軟件進行分子對接驗證與可視化制圖。

1.2.2動物實驗

1.2.2.1 動物分組及造模給藥 將40只小鼠按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、滋腎方(ZQLHP)組和枸櫞酸氯米芬(clomiphene citrate,CC)組,每組10只。除正常組外,其余各組小鼠均予以1 mg·kg-1·d-1LET溶液灌胃誘導PCOS小鼠模型[4-5],連續(xù)21 d,正常組給予等容積生理鹽水。造模第11天開始連續(xù)10 d觀察小鼠陰道脫落細胞的變化,根據(jù)小鼠動情周期的變化以及LET造模后,隨機挑選2只小鼠處死后,HE染色觀察卵巢組織卵泡是否呈囊狀樣改變,以確認模型是否構(gòu)建成功。造模成功后,第22天開始給予相應劑量藥物灌胃,根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量,滋腎方11.8 g·kg-1·d-1灌胃。枸櫞酸氯米芬組1 mg·kg-1·d-1,正常組和模型組給予等容積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)給藥14 d。

1.2.2.2 蘇木精-伊紅染色觀察卵巢組織病理 對小鼠卵巢組織進行固定、脫水、包埋、切片和染色等處理后,使用光學顯微鏡觀察其病理變化。

1.2.2.3 ELISA檢測IL-6、IL-10和TNF-α水平 按照ELISA試劑盒說明書步驟操作,采用酶標儀于450 nm波長下測定吸光度A,檢測小鼠外周血中IL-6、IL-10和TNF-α水平。

1.2.2.4 Western blot檢測卵巢組織p-AKT、AKT、p-p38MAPK、p38MAPK、 p-STAT3和STAT3蛋白表達 取各組小鼠卵巢組織研磨后,RIPA裂解緩沖液中裂解1 h后,超速冷凍離心機4 ℃,13 000 r·min-1離心30 min取上清。BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,根據(jù)β-actin(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、AKT(1 ∶1 000)、p-p38MAPK(1 ∶1 000)、p38MAPK(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)抗體說明書進行抗體稀釋,4 ℃孵育過夜后,加入相應的二抗,室溫反應2 h,ECL超敏溶液顯影,采用ImageJ圖像處理軟件計算對應凝膠條帶的灰度值,與內(nèi)參的吸光度比值用于統(tǒng)計分析。

1.2.2.5 免疫組織化學觀察卵巢組織中p-AKT、p-p38MAPK和p-STAT3蛋白表達 取各組小鼠卵巢組織,采用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片為4 μm。在檸檬酸緩沖液中進行孵育,冷卻至室溫后,使用5% BSA阻斷非特異性結(jié)合。p-AKT(1 ∶500)、p-p38MAPK(1 ∶500)和p-STAT3(1 ∶500)抗體稀釋后,4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育30 min,PBS清洗后,使用DAB顯色。最后使用光學顯微鏡獲取圖像,并使用ImageJ Pro Plus軟件對圖像進行光密度分析。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡藥理學研究結(jié)果

2.1.1滋腎方有效成分與相關靶點 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索與OB、DL參數(shù)篩選,最終得到滋腎方456個化合物及其361個作用靶點。其中知母15個化合物,山茱萸20個化合物,丹參59個化合物,桃仁23個化合物,薏苡仁9個化合物,白芥子4個化合物,黃柏37個化合物,玄參9個化合物,甘草280個化合物。篩出排名前10的化合物信息如Tab1?；谧棠I方有效成分從TCMSP與SWISS平臺搜集預測靶點,篩除重復項后共有361個藥物靶點。

Tab1 The top 10 compounds with degree values and OB and DL values in formula for ZQLHP

2.1.2PCOS相關靶點與滋腎方治療的潛在作用靶點 通過GeneCards、OMIM、DisGENET、PharmGKB和DRUGBANK 5個數(shù)據(jù)庫共收集到PCOS疾病相關靶點1 397個,將滋腎方藥物靶點與疾病靶點取交集制作韋恩圖,得到125個交集靶點見Fig1,即滋腎方治療PCOS的潛在作用靶點。

Fig1 Venn diagram of potential targets of action of ZQLHP for treatment of PCOS

2.1.3“藥物-活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡 將滋腎方中活性成分與疾病的125個交集靶點導入 Cytoscape 3.9.0 軟件,與中藥成分關聯(lián)進行可視化。根據(jù)degree值大小調(diào)節(jié)節(jié)點的大小并排序,degree與節(jié)點大小成正比,共包括580個節(jié)點和3 598條邊(Fig2)。網(wǎng)絡拓撲分析計算化合物的度值,列出度值排名前10 位的化合物見Tab2?？梢缘弥纹に?quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)是幾味中藥的共有成分,且OB 值及 DL 值遠高于篩選標準值,推測槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等是滋腎方治療PCOS的核心活性成分。

Fig2 Drug-component-target visualization network for treatment of PCOS with ZQLHP

Tab2 Information table of top 10 compounds in formula for ZQLHP

2.1.4滋腎方治療PCOS的PPI網(wǎng)絡構(gòu)建 將滋腎方與PCOS相重合的125個關鍵靶點導入String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(Fig3),該網(wǎng)絡共有108個節(jié)點,371條邊;將其結(jié)果導入 Cytoscape3.9.0軟件進行網(wǎng)絡可視化分析,根據(jù)Degree值大小對125個關鍵靶點進行排序,靶點顏色越深代表靶點相關度越高(Fig4)。同時利用 CytoNCA 插件工具分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù),結(jié)合度值(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closenesss)篩選核心靶點,結(jié)果顯示3項參數(shù)均較高的核心靶點有MAPK3、AKT1、STAT3、IL-6、TP53、INS、CASP3等,表明這些蛋白在網(wǎng)絡圖中貢獻度高,在滋腎方治療PCOS疾病中起到重要作用。

Fig3 PPI protein interaction network for intersecting therapeutic targets

Fig4 Visualization of PPI protein interaction network for intersecting therapeutic targets

2.1.5關鍵靶點的GO功能富集和KEGG通路富集分析 對滋腎方治療PCOS的125個潛在靶點進行GO基因本體論分析,GO 功能富集分析包括生物過程 (BP)、分子功能(MF)和細胞組分(CC)3 個方面。結(jié)果顯示共富集到663條BP條目,64條CC條目,119條MF條目。其中富集基因數(shù)量最多的條目為negative regulation of apoptotic process,plasma membrane,protein binding,分別分布了31、56、115個基因。設置P<0.05,根據(jù)P值排序后,選取排名前10的條目繪制條形圖(Fig5)。

Fig5 GO analysis of intersectional therapeutic targets of ZQLHP for PCOS

利用DAVID數(shù)據(jù)庫做125個交集靶點的KEGG通路富集分析,共富集出156條KEGG通路。結(jié)合顯著性程度與Count值,滋腎方治療PCOS的潛在作用靶點主要在PI3K-Akt signaling pathway,TNF signaling pathway,pathways in cancer等信號通路,設置P<0.01,根據(jù)P值與Count值排序后選取排名前 20 位的條目繪制氣泡圖(Fig6)。

Fig6 Visualization of PPI protein interaction networks for intersecting therapeutic targets

2.1.6分子對接驗證 根據(jù)前期結(jié)果,取排名前3化合物與關鍵交集靶點行分子對接,即槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇與STAT3、AKT1、MAPK3。結(jié)果顯示滋腎方核心成分與關鍵靶點結(jié)合能均小于-5.0 kcal·mol-1,表明配體與受體蛋白結(jié)合穩(wěn)定,藥物關鍵成分與核心靶點具有良好親和力,在疾病治療中發(fā)揮關鍵作用。見結(jié)合能(Tab3)與分子對接圖(Fig7)。

Fig7 Diagram of molecular docking between core ingredients and key targets of ZQLHP

Tab3 The binding ability of key components of ZQLHP to target gene molecules

2.2 動物水平實驗結(jié)果

2.2.1滋腎方對PCOS小鼠體重、卵巢組織病理學影響 如Fig8所示。與正常組比較,模型組小鼠體質(zhì)量增加(P<0.05),與模型組比較,ZQLHP組小鼠體質(zhì)量降低(P<0.01)。病理學觀察發(fā)現(xiàn),正常組可見卵泡的顆粒細胞層較多且排列緊密,內(nèi)可見卵母細胞。模型組卵巢切片可見顆粒細胞層數(shù)減少,小卵泡和閉鎖卵泡數(shù)量增多,黃體數(shù)量減少。與模型組相比,各治療組給藥14 d后內(nèi)見黃體,顆粒細胞排列正常及不同等級發(fā)育的優(yōu)勢卵泡。各組卵巢組織黃體及囊性卵泡數(shù)量統(tǒng)計可見,與正常組相比,模型組黃體數(shù)量下降(P<0.01),囊性卵泡數(shù)量明顯升高(P<0.05),與模型組相比,給藥組黃體數(shù)量增加(P<0.01),囊性卵泡數(shù)量明顯減少(P<0.05),ZQLHP組與CC組無差異,結(jié)果提示ZQLHP可明顯緩解PCOS小鼠卵巢病理損傷。

Fig8 Evaluation of efficacy of ZQLHP in PCOS model

2.2.2滋腎方對PCOS小鼠IL-6、IL-10和TNF-α水平的影響 如Fig9所示,與正常組比較,模型組小鼠IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01),IL-10水平下降(P<0.01);給藥治療后與模型組比較,IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05,P<0.01),IL-10水平上升(P<0.01),ZQLHP組與CC組無差異。

Fig9 Effect of ZQLHP on levels of IL-6, IL-10 and TNF-α in PCOS model

2.2.3滋腎方對PCOS小鼠AKT/p38MAPK/STAT3蛋白的影響 如Fig10和Fig11所示,與正常組比較,模型組小鼠卵巢組織中p-AKT蛋白表達量下降(P<0.05或P<0.01),p-p38MAPK和p-STAT3蛋白表達上升(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,給藥組小鼠卵巢組織p-AKT蛋白表達上升(P<0.05或P<0.01)、p-p38MAPK和p-STAT3蛋白表達量下降(P<0.05或P<0.01),ZQLHP組與CC組無差異。

Fig11 Effect of ZQLHP on expression levels of p-AKT, p-p38MAPK and p-STAT3 proteins in PCOS model mice (immunohistochemistry, ×400)

3 討論

PCOS是青春期與育齡期婦女最為常見的代謝內(nèi)分泌疾病,流行病學調(diào)查顯示,我國育齡期女性患病率為5.6%,PCOS患者約占不孕人群的1/3[6]。追溯古籍,尚無PCOS病名相關的記載,然根據(jù)其癥狀可將其劃分為中醫(yī)“閉經(jīng)”、“不孕”、“癥瘕”等范疇。《校注婦人良方》有載:“婦人病有三十六種,皆由沖任勞損而致”,由此可知,沖任損傷是婦科疾病之總因。我們根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗認為,PCOS病位主要在腎與沖任,本病病機以腎陰虧虛為主,腎陰虧損則腎臟氣化不及,血脈失養(yǎng),燥熱內(nèi)生,水津不化釀生痰濁、濕熱、瘀血之邪,痰熱濕瘀內(nèi)阻于沖任為本病之標[7-8]。因此,本方以滋腎清熱利濕化瘀為治法,方中山茱萸酸溫補益肝腎,知母、黃柏、玄參滋陰清熱,佐以白芥子、薏苡仁健脾利濕,桃仁、丹參活血通經(jīng),甘草調(diào)和藥性。諸藥共同使用,共奏滋陰清熱,活血通經(jīng)之功,使腎陰得養(yǎng)、虛熱得清,血脈通暢,從而使治療效果得到進一步的提高。本實驗研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)滋腎方灌胃干預后,PCOS小鼠體質(zhì)量下降,卵巢病理損傷改善,黃體個數(shù)增多,囊性卵泡數(shù)量減少,顆粒細胞層數(shù)明顯改善。以上結(jié)果提示滋腎方能夠改善PCOS小鼠癥狀及體征,這與長期臨床實踐一致。

PCOS確切發(fā)病機制尚不清楚,但炎癥因子、內(nèi)分泌、代謝紊亂和顆粒細胞增殖凋亡等在其進展中起著關鍵作用。基于網(wǎng)絡藥理學分析結(jié)果顯示,滋腎方中共篩出456個活性成分,作用于361個靶點對PCOS發(fā)揮作用,包括槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等。研究表明槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善代謝功能、降低血清膽固醇等作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能降低肥胖患者巨噬細胞和脂肪細胞中炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的基因表達水平,降低胰島素抵抗作用,緩解PCOS癥狀[10]。同時,槲皮素通過下調(diào)TNF-α和IL-6提高卵母細胞的質(zhì)量,促進卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育[11]。β-谷甾醇可通過抑制IL-6、TNF-α和IL-1β的水平發(fā)揮抗炎作用。β-谷甾醇一項糞菌移植實驗研究表明,β-谷甾醇可以調(diào)節(jié)PCOS子宮內(nèi)膜容受性,協(xié)調(diào)性激素平衡,從而影響PCOS的病理過程[12]。此外,趙帥等[13]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可促進顆粒細胞增殖、抑制凋亡,其機制與AKT信號有關。豆甾醇也可通過抑制IL-6和IL-1等炎癥因子的表達發(fā)揮抗炎作用。慢性低度炎癥已被證實與PCOS的發(fā)生有關,促炎與抗炎因子的失調(diào)可延遲卵泡成熟并誘導類固醇生成異常[14]。本實驗研究同樣發(fā)現(xiàn),與正常組相比,PCOS模型組小鼠血清TNF-α和IL-6上調(diào),IL-10表達下調(diào),滋腎方干預逆轉(zhuǎn)了TNF-α、IL-6、IL-10表達趨勢,進一步證實,活化的TNF-α和IL-6細胞因子是誘導慢性炎性PCOS的關鍵因素,由此可見,平衡促炎與抗炎因子對于PCOS轉(zhuǎn)歸與預后密切相關。提示平衡促炎與抗炎因子對于PCOS轉(zhuǎn)歸與預后至關重要。因此,推測滋腎方的關鍵活性成分可能是通過抗炎機制發(fā)揮作用。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡及KEGG富集分析得到滋腎方治療PCOS的核心靶點主要包括MAPK3、AKT1、STAT3、IL-6、TP53、INS、CASP3等,潛在作用靶點主要富集在PI3K/AKT、TNF和癌癥相關通路。研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵巢中存在異常停滯生長的不成熟卵泡,AKT信號的激活有助于在卵泡發(fā)育過程中卵母細胞的成熟。此外,AKT信號通路中相關因子的改變會直接影響到卵巢組織的胰島素傳導以及糖代謝[15]。Hafizi等[16]研究表明PCOS與非PCOS患者減數(shù)分裂II期卵母細胞中,AKT1、AKT2無明顯差異,然給藥干預后AKT表達水平出現(xiàn)差異,AKT1、AKT2表現(xiàn)出與藥物的高度親和力。MAPK家族成員有4種,p38MAPK作為重要一員,磷酸化后被激活,發(fā)揮調(diào)控炎癥反應及細胞免疫的作用,是信號轉(zhuǎn)導過程中的關鍵蛋白。STAT3是STATs家族成員之一,研究發(fā)現(xiàn)在小鼠顆粒細胞分化過程中,STAT3是調(diào)節(jié)黃體生成素受體的關鍵信號。TNF-α和IL-6促炎細胞因子過度釋放可導致p38MAPK、STAT3激活,進而促進炎癥反應的發(fā)生[17],徐琴等[18]的研究發(fā)現(xiàn)通過抑制p38MAPK可以改善PCOS模型大鼠炎癥反應。p38MAPK、STAT3被多種因子激活,調(diào)節(jié)細胞生長過程以及與免疫反應相關的炎性細胞因子分泌,從而影響宿主后發(fā)生炎癥反應。此外,研究發(fā)現(xiàn),STAT3是AKT通路介導下游信號所必需的關鍵因子,抑制STAT3活性會反饋性激活AKT活性。分子對接驗證表明槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇與AKT、MAPK、STAT3結(jié)合活性較佳。實驗研究進一步證實,與正常組相比,PCOS模型組小鼠卵巢組織p-AKT表達水平下調(diào),p-p38MAPK和p-STAT3表達水平升高,經(jīng)滋腎方灌胃治療后,p-AKT表達水平上調(diào),p-p38MAPK和p-STAT3表達水平下降。

綜上,本文基于網(wǎng)絡藥理學方法構(gòu)建“滋腎方成分—靶點—PCOS”網(wǎng)絡,以期獲得滋腎方對PCOS的具體作用靶點及機制,通過動物實驗對所獲得的重要靶點進行驗證,結(jié)果表明滋腎方能夠有效改善PCOS小鼠癥狀及體征,平衡促炎、 抗炎因子的水平,可能是通過提高p-AKT表達水平和降低p-p38MAPK和p-STAT3表達水平,干預其下游的效應細胞來參與PCOS病理進展,進而改善PCOS。本研究通過動物實驗驗證了網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果,為滋腎方治療PCOS提供了科學依據(jù),并為滋腎方藥理機制研究提供了參考價值。然而,鑒于對PCOS病理生理機制的認識還不完善,且網(wǎng)絡藥理學存在局限性,本研究預測結(jié)果仍需進一步實驗驗證和探索。

(致謝:本文作者非常感謝以下老師提供的幫助,梁瑞寧教授構(gòu)思并設計了實驗,生殖醫(yī)學科劉淑娟主任提供了寶貴建議,劉端勇教授對于本文手稿進行了的指導。)