孫 魁, 陳 攀, 劉永萱, 康永安, 吳曉爽, 程月月, 程浩東,劉其偉, 高社干, 齊義軍*

(1)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院,腫瘤醫(yī)院,省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南, 洛陽 471003;2)許昌學(xué)院醫(yī)學(xué)院細(xì)胞行為學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南, 許昌 461000)

蛋白酶體(proteasome)是具有蛋白質(zhì)水解酶活性的26S多亞基大分子復(fù)合物,包含1個20S核心顆粒和2個19S調(diào)節(jié)顆粒,其普遍存在于生物體內(nèi),且可通過選擇性降解多聚泛素化修飾的蛋白質(zhì)分子,維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[1]。除了19S調(diào)節(jié)顆粒外,PA28(包含PA28α、PA28β、PA28γ等3種亞型)、PA200等復(fù)合物均能調(diào)節(jié)蛋白酶體活性[2]。蛋白酶體功能紊亂引起泛素化蛋白質(zhì)的異常積聚,不僅影響細(xì)胞正常功能,還與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3,8]。除了蛋白酶體系統(tǒng),自噬-溶酶體系統(tǒng)是真核生物中另一種蛋白質(zhì)降解途徑。正常生理?xiàng)l件下,蛋白酶體系統(tǒng)主要降解K48連接的多聚泛素化蛋白質(zhì)底物,而自噬-溶酶體系統(tǒng)降解的蛋白質(zhì)底物主要由K63多聚泛素鏈標(biāo)記[4]。盡管如此,蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)并非完全獨(dú)立、互不影響的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng),而是相互補(bǔ)充或協(xié)同作用,共同維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[22]。研究表明,Bortezomib(蛋白酶體抑制劑)和Tubacin(HDAC6自噬抑制劑)聯(lián)合作用于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白質(zhì)明顯升高,胱天蛋白酶8(caspase-8)和PARP(poly ADP-ribose polymerase)剪切體也同時升高,細(xì)胞凋亡增加[6]。因此,同時抑制蛋白酶體和自噬-溶酶體的功能,消除二者的互補(bǔ)代償作用,能夠誘導(dǎo)聯(lián)合致死作用[6]。

PSME2(proteasome activator complex subunit 2,編碼PA28β蛋白)表達(dá)異常見于多種腫瘤,高表達(dá)的PSME2與HIF-1、TNF、IL-17、NF-κB等多個信號通路異常激活相關(guān),并引起細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用增強(qiáng)[17]。本文發(fā)現(xiàn),PSME2在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中表達(dá)上調(diào),提示蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解功能增強(qiáng)參與了ESCC進(jìn)展。因此,本研究進(jìn)一步分析了PSME2沉默后ESCC細(xì)胞增殖、遷移和自噬活性變化,發(fā)現(xiàn)了激活自噬的關(guān)鍵分子STAT3,探討了PSME2和STAT3雙重抑制的聯(lián)合致死作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

ESCC細(xì)胞系KYSE30和NE6-T細(xì)胞保存于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。RPMI 1640培養(yǎng)基(SH30027.01)購自Hyclone公司;胎牛血清(FBS, SA210407)購自Pricell公司;HiScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (R211-02)、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Q111-02)購自南京諾唯贊生物科技有限公司;TRIzol(15596026)購于Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購于Invigentech(IV08-1000)公司;GAPDH和PSME2引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;轉(zhuǎn)染試劑及相關(guān)siRNA購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;PSME2 (2409S)、LC3 (2741S)、p62 (88588S)、STAT3 (9139S)、p-STAT3 (9145S)、GAPDH (5174S)等抗體均購于CST公司;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(CW0014)購于康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;WP1066 (HY-15312)和LMT28 (HY-102084)購于MCE公司;ECL曝光液(SQ101)購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒(CYTODET-RO)購于MERCK公司;EdU (C0071S)、Calcein/PI (C2015M)細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 公共數(shù)據(jù)庫和組織樣本

ESCC轉(zhuǎn)錄物組數(shù)據(jù)和臨床信息來源后TCGA(the Cancer Genome Atlas, htttp://portal.gdc.cancer.gov)和GEO(Gene Expression Omnibus, htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)公共數(shù)據(jù)庫,分別有92例、179例ESCC。8對ESCC與匹配癌旁組織樣本來自河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除未接受放化療的ESCC患者,且術(shù)后病理診斷證實(shí)為ESCC。本項(xiàng)目已獲得河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染

ESCC細(xì)胞(KYSE30和NE6-T)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本文應(yīng)用siRNA陰性對照(siControl,siNC)與siPSME2轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行相應(yīng)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。siRNA不同靶點(diǎn)序列見Table 1。具體分組:siNC(陰性對照組),siPSME2(沉默PSME2組),WP1066(STAT3信號通路抑制組),siPSME2+WP1066(沉默PSME2聯(lián)合WP1066組),LMT28(IL-6抑制組),siPSME2+LMT28(沉默PSME2聯(lián)合LMT28組)。

Table 1 List of the sequences for siRNA targets

1.4 細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖檢測

CCK8實(shí)驗(yàn):將ESCC細(xì)胞以3 000細(xì)胞/孔接種于96孔板中,經(jīng)不同處理后在不同時間點(diǎn)加入10 μL/孔的CCK8試劑,37 ℃下避光孵育2 h,測量并記錄A450處吸光度。

EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):將ESCC細(xì)胞以5 000/孔接種于共聚焦皿中,經(jīng)不同處理后用10 μmol/L EdU標(biāo)記所培養(yǎng)的細(xì)胞2～4 h,4%甲醛固定細(xì)胞1 h用PBS沖洗3次,加入200 μL Click反應(yīng)混合液避光孵育30 min,使用PBS沖洗,最后加入DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色定位,共聚焦顯微鏡拍照,Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 RNA提取與RT-PCR

本文采取TRIzol法提取細(xì)胞與組織樣本RNA,按照HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit應(yīng)用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,AceQ qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行PCR,以GAPDH mRNA為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,采用2-ΔΔCt方法計算PSME2 mRNA相對表達(dá)量。引物序列見Table 2。

Table 2 List of primer sequences

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)

將不同處理組細(xì)胞以1 000個/孔接種于6孔板中,于37℃、5% CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)10～14 d,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,4%甲醛室溫固定1 h,結(jié)晶紫染液染色30 min后PBS洗去多余染料,晾干后進(jìn)行拍照。

1.7 Transwell侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)

制備106/mL的細(xì)胞懸液,水化Matrigel膠包被Transwell小室用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),上室加入無血清細(xì)胞懸液100 μL,下室加入300 μL含10%FBS1640培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2條件下持續(xù)培養(yǎng)36～48 h,4%甲醛室溫固定1 h,結(jié)晶紫染液染色30 min,PBS洗去多余染料,棉簽擦除內(nèi)層細(xì)胞后拍照,Image J定量分析。

1.8 蛋白質(zhì)提取與Western 印跡分析

細(xì)胞或組織中加入RIPA裂解緩沖液提取相關(guān)蛋白質(zhì),BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別孵育一抗(1∶1 000-1∶2 500)和相應(yīng)二抗(1∶5 000),以GPADH(1∶2 500)對目的蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,ECL顯示目的蛋白質(zhì)條帶。

1.9 細(xì)胞上清IL-6檢測

采用Human IL-6 ELISA檢測試劑盒檢測不同處理組細(xì)胞分泌上清中IL-6。樣本孔加入不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清和檢測抗體,室溫孵育2 h,洗滌后加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素,室溫孵育45 min,洗滌后加入底物顯色,適時加入終止液,A450測吸光度值。

1.10 乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測

采用細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測不同處理組細(xì)胞LDH(lactate dehydrogenase)含量。將細(xì)胞接種于96孔板中,接受不同處理后加入100 μL的反應(yīng)混合物,37 ℃下避光孵育1 h,測量A490吸光度。

1.11 活細(xì)胞/死細(xì)胞檢測

采用Beyotime Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒進(jìn)行檢測。將細(xì)胞接種于96孔板中,經(jīng)Calcein和PI對不同組細(xì)胞進(jìn)行染色30 min,共聚焦微鏡拍照,Image J軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)半定量分析。

1.12 RFP-GFP-LC3標(biāo)記細(xì)胞自噬流檢測

表達(dá)RFP-GFP-LC3雙熒光KYSE30細(xì)胞和NE6-T細(xì)胞置于共聚焦皿中,經(jīng)不同處理后加入4%甲醛室溫固定1 h,PBS洗滌3次后加入DAPI染色細(xì)胞核進(jìn)行定位,共聚焦顯微鏡拍照。

1.13 GSEA富集分析

GEO53625 ESCC數(shù)據(jù)庫中PSME2高、低表達(dá)組差異表達(dá)基因進(jìn)行GSEA(Gene Set Enrichment Analysis, http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)分析,鑒定差異表達(dá)基因富集的生物學(xué)功能,c2.cp.v7.2.symbols.gmt (Curated)為參考基因集,FDR (q-value) <0.25和P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS26.0和Graphpad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,Western 印跡、免疫熒光、PCR等結(jié)果差異分析采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,Kaplan-Meier繪制生存曲線,log-rank檢驗(yàn)確定不同組別生存曲線差異,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌中蛋白酶體激活物復(fù)合物亞基 2上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)

為確定蛋白酶體功能在ESCC中的作用,本文分析了TCGA(TCGA-ESCC)和GEO數(shù)據(jù)庫(GSE53625)的ESCC樣本中蛋白酶體活性調(diào)節(jié)分子的表達(dá)特征。在GSE53625數(shù)據(jù)庫中,PSME2、PSME3、PSME4在腫瘤組織表達(dá)量明顯高于癌旁組織(Fig.1A),并且PSME2和PSME4高表達(dá)ESCC患者預(yù)后較差(HR = 1.89, 95% CI, 1.28-2.79,P<0.05; HR = 1.75, 95% CI, 1.19-2.59,P<0.05),而在TCGA-ESCC數(shù)據(jù)庫中,PSME1和PSME2高表達(dá)組僅具有預(yù)后不良趨勢(HR = 1.88, 95% CI, 0.92-3.87,P= 0.0804; HR = 2.02, 95% CI, 0.98-4.17,P= 0.0524, Fig.1B)。因此,本研究進(jìn)一步用Western 印跡檢測了8例ESCC和癌旁組織中PSME2蛋白表達(dá),同時應(yīng)用Imag J以PSME2/GAPDH灰度比值進(jìn)行半定量分析,發(fā)現(xiàn)其中4對ESCC中PSME2蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織(Fig.1C)。上述結(jié)果提示,PSME2可能參與ESCC惡性演進(jìn)過程。

Fig.1 PSME2 upregulation is correlated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma (A) PSME1-4 mRNA expression in cancer and adjacent non-tumor tissues from the GSE53625 database. (B) Kaplan-Meier survival curves show the overall survival in high- and low- PSME1-4 group of patients with ESCC in GEO53625 and TCGA-ESCC datasets, respectively. (C) Western Blot shows PSME2 protein in 8 pairs of ESCC and matched adjacent non-tumor tissue samples, with KYSE30 as a control. N, Adjacent non-tumor, T, Tumor. Quantitative analysis shows PSME2/GAPDH gray values

2.2 蛋白酶體激活物復(fù)合物亞基 2沉默抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

本文應(yīng)用PSME2 siRNA轉(zhuǎn)染KYSE30細(xì)胞與NE6-T細(xì)胞,RT-PCR和Western 印跡結(jié)果表明,與siControl(siNC)轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比,PSME2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PSME2 mRNA和蛋白質(zhì)分子明顯降低(Fig.2A,2B)。CCK8、EdU和平板克隆結(jié)果表明,沉默PSME2表達(dá)后,KYSE30細(xì)胞與NE6-T細(xì)胞的增殖能力也明顯降低,其中EdU實(shí)驗(yàn)顯示,與siNC相比,PSME2 si#1和PSME2 si#3沉默后,KYSE30增殖率由36.6%分別下降至17.8%和20.1%,NE6-T由44.3%下降為22.3%和22.0%(Fig.2C-2E)。此外,Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PSME2沉默也顯著降低了KYSE30細(xì)胞與NE6-T細(xì)胞的遷移和侵襲能力(Fig.2F,2G)。與siNC相比,PSME2 si#1和PSME2 si#3處理的KYSE30遷移和侵襲能力分別下降為59.2%、72.6%和60.2%、76.2%;NE6-T中上述下降比例為44.1%、66.7%和41.3%、42.9%。上述結(jié)果表明,PSME2促進(jìn)了ESCC生長和轉(zhuǎn)移。

Fig.2 Silencing of PSME2 inhibits proliferation, migration, and invasion of ESCC cells (A) RT-PCR shows PSME2 mRNA expression in NE6-T and KYSE30 cells transfected with siNC or siPMSE2. (B) Western blot shows PSME2 protein expression in NE6-T and KYSE30 cells transfected with siNC or siPMSE2. (C) CCK8 assay shows the cell viability of different groups. (D) Immunofluorescent images and quantitative analysis of EdU assay (Scale bars, 50 μm). (E) Images and quantitative analysis of clone formation assay. (F &G) Representative images of cells showed the effects of PSME2 silencing by Transwell migration and invasion assays , respectively. The quantitative data are presented as means ± SD (n=3).***P <0.001,**P <0.01,*P < 0.05

2.3 蛋白酶體激活物復(fù)合物亞基 2沉默增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞自噬發(fā)生

鑒于PSME2沉默抑制了蛋白酶體對蛋白質(zhì)的激活與降解,本文進(jìn)一步檢測了PSME2沉默后自噬的變化,Western 印跡結(jié)果表明,LC3-II/LC3-I表達(dá)明顯升高,而p62蛋白表達(dá)則降低(Fig.3A)。應(yīng)用RFP-GFP-LC3標(biāo)記的KYSE30細(xì)胞與NE6-T細(xì)胞檢測自噬流變化,與siControl轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞相比,PSME2沉默組ESCC細(xì)胞中紅色斑點(diǎn)和綠色斑點(diǎn)均明顯升高,疊加后黃色斑點(diǎn)也明顯增加(Fig.3B &3C)。上述結(jié)果表明,PSME2沉默抑制了蛋白酶體功能,進(jìn)而代償性激活了自噬。

Fig.3 Silencing of PSME2 enhances autophagy in esophageal squamous cell carcinoma (A) Western blot shows the protein levels of PSME2, p62, LC3, and GAPDH. (B &C) The measurement of autophagic flux and autophagosome under the fluorescent microscopy, with yellow fluorescence indicating early autophagosomes, and red fluorescence indicating late autolysosomes. (Scale bars, 10 μm)

2.4 食管鱗癌中蛋白酶體激活物復(fù)合物亞基 2沉默激活I(lǐng)L-6/STAT3通路介導(dǎo)的自噬發(fā)生

對GSE53625中PSME2高表達(dá)和低表達(dá)的ESCC差異表達(dá)基因進(jìn)行GSEA富集分析表明,IL-6/STAT3、TGF β等信號通路在PSME2低表達(dá)組顯著富集,提示沉默PSME2與IL-6/STAT3信號通路激活相關(guān)(Fig.4A)。應(yīng)用Western 印記檢測PSME2沉默后(siPSME2#1)STAT3活性變化,發(fā)現(xiàn)PSME2表達(dá)沉默后,STAT3蛋白磷酸化明顯增加(Fig.4B)。此外,ELISA結(jié)果表明,PSME2沉默組對比siNC組KYSE30和NE6-T細(xì)胞上清中IL-6含量分別增加1.35、1.13倍和1.24、1.19倍(Fig.4C)。上述結(jié)果表明,PSME2沉默激活了IL-6/STAT3信號通路。

Fig.4 Silencing of PSME2 activates IL-6/STAT3 pathway-mediated autophagy in esophageal squamous cell carcinoma (A) GSEA analysis shows the enriched pathways of IL-6/STAT3 in PSME2-low subgroup. (B) Western blot shows the protein levels of PSME2, p-STAT3, STAT3, and GAPDH. (C) IL-6 levels were analyzed by ELISA assay. (D) Western blot shows the protein levels of p62, LC3I/II,PSME2, and p-STAT3. (E) Western blot shows the protein levels of PSME2, p62, and LC3-I/LC3-II. Quantitative data are presented as means ± SD (n=3).**P <0.01,*P <0.05

為進(jìn)一步探討IL-6/STAT3信號通路與自噬的相關(guān)性,分別應(yīng)用LMT28抑制IL-6活性或WP1066抑制STAT3活性,檢測LC3和p62蛋白質(zhì)表達(dá)變化。Western 印跡結(jié)果表明,與僅PSME2沉默的ESCC細(xì)胞相比,PSME2沉默聯(lián)用LMT28或WP1066,LC3-II/LC3-I表達(dá)明顯降低,而p62蛋白表達(dá)升高,同時伴隨p-STAT3表達(dá)顯著降低(Fig.4D,4E)。上述結(jié)果表明,ESCC中PSME2沉默通過激活I(lǐng)L-6/STAT3信號通路增強(qiáng)自噬。

2.5 聯(lián)合蛋白酶體激活物復(fù)合物亞基 2沉默和STAT3抑制誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞合成致死

KYSE30細(xì)胞和NE6-T細(xì)胞中沉默PSME2表達(dá),同時應(yīng)用WP1066抑制自噬,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合PSME2沉默和WP1066處理的細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH含量分別為siNC組3.84和2.27倍,但WP1066單獨(dú)處理組細(xì)胞上清中LDH變化不明顯,表明代償性自噬激活增加PSME2沉默的ESCC細(xì)胞存活能力(Fig.5A,5B)。應(yīng)用Calcein/PI染色不同處理組ESCC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PSME2沉默和WP1066聯(lián)合處理,KYSE30和NE6-T紅色死亡細(xì)胞比例分別為36.69%和32.55%,其中KYSE30細(xì)胞中PSME2沉默和WP1066單獨(dú)處理組死亡細(xì)胞分別比例為6.78%和18.34%、NE6-T細(xì)胞中則為6.74%和9.70%(Fig.5C)。上述結(jié)果表明,PSME2和STAT3雙重抑制誘導(dǎo)了ESCC細(xì)胞的合成致死。

Fig.5 Combination of PSME2 knockdown and STAT3 inhibition induces synergistic cell death in esophageal squamous cell carcinoma (A &B) LDH levels in ESCC cells with different treatments (A: KYSE30; B: NE6-T). (C) Fluorescent images and quantitative data of Calcein-AM/PI staining in different groups (green for live cells, red for dead cells; Scale bars: 10 μm). Quantitative data are presented as means±SD (n=3).***P <0.001 ,**P <0.01 ,*P < 0.05

3 討論

食管癌發(fā)病率和死亡率分別位居全球所有惡性腫瘤的第七位和第六位[9]。2020年全球約有54.4萬例食管癌死亡患者,其中約50%死亡患者來源于東亞和中亞,尤其是中國[7]。食管癌主要的組織學(xué)類型分為ESCC和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC),中國90%以上的食管癌屬于ESCC[9]。目前,手術(shù)、放療、放化療、免疫治療等多學(xué)科的綜合治療為食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案,但仍有較高的復(fù)發(fā)率[10],其5年總體生存率<25%[11]。肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的分子分型推動了分子靶向藥物的開發(fā)和個體化精準(zhǔn)治療,提高了腫瘤治療效果[12]。然而,ESCC仍缺乏特異的分子標(biāo)志物和治療的分子靶點(diǎn),嚴(yán)重制約著ESCC臨床治療療效和預(yù)后的改善。

蛋白酶體功能異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),例如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病和惡性腫瘤等[13]。具有調(diào)節(jié)蛋白酶體活性的PA28β蛋白由PSME2基因編碼,表達(dá)于肝、肺、結(jié)腸、脾等器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中,與PA28α形成異源七聚體,參與MHC I 類抗原提呈[5,14]。PSME2表達(dá)上調(diào)見于多種腫瘤,如胃癌、透明細(xì)胞腎癌、黑色素瘤、伯基特淋巴瘤和乳腺癌等[15-20],但在ESCC中PA28β蛋白表達(dá)降低[21],與本研究的結(jié)果不一致,具體的原因及機(jī)制目前尚不清楚,需進(jìn)一步的研究闡明。相對于正常細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞分裂和增殖加快,生物合成增加,代謝活性增高,因此,對蛋白酶體的干預(yù)更敏感[14]。硼替佐米(Bortezomib)是FDA批準(zhǔn)上市用于治療多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑,能夠通過降低ICAM-1(intercellular cell adhesion molecule-1)、VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)等黏附分子表達(dá),抑制骨髓瘤細(xì)胞與骨髓間質(zhì)細(xì)胞黏附與連接,并激活JNK和胱天蛋白酶,誘導(dǎo)原代骨髓瘤細(xì)胞和多種骨髓瘤細(xì)胞凋亡[6,23]。本文應(yīng)用GSE53625和TCGA公共數(shù)據(jù)庫中的ESCC數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)ESCC中PSME2 mRNA表達(dá)上調(diào),并與ESCC預(yù)后不良呈正相關(guān);Western 印跡結(jié)果也表明,ESCC樣本中PSME2蛋白表達(dá)升高,提示蛋白酶體活性增加是ESCC細(xì)胞增殖的前提條件,PSME2可能是ESCC臨床治療的潛在靶點(diǎn)分子。

為維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),蛋白酶體功能干擾能夠誘導(dǎo)自噬活性增加,抵抗蛋白酶體抑制所引起的細(xì)胞死亡[6,17]。腎癌細(xì)胞系786-O細(xì)胞和CAKI-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPSME2能夠降低轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲能力,但786-O細(xì)胞和CAKI-1細(xì)胞的增殖活性并無明顯變化,同時LC3-II/LC3-I蛋白質(zhì)表達(dá)增加、p62蛋白表達(dá)減少,表明PSME2敲降激活了自噬,以代償?shù)鞍酌阁w功能受阻時蛋白質(zhì)降解途徑[17]。蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理多發(fā)骨髓瘤細(xì)胞系,能夠抑制ERK和STAT3磷酸化,并誘導(dǎo)IL-6效應(yīng)分子gp130(glycoprotein 130)表達(dá)下調(diào);5 nmol/L和10 nmol/L硼替佐米分別誘導(dǎo)了26%和66%的RPMI8226細(xì)胞凋亡,與5 nmol/L Tubacin聯(lián)合應(yīng)用時,RPMI8226細(xì)胞的凋亡率分別增加至87%和91%,聯(lián)合指數(shù)CI為0.37,表明硼替佐米和Tubacin 2種藥物的強(qiáng)聯(lián)合作用[6]。

本研究表明,沉默PSME2降低了ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,但同時激活的IL-6/STAT3信號通路誘導(dǎo)了代償性自噬活性增強(qiáng);應(yīng)用WP1066抑制STAT3活性,不僅可以阻斷PSME2沉默伴隨的自噬,還能明顯增加ESCC細(xì)胞凋亡,表明PSME2和STAT3雙重抑制對ESCC細(xì)胞具有聯(lián)合致死性作用。

綜上所述,本研究表明,PSME2促進(jìn)了ESCC進(jìn)展,是ESCC預(yù)后不良的分子標(biāo)志物;沉默PSME2激活的IL-6/STAT3信號通路誘導(dǎo)了代償性自噬活性增強(qiáng),PMSE2和STAT3雙重抑制對ESCC細(xì)胞具有聯(lián)合致死性作用,有望為ESCC臨床治療的提供新策略。