黎先感, 楊 明, 魯 瑩, 李 玲, 馬 騫, 李 靜, 張連文*

(1)南開(kāi)大學(xué)藥學(xué)院, 天津分子藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300350, 天津;2)首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,DNA損傷應(yīng)答北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 100048, 北京)

O-GlcNAc修飾是一種動(dòng)態(tài)的翻譯后修飾,發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基上[1]。O-GlcNAc修飾由2種酶催化完成:OGT(O-GlcNAc transferase)將糖供體UDP-GlcNAc中的GlcNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基上[2];OGA(O-GlcNAcase)催化O-糖苷鍵水解,去除 GlcNAc 基團(tuán)[3]。O-GlcNA修飾現(xiàn)已被證明參與許多生理過(guò)程,包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)酶體降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4, 5]。它還通過(guò)穩(wěn)定新生多肽鏈參與蛋白質(zhì)折疊[6]。同時(shí),O-GlcNAc蛋白的失調(diào)與許多慢性疾病有關(guān),包括癌癥、糖尿病、心血管并發(fā)癥和阿爾茨海默病[7, 8]。

O-GlcNAc修飾的檢測(cè)具有重要意義。在過(guò)去的數(shù)十年間,已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種檢測(cè)方法,涵蓋β-消除-米氏加成法[9, 10]、化學(xué)/酶法[11-13]、代謝標(biāo)記法[14]、O-GlcNAc特異性抗體(如CTD110.6、RL2)和凝集素(s-WGA)[15-18],但它們均有各自的缺陷且在進(jìn)一步區(qū)分GlcNAc和N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)上仍然面臨挑戰(zhàn)[19]。

CpOGA來(lái)自產(chǎn)氣莢膜羧菌,是真核生物OGA的細(xì)菌同源物,同樣可以催化O-GlcNAc 糖蛋白去糖基化。盡管目前尚不清楚CpOGA是否是一種生理上的OGA,但它在體外對(duì)人類(lèi)細(xì)胞系裂解物中的O-GlcNAc蛋白顯示出顯著的O-GlcNAcase活性[20]。研究發(fā)現(xiàn),其突變體 CpOGAD298N喪失催化活性,保留了結(jié)合O-GlcNAc蛋白的能力,在O-GlcNAc蛋白的富集和檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[21, 22]。Song等人通過(guò)將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽與 CpOGAD298N融合表達(dá),發(fā)現(xiàn)GST- CpOGAD298N可以在短時(shí)間(0.5 h)內(nèi)結(jié)合膜上的O-GlcNAc蛋白,然后通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的抗GST的二抗進(jìn)行曝光顯影[23]。而且CpOGAD298N相較O-GlcNAc抗體或凝集素具有更全面的O-GlcNAc蛋白結(jié)合圖譜,并能區(qū)分GlcNAc和GalNAc的2種單糖修飾。但是,此方法與常規(guī)Western 印跡方法均存在耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題(～36 h)。

生物素-親和素系統(tǒng)是一種應(yīng)用多年的生物反應(yīng)放大系統(tǒng)[24, 25]。從鏈霉菌(streptomyces avidinii)培養(yǎng)物中提取的鏈霉親和素(streptavidin,SA),與親和素有相似的生物學(xué)特性,可以高度特異性地與D-生物素結(jié)合,解離常數(shù)處于10-14mol/L數(shù)量級(jí)[26-28]。相對(duì)于親和素,SA有接近中性的等電點(diǎn)且不含任何糖基,檢測(cè)靈敏度更好[29]。核心鏈霉親和素是SA的衍生物,這種鏈霉親和素仍可結(jié)合生物素分子,并且比全長(zhǎng)鏈霉親和素穩(wěn)定性更好,溶解度更高,凝聚更難[30]。后來(lái)有學(xué)者通過(guò)基因重組,表達(dá)獲得了118個(gè)氨基酸殘基的Stv13核心鏈霉親和素,Stv13具有與天然鏈霉親和素相似的生物活性和穩(wěn)定性,并且溶解性更高[31]。

本文構(gòu)建了pET28a-CpOGAD298N-Stv13重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)純化了CpOGAD298N-Stv13融合蛋白質(zhì),并應(yīng)用生物素-親和素結(jié)合特點(diǎn)建立了一種O-GlcNAc蛋白快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用pET28a質(zhì)粒、pMAL-c2x-sOGT質(zhì)粒、FR_HNF1A質(zhì)粒、HEK293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室留存[32-34];E.coliDH5α/E.coliBL21(DE3)菌株、ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒、高保真PCR預(yù)混液購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司;生物素購(gòu)于MCE公司;生物素修飾的辣根過(guò)氧化物酶(biotin-HRP)(A0308)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)于賽默飛世爾科技公司;RL2、c-Myc、β-肌動(dòng)蛋白(β-Actin)抗體購(gòu)于Abcam;二抗(Goat-anti-Rabbit、Goat-anti-Mouse)購(gòu)于天津三箭生物技術(shù)有限公司;T4連接酶購(gòu)于NEB;引物(Table 1)由北京擎科生物合成。

Table 1 Primers used for mutations

1.2 CpOGAD298N-Stv13融合蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 化學(xué)合成帶有編碼CpOGA的DNA序列 N末端及C末端分別帶有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn),通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ 雙酶切將其克隆到原核表達(dá)載體pET28a上,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-CpOGA。

1.2.2 pET28a-CpOGAD298N重組載體的構(gòu)建 以pET28a-CpOGA序列為模板,利用引物 pET28a-CpOGA-D298N(F/R)進(jìn)行PCR構(gòu)建pET28a-CpOGAD298N重組表達(dá)載體。

1.2.3 化學(xué)合成帶有編碼(G4S)4-Stv13的DNA序列 N末端及C末端分別帶有Hind Ⅲ、XhoⅠ 酶切位點(diǎn),通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ雙酶切,將其克隆到pET28a-CpOGAD298N上,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-CpOGAD298N-Stv13。

將pET28a-CpOGAD298N-Stv13重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中,抗性平板篩選轉(zhuǎn)化菌落,選取單克隆提取質(zhì)粒,質(zhì)粒通過(guò)測(cè)序和限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ 雙酶切鑒定,質(zhì)粒設(shè)計(jì)構(gòu)建見(jiàn)Fig.1。

Fig.1 Schematic diagram of the plasmid construction The pET28a vector and chemically synthesized DNA sequences encoding CpOGA and (G4S) 4-Stv13 were used. The pET28a-CpOGAD298N-Stv13 plasmid was constructed by the cloning method of T4 DNA ligase ligation after corresponding restriction endonuclease digestion and site-directed mutagenesis PCR

1.3 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET28a-CpOGA,pET28a- CpOGAD298N-Stv13,pMAL-c2x-sOGT(表達(dá)產(chǎn)物為MBP-sOGT)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliBL21(DE3)菌株中,涂板,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單克隆菌落至加有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜;第2 d將菌液按1∶50比例擴(kuò)大培養(yǎng),37 ℃,220 r/min,測(cè)A600=0.7～0.9時(shí),加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)24 h;收菌,保存在-80 ℃。

1.4 蛋白質(zhì)的純化

鎳離子親和層析純化His標(biāo)簽蛋白質(zhì):使用15 mL 含20 mmol/L咪唑的TBS溶液(pH=7.4)重懸菌體,冰水浴中超聲破碎16 min (開(kāi)2 s,停4 s);4 ℃,12 000 r/mim,離心30 min后取上清;通過(guò)含20 mM咪唑的TBS溶液平衡鎳離子親和柱,取上清液通過(guò)Ni-NTA親和柱結(jié)合,使用20 mmol/L咪唑溶液流過(guò)親和柱除雜質(zhì),再用含250 mmol/L咪唑的TBS溶液洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì),最后通過(guò)30 kD截流分子量的超濾管(MilliporeSigma)超濾濃縮蛋白質(zhì)。

淀粉樹(shù)脂親和層析純化MBP標(biāo)簽蛋白質(zhì):使用15 mL 1×TBS溶液重懸菌體,冰水浴中超聲破碎16 min(開(kāi)2 sec,停4 sec);4 ℃,12 000 r/min,離心30 min后取上清;上清過(guò)直鏈淀粉-瓊脂糖介質(zhì)后用1×TBS溶液洗雜質(zhì),10 mmol/L麥芽糖溶液洗脫蛋白質(zhì),通過(guò)30 kD截流分子量的超濾管(MilliporeSigma)超濾濃縮蛋白質(zhì)。

1.5 MBP-sOGT的去O-GlcNAc修飾

在PBS溶液中,將10 mg純化后的MBP-sOGT蛋白質(zhì)與2 mg CpOGA蛋白混合,室溫反應(yīng)1 h,獲得去O-GlcNAc修飾的MBP-sOGT,即MBP-sOGT-DG,通過(guò)淀粉樹(shù)脂親和層析柱純化MBP-sOGT-DG蛋白質(zhì)。

1.6 蛋白質(zhì)染色鑒定

所有蛋白質(zhì)樣本通過(guò)8 %的SDS-PAGE進(jìn)行分離,恒壓90 V,30 min后,恒壓90 V,100 min,電泳結(jié)束后通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色法顯示蛋白質(zhì)條帶。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚胎腎細(xì)胞 HEK293T使用含有10 %胎牛血清和1 %青鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)液,放置于37 ℃,5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待其達(dá)到80 % ～ 90 %的匯合度時(shí),以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。向細(xì)胞中加入終濃度為5 μmol/L的TMG溶液,增加細(xì)胞糖基化,24 h后收取細(xì)胞進(jìn)行裂解,BCA定量檢測(cè)。

1.8 HNF1A蛋白質(zhì)樣品制備

在人胚胎腎細(xì)胞HEK293T中過(guò)表達(dá)FR_HNF1A質(zhì)粒,48 h后收取細(xì)胞裂解,獲得細(xì)胞裂解液;提前取200 μL 蛋白A與2 μL Myc-Tag抗體于PBS溶液中結(jié)合,4 ℃,過(guò)夜;第2 d對(duì)蛋白A進(jìn)行洗滌,加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行IP,4 ℃,3 h后洗滌蛋白A,吸干上清,加入40 μL 1×上樣緩沖液(loading buffer)煮沸,離心后上清即為IP得到的HNF1A樣品。

1.9 O-GlcNAc修飾的檢測(cè)

O-GlcNAc修飾的檢測(cè)通過(guò)常規(guī)Western 印跡檢測(cè)或改進(jìn)型Far-WB實(shí)驗(yàn)完成。

Western 印跡:蛋白質(zhì)樣品制備后, 通過(guò)8 %SDS-PAGE膠進(jìn)行分離,電泳結(jié)束后將SDS-PAGE膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5 % BSA室溫封閉2 h,加入RL2(1∶1 000)作為一抗4 ℃孵育過(guò)夜,TBST緩沖液洗滌3次,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影曝光。

Far-WB實(shí)驗(yàn):經(jīng)上述轉(zhuǎn)膜后,用5 % BSA(含有20 μg/mL生物素)封閉2 h,TBST洗膜3×3 min;將1 mg CpOGAD298N- Stv13與5 μL生物素修飾的辣根過(guò)氧化物酶(biotin-HRP)混合,并用含5 % BSA的TBST稀釋到4 mL,4 ℃孵育PVDF膜1 h;TBST洗膜5×8 min,使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影曝光;實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原理見(jiàn)Fig.2。

Fig.2 Schematic diagram of the far-WB detection principle The fusion protein CpOGAD298N-Stv13 captures the O-GlcNAc protein on the membrane by CpOGAD298N. Then the biotin-avidin strong interaction makes Stv13 to stably bind to biotin-HRP, and then chemiluminescence can be used

2 結(jié)果

2.1 pET28a-CpOGAD298N -Stv13重組質(zhì)粒的鑒定

依據(jù)1.2方法構(gòu)建pET28a-CpOGAD298N-Stv13重組質(zhì)粒,質(zhì)粒圖譜見(jiàn)Fig.3A。構(gòu)建后的重組質(zhì)粒通過(guò)雙酶切(EcoRⅠ、XhoⅠ)方法進(jìn)行酶切鑒定,酶切預(yù)期分子量為2 196 bp和5 290 bp,大小均與預(yù)期相符,電泳結(jié)果見(jiàn)Fig.3B。

2.2 融合蛋白質(zhì)CpOGAD298N -Stv13的純化

將表達(dá)有 CpOGAD298N-Stv13融合蛋白質(zhì)的BL21(DE3)菌體進(jìn)行超聲破碎,離心所得上清通過(guò)鎳離子親和層析柱純化,離心后上清、沉淀、穿透及純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 分析。結(jié)果表明,CpOGAD298N-Stv13在E.coli BL21(DE3)菌株中可溶性表達(dá), 蛋白質(zhì)分子量約90 kD,與理論值(83 kD)一致(Fig.4A)。

Fig.4 Analysis of protein purification by SDS-PAGE (A) Purification of CpOGAD298N-Stv13; Lane 1, Induced cells; Lane 2, Centrifugal supernatant of induced cells after ultrasonication; Lane 3, Centrifugal precipitation of induced cells after ultrasonication; Lane 4, Flow-through solution of the Ni-NTA column after sampling; Lane 5, Ni-NTA column eluent after ultrafiltration concentration. (B) Purification of CpOGA; Lane 1,Induced cells;Lane 2, Centrifugal supernatant of induced cells after ultrasonication; Lane 3, Centrifugal precipitation of induced cells after ultrasonication; Lane 4, Ni-NTA column eluent after ultrafiltration concentration. (C) Purification of MBP-sOGT; Lane 1, Centrifugal supernatant of induced cells after ultrasonication; Lane 2, Centrifugal precipitation of induced cells after ultrasonication; Lane 3, Induced cells; Lane 4, Flow-through solution of the starch resin column after sampling; Lane 5, The starch resin column eluent after ultrafiltration concentration. (D) Purification of MBP-sOGT-DG; Lane 1, Centrifugal supernatant of induced cells after ultrasonication; Lane 2, Flow-through solution of the starch resin column after sampling; Lane 3, The starch resin column eluent after ultrafiltration concentration

2.3 底物蛋白質(zhì)的純化

本課題組前期研究結(jié)果表明,sOGT在E.coliBL21(DE3)表達(dá)時(shí)可發(fā)生自身O-GlcNAc修飾,且12位絲氨酸(Thr-12)是其主要修飾位點(diǎn)[32]。為了給sOGT蛋白,去O-GlcNAc修飾,本文表達(dá)純化了具有O-GlcNAcase活性的CpOGA蛋白,分子量為75 kD(Fig.4B)。同時(shí),為了方便去O-GlcNAc修飾的sOGT蛋白純化,選擇 pMAL-c2x-sOGT質(zhì)粒表達(dá)MBP-sOGT融合蛋白質(zhì)。將純化后的MBP-sOGT分成2份,1份含有O-GlcNAc修飾直接保留,另1份經(jīng)CpOGA去O-GlcNAc修飾后通過(guò)淀粉樹(shù)脂親和層析柱再次純化,得到MBP-sOGT-DG蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明:MBP-sOGT蛋白大部分以包涵體形式存在,可溶性表達(dá)較低,分子量為110 kD(Fig.4C,D)。

2.4 底物蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾檢測(cè)

應(yīng)用Western 印跡方法對(duì)相同劑量的MBP-sOGT和MBP-sOGT-DG蛋白質(zhì)進(jìn)行O-GlcNAc修飾檢測(cè),結(jié)果顯示,MBP-sOGT 具有糖基化修飾,MBP-sOGT-DG蛋白,未檢測(cè)出糖基化修飾(Fig.5A),表明CpOGA成功去除了MBP-sOGT 的O-GlcNAc修飾,MBP-sOGT和MBP-sOGT-DG可以作為O-GlcNAc修飾檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

Fig.5 Detection of O-GlcNAc proteins at the cellular level (A) Routine WB assay using the anti-O-GlcNAc antibody RL2. (B) The Far-WB assay using CpOGAD298N -Stv13. The total cellular protein was extracted from HEK293T cells. (C)Routine WB assay using the anti-O-GlcNAc antibody RL2, c-Myc and β-Actin. The Far-WB assay using CpOGAD298N -Stv13. HNF1A was extracted from HEK293T cells

2.5 通過(guò)Far-WB方法檢測(cè)蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾

以MBP-sOGT、MBP-sOGT-DG為對(duì)照,使用CpOGAD298N-Stv13對(duì)HEK293T細(xì)胞總蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí),為了研究本文條件下CpOGAD298N-Stv13檢測(cè)蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾與蛋白質(zhì)劑量的線(xiàn)性關(guān)系,在電泳上樣時(shí)加入不同劑量的HEK293T細(xì)胞裂解液上清蛋白質(zhì)。Far-WB結(jié)果顯示,CpOGAD298N-Stv13檢測(cè)對(duì)照底物蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾與RL2效果一致,證明了該Far-WB 方法的可靠性(Fig.5B)。同時(shí),不同劑量細(xì)胞總蛋白質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示:隨著劑量的升高所檢測(cè)出條帶灰度隨之升高(Fig.5B),40 μg總蛋白質(zhì)是比較適中的上樣量,結(jié)果條帶清晰,有較好的分辨率。

HNF1A(hepatocyte fuclear factor 1A)是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子,與肝的發(fā)育和維持密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),HNF1A蛋白可被O-GlcNAc修飾,且該修飾影響HNF1A轉(zhuǎn)錄活性[34]。本文使用常規(guī)Western 印跡方法和Far-WB方法對(duì)免疫沉淀后的HNF1A進(jìn)行了O-GlcNAc修飾檢測(cè),結(jié)果顯示,Far-WB結(jié)果與Western 印跡一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的可靠性(Fig.5C)。

3 討論

本文報(bào)道了一種O-GlcNAc蛋白快速檢測(cè)方法。該方法主要基于CpOGAD298N對(duì)O-GlcNAc蛋白的廣泛識(shí)別能力,并結(jié)合核心鏈霉親和素Stv13蛋白質(zhì)與生物素之間的特異性結(jié)合,將CpOGAD298N與Stv13進(jìn)行了融合表達(dá)。

為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性,本文基于sOGT蛋白自身O-GlcNAc修飾,制備了陽(yáng)性對(duì)照MBP-sOGT蛋白質(zhì)。通過(guò)活性CpOGA去除O-GlcNAc的功能,制備了去O-GlcNAc修飾的陰性對(duì)照MBP-sOGT-DG蛋白質(zhì),并通過(guò)常規(guī)Western 印跡方法對(duì)兩種對(duì)照的糖基化進(jìn)行了驗(yàn)證,證明了對(duì)照的可靠性。

進(jìn)而通過(guò)CpOGAD298N-Stv13融合蛋白質(zhì)和商業(yè)化biotin-HRP建立了Far-WB 檢測(cè)方法,并通過(guò)對(duì)照蛋白質(zhì)、HEK293T細(xì)胞總蛋白質(zhì)及HNF1A蛋白質(zhì)對(duì)新方法進(jìn)行了驗(yàn)證。本方法全部檢測(cè)過(guò)程可在5-7 h內(nèi)完成,優(yōu)于已知基于GST-CpOGAD298N的Far-WB方法。

綜上,我們對(duì)已有Far-WB檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化,報(bào)道了一種更為高效的蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾檢測(cè)工具。